橡胶草种植前后土壤微生物细菌多样性研究(Ⅱ)——高级分析

[目的]研究橡胶草种植前后土壤微生物细菌的多样性。[方法]对大田种植橡胶草前后的土壤理化性质进行考察,并通过454测序技术对土壤微生物细菌多样的数据序列进行高级分析。[结果]橡胶草种植后土壤的全氮和全磷略高于种植前,有机质稍有下降。土壤细菌的OTU数在橡胶草种植前后相差不大。群落结构分析表明,橡胶草种植前后的细菌组成大致相同,但各物种所占比例有差异,大多数的细菌是不可培养的,其中与氮有关的菌属柱状区所占比例最大。PCA主成分分析表明橡胶草种植前后土壤微生物群落在细菌水平上相近,这个结果与群落分布柱状图相吻合。RDA分析表明,土壤pH值、有机质、土壤含水率、土壤全氮和全磷与细菌呈正相关,土壤容重与细菌呈负相关。[结论]试验测序数据表明,橡胶草种植前后的土壤微生物细菌在OUT水平上多样性丰富,在属的水平上群落结构组成相近,种植橡胶草后土壤理化性质发生了改变。     

袋料种植淮山药根际土壤细菌多样性的高通量测序分析

[目的]比较淮山药袋料种植方法与常规定向结薯种植方法的根际土壤微生物种群多样性,为利用微生物多样性指导淮山药袋料种植提供科学依据.[方法]采集常规淮山药定向结薯种植的根际土壤样品(记为CK3)和袋料种植的根际土壤样品(记为A3),对土壤样品中细菌的16S rDNA序列V4高变区进行PCR扩增,并对扩增产物进行高通量测序,分析土壤样品中细菌群落的多样性及其分布规律.[结果]CK3的pH为6.21,有机质含量为32.2 g/kg;A3的pH为5.98,有机质含量为30.0 g/kg.2种不同种植方法下淮山根际土壤样品中共检测出细菌41门100纲147目292科530属.淮山药根际土壤细菌在门水平上的主要优势类群有变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes);在纲水平上的主要优势类群有α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、放线菌纲(un-identified-Actinobacteria)和δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)等.在门和纲分类水平上,2种种植方法淮山药根际土壤样品中细菌的优势菌群相似,相对丰度差异不显著(P>0.05),CK3的细菌多样性高于A3.[结论]淮山药袋料种植方法可行,可在旱坡地和石山地等非耕地应用.     

外源添加木质素对农田土壤微生物的影响

[目的]研究木质素对土壤微生物的影响,为木质素后期的资源化利用提供一定的基础资料.[方法]采集农田土壤进行培养试验,设置空白对照和木质素处理组,培养结束后提取土壤DNA,结合定量PCR和高通量测序等技术,研究木质素对土壤微生物的影响,对微生物的群落组成及多样性进行分析.[结果]定量PCR结果表明,木质素的加入减少了细菌16S rRNA基因丰度,且显著降低了真菌18S rRNA基因丰度.高通量测序结果显示,Alpha多样性分析上,细菌的空白对照多样性指数均高于木质素处理,真菌则相反,但均未达显著水平;PCoA分析表明,木质素的加入对细菌和真菌群落均产生了显著影响,不同处理间的群落结构差异较大.在门水平上对微生物群落组成分析表明,木质素的加入显著提高了细菌中γ-变形菌、拟杆菌、厚壁菌的相对丰度,降低了酸杆菌、放线菌、δ-变形菌的相对丰度;真菌中明显增加了担子菌、被孢霉菌的相对丰度,而降低了子囊菌的相对丰度.[结论]木质素的加入对土壤中细菌、真菌的数量及群落结构均产生了一定影响.总体上,木质素不利于土壤微生物群落的生长繁殖和代谢.由于对木质素的利用能力不同,不同微生物呈现出了不同的效果.     

塔里木盆地一处柽柳林土壤细菌多样性分析

[目的]对塔里木盆地一处柽柳林土壤细菌多样性进行初步探索,为下一步对塔里木盆地其它地区柽柳林土壤微生物多样性分析及极端环境微生物的筛选奠定基础.[方法]采集塔里木盆地一处柽柳林土壤样品,采用纯培养方法进行细菌的分离纯化.提取各菌株基因组DNA,进行16S rRNA扩增、测序及系统进化树的绘制,分析其多样性.[结果]共分离得到21株菌,其中Firmicutes(厚壁菌门)11株,Actinobacteria (放线菌门)7株,Proteobacteria(变形菌门)和Bacteroidetes (拟杆菌门)各1株.革兰氏染色结果表明,3株菌为革兰氏阴性,其余为革兰氏阳性.Blast比对结果表明菌株CL4与标准菌株Pontibacter korlensis (DQ888330,普拉特链霉菌)的同源性为91;,可能为潜在的新种.[结论]塔里木盆地柽柳林土壤中存在较丰富的细菌资源,并可能存在微生物新物种,具有进一步研究开发的价值.     

一种适用于PCR的土壤微生物DNA的提取方法

[目的]对土壤微生物的DNA进行提取,以建立一种适用于PCR技术分析的土壤微生物DNA的快速提取方法。[方法]采用了2种不同的直接裂解法提取土壤微生物DNA,并用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增16SrDNA片段。[结果]2种方法提取的土壤微生物总DNA电泳结果显示没有差别,但是只有CTAB、溶菌酶、冻融裂解法提取的总DNA不需要纯化,在增加Mg^2＋用量的条件下,只需用第一轮非特异PCR产物作为模板即可扩增出16SrDNA片段。[结论]CTAB、溶菌酶、冻融裂解法提取土壤DNA,方法操作简单、快捷。同时适用于PCR分析。为土壤微生物群落结构的多样性分析奠定了基础。     

不同品种桑树根际土壤细菌多样性的 高通量测序分析

[目的]探究不同品种桑树根际土壤细菌群落结构及其分布规律,为促进桑树的生长发育、提高其经济利用价值和培育更高品质的桑树品种提供参考.[方法]对3个品种桑树(粤椹大10、嘉陵30号和红果1号)根际土壤细菌的16S rDNA序列V3~V5高变区进行PCR扩增,并对PCR扩增产物进行高通量测序,分析土壤中细菌群落多样性及分布规律.[结果]3个土壤样品中共检测出细菌26门76纲88目149科370属.不同品种桑树根际土壤样品中的细菌群落组成和结构存在一定差异,丰富度方面表现为嘉陵30号>粤椹大10>红果1号;多样性方面表现为红果1号>嘉陵30号>粤椹大10.3个品种桑树的根际土壤细菌在门纲目科属水平上的优势菌群及所占比例分别为变形菌门(Proteobacteria,37.2%)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria,24.3%)、拟杆菌目(Bacteroidales,24.3%)、拟杆菌科(Bacteroidaceae,14.2%)、拟杆菌属(Bacteroides,14.2%);随着分类的细化,不同桑树品种对土壤细菌群落组成和分布的影响越大.[结论]变形菌门在3种桑树根际土壤中均是最优势细菌类群,嘉陵30号桑树品种根际土壤细菌种类最多,红果1号桑树品种土壤细菌分布最均匀.根际土壤细菌群落种类和均匀度可作为桑树差异规模化种植的指标.     

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为了解施用不同绿肥烟田土壤细菌群落的物种多样性,从湖南省湘西州烟区采集4块烟田(不施绿肥,单施黑麦草绿肥,豌豆绿肥,油菜绿肥)的土壤样本,提取土壤总DNA,PCR扩增其16S rRNA的V4高变区,阳性样品测序,序列比对鉴定,并利用生物信息学软件分析测序数据.结果表明:1)施用绿肥对土壤细菌群落结构和组成具有显著影响.在细菌域有4个主要的细菌种群,占所有有效序列的55.79％～65.39％,分别为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi),4个细菌种群相对丰度在各组均具有显著差异.2)经绿肥处理后的烟田土壤细菌群落多样性高于未施用绿肥的对照组.香农多样性指数和群落均一度指数对照组(6.637,0.833)和油菜组(6.658,0.833)均低于黑麦草组(6.923,0.854)和豌豆组(6.992,0.861),且差异均达显著水平.3)施用绿肥尤其是黑麦草绿肥的烟田中,烟草青枯病的发病率下降与土壤细菌群落多样性增加有关.     

不同绿肥对湘西烟田土壤细菌群落结构与多样性的影响

为了解施用不同绿肥烟田土壤细菌群落的物种多样性,从湖南省湘西州烟区采集4块烟田(不施绿肥,单施黑麦草绿肥,豌豆绿肥,油菜绿肥)的土壤样本,提取土壤总DNA,PCR扩增其16SrRNA的V4高变区,阳性样品测序,序列比对鉴定,并利用生物信息学软件分析测序数据。结果表明:1)施用绿肥对土壤细菌群落结构和组成具有显著影响。在细菌域有4个主要的细菌种群,占所有有效序列的55.79%~65.39%,分别为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi),4个细菌种群相对丰度在各组均具有显著差异。2)经绿肥处理后的烟田土壤细菌群落多样性高于未施用绿肥的对照组。香农多样性指数和群落均一度指数对照组(6.637,0.833)和油菜组(6.658,0.833)均低于黑麦草组(6.923,0.854)和豌豆组(6.992,0.861),且差异均达显著水平。3)施用绿肥尤其是黑麦草绿肥的烟田中,烟草青枯病的发病率下降与土壤细菌群落多样性增加有关。     

应用PCR—DGGE技术研究四角蛤蜊的细菌多样性

应用PCR—DGGE技术对盘锦某滩涂四角蛤蜊Mactra venerformis体内的细菌多样性进行了分析。使用SDS裂解法提取样品的总DNA,采用大多数细菌通用引物F338GC／RS18从总DNA中成功扩增出16SrDNA片段,然后对PCR产物进行DGGE分析,并将DGGE图谱上部分条带回收、再扩增、克隆和测序：将所测序列在GenBank核酸数据库中进行检索,用BLASTN分析DNA序列获得相似性最近的细菌。DGGE图谱显示,四角蛤蜊体内的细菌种类比较丰富,且不同时间样品细菌的优势菌群结构有一定的差异。将所测条带序列进行比对,结果表明,细菌种群中包括支原体属Mycoplasma、假单胞菌属Pseudomonas、弧菌属Vibrio、红球菌属Rhodococcus和鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas及不可培养的细菌。     

用于分子生态学研究的鹅盲肠微生物总DNA提取方法

采用8种方法提取了鹅盲肠微生物总DNA,通过PCR扩增细菌16S rDNA片段的V3区,并对8种DNA提取方法的可行性进行后续分子操作检验。结果表明,方法3提取的鹅盲肠微生物总DNA较好,8种方法通过PCR扩增均能获得较亮的扩增产物,并能通过PCR-SSCP对盲肠微生物多样性进行分析。     

PCR-DGGE技术分析生物膜工艺微生物群落多样性

为了揭示生物膜法工艺处理模拟生活废水过程总细菌群落结构的多样性,分别取系统启动初期和运行后期瓷板滑面、瓷板粗面、白胶板和黑实验台板上的附着生物膜,通过细胞裂解直接提取基因组DNA,以细菌通用引物进行16S rRNA基因V3区域PCR扩增,将PCR产物进行变性梯度凝胶电泳,获得微生物群落的DNA特征指纹图谱.结果表明,不同区段微生物群落间相似度最高达78.3％,最低达41.4％,不同生物膜样品既存在共同的微生物种属也存在特异微生物种属.但系统启动初期运行后期的生物膜群落结构较稳定,演替不明显.另外,对该生物膜群落的部分优势细菌进行了克隆测序和系统发育树分析,通过鉴定获得5条细菌16S rDNA序列,它们分别与梭状芽孢杆菌属、梭菌属和单胞菌属的同源性在97％以上,这些优势微生物在生物膜工艺去除有机物的过程中起重要作用.     

玉米农田土壤细菌群落变化的DGGE分析

利用改进的土壤DNA提取方法直接从玉米农田土壤样品中提取微生物全基因组,以嵌套式PCR和降落式PCR扩增出细菌16S rDNAV3区基因,并运用DGGE电泳技术对扩增片段进行分离,对玉米生长过程中4个重要生育期及不同土层深度细菌群落的变化进行了分析。结果表明,改进的提取方法能够获得完整且含量较高的基因组DNA,嵌套式PCR有效扩增了16SrDNAV3基因。随着玉米的生长以及土层深度的改变,土壤中的细菌在保持优势种群基本稳定的同时表现出丰富的多样性。其中,在苗期和灌浆期细菌群落的变化最为明显,细菌种类最丰富,而收获期细菌种类最少。同一生育期不同土层深度的细菌也存较大差异,表层土壤的细菌变化最大。     

羊粪低温沼气发酵细菌群落多样性分析

[目的]研究不同处理羊粪低温沼气发酵液的细菌群落多样性,为羊粪低温沼气发酵菌剂制备提供理论依据.[方法]对不同处理羊粪沼液总DNA进行16S rDNA V3区PCR扩增,扩增产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)分离、回收、测序,BLAST软件比对分析,构建发育树;同时利用Biolog-ECO法对沼液样本进行微生物功能多样性分析.[结果]PCR-DGGE方法结果显示,在低温条件下(15℃),在发酵各阶段均存在共有优势菌群,包括梭菌属(Clostridium sp.)、拟杆菌属(Bacteroidales bacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、Proteiniphilum sp.等,其中菌剂Ⅲ处理的4号为最优发酵试验组,主要为梭菌属(Clostridium sp.)表现有较高的丰度;Biolog-ECO法分析结果显示,在15℃培养条件下,产气高峰期处理2、3和4中,碳代谢活性相对较高,产气量也比对照组高.通过微生物群落的多样性分析发现,处理2的均匀性指数均高于其它处理组.处理3和4的微生物群落的丰富度、优势度指数相对较高.[结论]在低温条件下(15℃)的不同处理中,添加配伍Ⅲ(配伍Ⅰ+2 9 ZHC固体菌剂)发酵效果最优.     

猕猴桃林下套种大豆土壤微生物群落结构分析

【目的】揭示套种大豆对猕猴桃林下微生物群落组成结构的影响,分析猕猴挑林下种植大豆土壤微生物群落结构和未种植大豆的猕猴桃林下土壤微生物群落结构变化,为研究猕猴桃种植土壤微生态改良和绿色种植以及提高偏远山区土地单位面积经济效益提供理论依据和技术支持。【方法】通过高通量测序检测猕猴桃林下不同土壤样品中微生物群落丰度,分析猕猴桃林下土壤样品与套种大豆的土壤样品中微生物群落丰度与结构组成的差异性,探究猕猴桃林下套种大豆对土壤微生物群落结构和多样性的影响。采集种植大豆和未种植大豆的猕猴桃林下土壤样品进行预处理、DNA 提取和 PCR 扩增,再基于 Illumina MiSeq 高通量测序方法对扩增产物进行检测、纯化和定量,建库测序,数据分析,了解不同样本土壤微生物群落分类结构、丰富度和多样性,确定优势菌群。【结果】通过Tags 丰度和 OTU 的质控与统计的结果显示,种植大豆的土壤（EK）扩增微生物群落丰富度和多样性高于未种植大豆土壤（CK）;多样性分析显示,EK 和 CK 的微生物群落构成差异明显;微生物群落结构分析表明,EK 和 CK 在科、属、种水平上占据的比例平均值分别为 27.06% 和 28.11%、32.66% 和 29.33%、0.46% 和 0.37%,EK 土壤微生物群落在属、种水平上均高于 CK;6 个土壤样品共得到 651 883 条有效序列,经聚类后 EK 与 CK 分别获得 4 740 个和 4 551 个 OTU;LEfSe 分析结果显示,CK 有 19 个优势菌群,而 EK 有 41 个优势菌群,其中变形菌门（Proteobacteria）为 EK 的优势门,根瘤菌科剑菌属（Ensifer）的剑菌（Ensifer adhaerens）为 EK 的优势菌。【结论】猕猴桃套种大豆改变了土壤微生物群落结构,增加了土壤微生物群落丰富度和多样性以及土壤优势菌群数和有益菌群。综上,猕猴桃林下套种大豆对改善土壤的有效成分和提高土壤肥力有重要促进作用。     

利用DGGE指纹图谱技术考察不同营养条件下土壤微生物群落结构的变化

利用现代分子生物学技术,结合经典方法,克服传统的分离培养缺陷,探讨在不同营养条件下土壤微生物群落的基因多样性。经过直接从土壤中抽提总DNA,并对总DNA中16S rDNA及其中V6~V8可变区序列作PCR扩增、变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析等,发现不同处理条件下的土壤微生物的基因多样性变化与土壤微生物量的波动并不一致,说明微生物群落多样性与微生物量的关系并非线形。同时发现秸秆的添加更有利于土壤微生物群落的稳定。     

白芨内生细菌组成及多样性分析

[目的]调查白芨内生细菌种类及多样性,为更好地保护和开发利用白芨资源提供科学依据.[方法]应用Illumina MiSeq高通量测序技术测定白芨内生细菌的16S rDNA-V4变异区序列,应用Qiime和Mothur等软件整理和统计样品序列数目和操作分类单元(OTUs)数量,分析物种丰度及分布的差异.[结果]获得用于分析的有效序列和OTU数为49550/48;稀释曲线表明测序深度充分,OTU的数量接近于饱和.白芨内生细菌主要分布于鞘脂单胞菌属(Sph ingomonas,3226%)、地杆菌属(Pecobacter,16.13%)、盐单胞菌属(Halomonas,16.13%)、土壤杆菌属(Agrobacterium,12.90%)、Kaistobactc届(6.45%)、希瓦氏菌属(Shcwanclla,6.45%)、假单胞菌属(Pseudomonas,6.45%)和短波单胞菌属(Brevundimonas,3.23%)8个属.[结论]鞘脂单胞菌属、地杆菌属、盐单胞菌属和土壤杆菌属是白芨内生细菌的优势种群.Illumina MiSeq高通量测序技术能准确反映植物内生微生物的种类组成和真实比例,在植物内生微生物研究中具有明显的优势和可行性.     

温泉土壤宏基因组文库构建及普鲁兰酶筛选

[目的]构建温泉土壤宏基因组文库并进行普鲁兰酶活性筛选,以期获得高活力、耐高温的新型普鲁兰酶基因.[方法]采用间接法提取温泉土壤样品中宏基因组DNA,经Sephadex G200（含2％ PVPP）凝胶柱和电洗脱两步纯化后,扩增16S rRNA序列,通过序列比对和系统发育进化树分析温泉土壤微生物的多样性;然后以pCC1FOS为载体构建温泉土壤宏基因组文库,并对所获得的宏基因组文库进行活性筛选.[结果]利用宏基因组技术提取温泉土壤样品中微生物的基因组DNA,构建了一个约含1 146个克隆的温泉土壤16S rRNA文库,经遗传进化分析,发现温泉土壤样品中的大部分微生物未被研究过,主要来源于厚壁菌门（Firmicutes）,其次为恐球菌—栖热菌门（Deinococcus-Thermus）和变形杆菌门（Proteobacteria）.用提取获得的宏基因组DNA成功构建了温泉土壤微生物宏基因组Fosmid文库,文库约含2.7万个克隆,平均插入片段长度为40.0 kb,文库外源DNA总容量为1.2×10^9bp;通过活性筛选共获得9个可表达普鲁兰酶活性的克隆.[结论]宏基因组文库技术是获取极端环境微生物新酶的有效手段,可为进一步挖掘普鲁兰酶的应用潜力及研究其耐热机理奠定基础.     

应用DGGE技术分析自然免耕土与普通耕作土细菌群落的多样性

为探明免耕土壤与普通耕作土壤环境中细菌群落的多样性,获取相关优势菌落信息,该研究利用宏基因组学方法获得免耕土和普通耕作土样品总DNA,利用PCR获得16SrDNAV3片段,并进行变性梯度凝胶电泳(Denaturation gradient gel electrophoresis),通过微生物种群丰富度比较两样品中群落的丰富性,同时选取相关DNA条带进行克隆、测序和生物信息学分析.结果显示:免耕土壤中细菌群落多样性更加丰富;两类型土壤样品间细菌群落组成具有显著差异,证明耕作制度影响了土壤细菌群落结构.BLAST分析与系统发生分析结果表明,免耕土壤中特异存在的细菌群落与具有生物固氮、降解甲苯和倍硫磷等特性的细菌序列相似性较高或进化关系较近,推测其在免耕土壤肥力、有毒物质降解及有机质转变等过程中起作用.     

4种不同土壤微生物DNA提取方法对DGGE分析微生物群落的影响

分别应用高盐法、玻璃珠破碎法、冻融法和试剂盒法4种不同土壤微生物DNA提取方法提取水稻稻田土壤微生物DNA,并通过细菌16SrRNA V3区通用引物GC338f-530R和真菌18SrRNA特异性引物NS1-GCFung进行PCR扩增结合变性梯度凝胶电泳(CGGE)分析,对4种DNA提取方法进行评价。结果表明,玻璃珠破碎法和试剂盒法提取的DNA均能满足土壤微生物多样性分析的要求;其中试剂盒方法操作简单,提取的DNA质量较高,但DNA产量较低且成本昂贵;玻璃珠破碎法用时较长,步骤繁琐,DNA产量较高,纯度较低,但对后续PCR扩增和DGGE分析没有明显影响,且成本低廉。     

沼气池微生物生态群落PCR-DGGE分析方法研究

研究了适合于PCR-DGGE分析的沼气池污泥样品微生物基因组DNA快速提取方法,探讨了PCR反应条件、电泳时间与上样量对DGGE指纹图谱多样性的影响。试验结果表明,采用本研究所建立的SDS和Guanidine thio-cyanate-N-LS方法提取沼渣微生物总DNA,利用细菌特异性16S rDNA通用引物,经复原条件PCR(循环25次)扩增,所得PCR产物在85V电压下,上样量600ng,电泳时间为16 h时DGGE分离效果最佳,获得清晰的16S rDNA V3区片段的图谱。