基于TaqMan探针的实时荧光LAMP检测肉制品中鸭源性成分研究

本研究建立1种基于TaqMan探针的实时荧光环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）(TaqMan—LAMP)检测方法,用于肉制品中鸭源性成分的快速鉴别。以鸭线粒体cytb基因的保守序列设计特异性引物,优化并建立基于TaqMan探针的实时荧光LAMP检测方法,对该方法进行特异性、灵敏度试验;同时与《GB/T38164—2019常见畜禽动物源成分检测方法 实时荧光PCR法》作比较,对市售肉制品进行检测,验证本方法的准确性。所建立的TaqMan-LAMP检测方法特异性强,仅鸭肉基因组DNA呈现特异性扩增曲线,30 min内完成检测,灵敏度为0.001%(w/w),重复性好,批次内变异系数CV为1.99%,对47份肉制品进行检测,检测结果与国标法相比,相对敏感性、特异性和符合率均为100%。本研究建立的鸭源性成分TaqMan-LAMP检测方法检测快速、特异性强、灵敏度高、重复性好,适用于肉制品中鸭源性成分的快速检测。     

肉制品中羊源性成分PCR检测方法的建立及其应用

根据羊特异性线粒体DNA片段,设计合成一对引物,并以生、熟羊肉为材料,建立了肉制品中羊源性成分的PCR检测方法,并用于生、熟羊肉的鉴定。PCR扩增产物DNA片段大小为295 bp。用Sau3AⅠ限制性内切酶进行酶切鉴定,酶切产物为204 bp和91 bp。PCR产物和酶切产物的片段大小与预期目标相符,其检测灵敏度达到0.225 pg DNA。合成的羊源性DNA引物可以扩增出羊肉的目的 DNA片段,而对马、狗、驴、兔和猪等14种动物DNA无扩增效果。利用该法对83份羊肉制品进行鉴定,检出率为100%。结果表明,该法快速简便,且具有较高的特异性和敏感性,可用于市售牛肉制品中牛源性成分的鉴定。     

一种牛肉检测的荧光实时定量方法研究

[目的]开发一种用于牛源性成分检测的荧光实时定量检测方法。[方法]通过序列比对后,以牛源性线粒体DNA中cytb基因为模板,设计特异性的引物和探针,并以不同来源的DNA为模板,分析引物和探针的特异性。对牛源性DNA进行梯度稀释后,分析不同浓度下扩增曲线,分析检测方法的灵敏度。以牛源性DNA稀释液为模板,进行10个平行扩增试验,分析检测方法的精密度。[结果]该研究所用的引物和探针对牛源性DNA具有明显的扩增曲线,而对非牛源性(鸡、鸭、猪、人)DNA模板不进行扩增。灵敏度分析结果显示,该检测方法对浓度仅为24.4 pg/μL牛源性DNA模板仍进行阳性扩增。精密度分析显示,10个平行试验扩增曲线相似,Ct值的标准差(SD)仅为0.41,精密度(CV)也仅为1.6%。[结论]该研究开发的牛肉成分检测的荧光实时定量方法特异性高,仅对牛源性DNA发生扩增。同时该方法灵敏度也很好,检出限为24.4 pg/μL,精密度也很高,重复性良好,适用于市场上肉制品中牛源性成分的检测。     

基于TaqMan PCR鉴定猪源性成分的引物和探针研发

为了研发具有自主知识产权的猪源性成分检测的引物和探针,比对猪、牛、羊、马、鸡、鸭、兔、鹅等8种动物的线粒体基因组,筛选并设计猪特异性的引物和探针组合进行荧光定量PCR。研究结果表明,所研发的猪源性成分检测的引物和探针仅对猪相关DNA模板有典型扩增曲线,对其他动物来源的DNA模板无扩增,具有高度的猪源性特异性。灵敏度实验表明,利用此引物和探针的检测方法具有高度的灵敏度,可达1 pg级。肉制品中猪源性定量检测实验说明此方法具有较好的定量检测能力。此引物和探针组合适用于猪源性食品和农畜产品的检验检测。     

基于TaqMan实时荧光PCR检测肉制品中羊源性成分

随着动物源性产品(农产品、食品和饲料)中掺假造假事件不断增多以及动物来源性疾病的传播风险逐渐加大,作为保障食品安全和维护消费者权益的高效检测手段,动物源性成分的定性和定量检测技术已成为国内外的研究热点。本研究通过比对分析8种动物的线粒体全基因组序列筛选出羊源性成分特异性的引物和探针组合进行基于实时荧光PCR技术的羊源性成分鉴定。结果表明,所研发的羊源性成分检测的引物和探针具有高度的特异性,同时具有较好的灵敏度(可检测到1 pg的DNA)。羊肉制品中羊源性定量检测试验结果说明,此方法具有较好的定量检测能力。综上所述,以此引物和探针为基础的检测方法适用于羊源性食品和农畜产品的动物源性成分检测。     

肉制品中鸡源性成分重组酶介导等温扩增检测方法的建立及应用

为了快速准确检测出肉制品中的鸡源性成分,本研究基于鸡线粒体细胞色素B基因(CytB),设计特异性引物和exo探针,建立了实时荧光重组酶介导等温扩增(RAA)方法,进行特异性、灵敏性和稳定性分析,并通过检测市售肉制品对所建立RAA方法的准确性和适用性进行分析。结果表明,该方法可以快速实现对高山鸡肉、乌鸡肉、芦花鸡肉、白羽鸡肉和野鸡肉基因组DNA的特异性扩增,而对猪肉、牛肉、羊肉等的DNA均没有扩增,可稳定检出的鸡源性成分最低质量分数为0.1%。在9份标识有鸡肉成分的市售样品中,7份检出鸡源性成分,有2份样品的鸡源性成分检测结果为阴性。本研究建立的实时荧光RAA方法操作简单,反应迅速,特异性强,灵敏度高,为肉制品中鸡源性成分的检测提供了技术保障。     

房山区4种动物源性成分PCR检测试验

本研究利用牛、羊、猪、鸡线粒体mtDNA中保守序列16s rRNA,设计一对动物的通用引物,检测了含有动物源性成分的样品,同时设计了针对牛、羊、猪、鸡mtDNA中的保守序列,选择4对特异性引物,扩增得到目的片段大小分别为271 bp、274 bp、212 bp和266 bp。利用通用引物,优化了PCR反应体系及其反应条件,建立了从未知样品中快速获取动物源性成分检测的PCR方法;利用牛、羊、猪、鸡特异性引物,建立了PCR方法快速鉴定牛、羊、猪、鸡这4种动物源性成分的方法。     

同步检测动物源性成分的四重PCR的条件优化和检出限分析

为建立肉制品中牛、羊、猪、鸡动物源性成分的快速高效多重PCR检测方法,利用4对牛、羊、猪和鸡源特异性PCR引物(靶基因序列来源于线粒体基因组)对多重PCR反应条件进行优化,并确定该检测方法的检出限。结果表明:四重PCR方法最佳反应条件为牛、羊、猪、鸡源特异性引物浓度分别为0.16μmol∕L、0.40μmol∕L、0.16μmol∕L、0.16μmol∕L,退火温度58℃,退火时间45 s,循环次数40。在最佳反应条件下,所建立的牛、羊、猪和鸡4种动物源性成分四重PCR的g DNA检出限为25 pg。应用优化后的四重PCR方法对20份市售肉制品样本进行盲样检测,验证鉴别方法的准确性,结果与现行标准的检测结果一致,掺假率达45%。本试验为该4种动物源性成分的快速检测提供了技术支撑。     

鹅源性成分PCR检测方法的建立

[目的]建立一种检测鹅源性成分的PCR方法。[方法]以15种动物的DNA为模板,利用鹅的特异性引物进行PCR反应,PCR产物用1．4％的琼脂糖凝胶电泳检测并测序,检测引物的特异性和敏感性。[结果]通过PCR反应从鹅样品中扩增到了304bp的目的片段,其他物种火鸡、鸭、鸽鹑、鸵鸟、鸽子、鸡、马、牛、羊、猪、狗、驴、猫、鱼和空白对照则无目的片段,表明该引物的特异性良好。鹅组织PCR产物的核苷酸序列与GenBank中检索到的相应序列基本符合,相似性为98％;PCR检测方法的检测灵敏度为0．01％。[结论]该PCR检测方法特异性强、准确性好、灵敏度高、可重复性好,为明确食品与饲料的成分和来源,预防禽流感的传播提供了有效的分子生物学捡测方法.     

应用两种PCR方法检测饲料中牛、羊源性成分

对普通PCR和实时(realtime)PCR两种方法在饲料中牛、羊源性成分检测中的应用进行了比较。分别设计并合成相应的引物和探针,对饲料中的牛、羊源性成分进行检测。结果表明,用普通PCR最低可以从饲料中检出0.1%的牛、羊源性成分,realtime PCR最低可以从饲料中检出0.01%的牛、羊源性成分。