影响根癌农杆菌EHA105感受态细胞转化效率因素的研究

通过对EHA105菌株48h不间断培养观察,绘制出其生长曲线图;同时用不同浓度的CaCl2溶液分别制备根癌农杆菌EHA105的感受态细胞,在转化过程中用不同的温度进行热激处理,统计分析阳性转化子个数,明确了采用冻融法将外源DNA导入农杆菌EHA105时的几个影响因素的参数。结果表明,当0D。值在1．0—1．5之间时,根癌农杆菌EHA105正处在对数生长期,活力最强;制备感受态细胞时,CaCl2溶液的浓度在6～10mmol·L-1之间,无显著差异,但以10mmol·L-1效果最佳,转化率达5．322×10^6·μg-1热激处理温度在20～37℃之间均无显著差异,但37℃处理时转化率最高,达5．550×10^6·μg-1。     

农杆菌介导玉米遗传转化影响因子的研究

利用农杆菌介导玉米愈伤组织遗传转化,研究了不同影响因子对玉米遗传转化效率的影响。结果表明,相比自交系H99,玉米杂交组合H99×A188更适宜作为玉米遗传转化的受体材料;继代6d后的胚性愈伤组织最适宜农杆菌转化;农杆菌菌株EHA105的侵染效果好于EHA101;抗性愈伤组织筛选培养基中除草剂筛选的临界质量浓度为4.0mg/L;头孢霉素质量浓度在500mg/L时适合进行除菌处理,且对植株再生影响较小。     

农杆菌介导小麦遗传转化的影响因素

[目的]对农杆菌菌株、小麦品种、培养基状态及报告基因选择等进行优化筛选,为进一步完善农杆菌介导小麦遗传转化方法提供参考。[方法]用携带质粒pCAMBIA1304的农杆菌菌株LBA4404、EHA105,对温麦19、郑离03和郑离06小麦的幼胚愈伤组织进行遗传转化,从农杆菌菌株、小麦品种、共培养基状态及报告基因选择等方面进行探讨。[结果]农杆菌菌株EHA105转化效率较高,最高达到22.58%;姊妹系郑离03与郑离06的转化率差别极大,郑离06转化率最高而郑离03最低;农杆菌与愈伤组织共培养时,使用MS半固体培养基的转化率高于MS固体培养基;GFP和GUS都可以用作判断转化率的报告基因,GFP优势更明显。[结论]高毒性农杆菌菌株EHA105转化效率明显高于菌株LBA4404;小麦基因型是影响转化效率的重要因素之一;农杆菌与愈伤组织共培养时使用半固体培养基可提高转化率;通过GFP瞬时表达,可有效进行小麦转化效率的研究。     

农杆菌注射法转化草莓果实细胞的研究

利用农杆菌注射法对草莓果实细胞进行了转化研究.以草莓(Fragarua×ananassa)品种丰香和红脸颊为试材,研究了农杆菌菌株的种类及其浓度、不同注射部位、果实发育时期和草莓基因型对转化效率的影响.结果表明:选用菌液OD600值为2.4的EHA105菌株,取花后19d大小的果实,从果蒂部位进行注射时转化效果最好,GUS染色率可达95%.本研究初步建立了能使外源基因在草莓果实细胞中高效表达的注射法转化体系,是草莓果实发育特性相关基因功能鉴定的可行方法.     

农杆菌侵染条件对玉米单倍体遗传转化的影响

以玉米诱导系HHI69诱导玉米自交系获得的单倍体愈伤组织为受体材料,GUS基因为报告基因,采用农杆菌介导法进行遗传转化,对影响转化效率的侵染条件进行了研究。结果表明:继代8 d后的愈伤组织最适宜农杆菌转化;农杆菌菌株EHA105的侵染力好于LBA4404;侵染液浓度OD_(600)为0.7、侵染时间为30 min时,GUS瞬时表达率最高,达到了65.31%。     

枯草芽孢杆菌菌株ZT4-2电击转化体系的建立

[目的]建立枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株ZT4-2的高效电击转化体系.[方法]带有荧光蛋白标记的穿梭质粒pGFP78,通过电击转化法将其转入枯草芽孢杆菌菌株ZT4-2.[结果]菌株培养阶段、感受态细胞浓度、感受态细胞量、质粒体积量、转化电压等条件的不同,会对电击转化效率造成影响.其中试验条件:制备感受态细胞的菌株培养阶段的OD600nm值=1.0,重悬菌体时每100 mL起始菌液加入600 μL的40％PEG6000;电击转化体系中,感受态细胞量200 μL,质粒体积10 μL,转化电压2.5 kV.最高转化效率可达6 823.67 CFU/μg.[结论]建立了枯草芽孢杆菌菌株ZT4-2的电击转化体系,电击转化效率较高.     

农杆菌介导的小麦生殖器官的整体转化

农杆菌介导的植物整体转化技术是近几年新发展起来的转化方法。这种方法以植物生长点,特别是生殖器官的生长点作为外源基因导入的目标器官。由于避免了由单一转化细胞通过组织培养获得再生植株的过程,这种方法避免了基因型时植株再生和转化的限制,有望发展成为不受基因型限制的广泛适用的新型植物转化方法。此方法已在拟南芥上上获得很大的成功。本实验以不同发育时期的小麦为材料,通过农杆菌介导,或结合基因枪轰击,将外源基因导入到小麦生殖生长时期的生长点中,获得GUS(β-半乳糖醛酸酶)报告基因的瞬时表达。具体实验结果如下：①在供试的两个农杆菌菌株EHA105和LBA4404中,只有EHA105能够有效地侵染小麦生长点细胞,获得GUS报告基因的瞬时表达;②农杆菌只有经过乙酰丁香酮处理后,才能有效地侵染小麦生长点;③农杆菌的有效侵染与植物材料的伤害无关,转化效率与植株的大小成正比。     

生菜瞬时转化条件优化

利用真空渗透法将改造过的包含绿色荧光蛋白(GFP)基因的pRHVnGFP载体转入生菜组织中，研究生菜的瞬时转化体系。通过对比不同的农杆菌菌株EHA105、LBA4404和GV3103,在相同条件下的转化效率，以及相同的农杆菌菌株在不同的侵染条件下的转化效率，最终确定以农杆菌LBA4404侵染生菜，菌液浓度OD₆₀₀为0.5,不添加乙酰丁香酮，抽真空并保持压力状态60 s(重复3次),作为侵染条件，可以获得最高的转化效率。     

银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体的构建（摘要）

[目的]构建银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体。[方法]以银杏为材料,采用DNA重组技术克隆GGPPS基因质体转运肽（TP）序列,并将其与高效植物表达载体p1304＋连接形成融合表达载体（p1304＋-TP）;冻融法转化根瘤农杆菌EHA105,构建工程菌（EHA105-p1304＋-TP）。[结果]成功构建了银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体及农杆菌工程菌。[结论]为进一步研究TP转运肽的亚细胞定位奠定基础,有助于阐明银杏内酯前体生物合成关键步骤的分子机理,同时为银杏内酯的代谢工程研究提供重要依据。     

农杆菌介导法将bFGF基因转入木立芦荟的初步研究

利用农杆菌介导法将bFGF基因导入木立芦荟中,通过对农杆菌介导芦荟遗传转化影响因素的分析,建立了优化的芦荟转化体系.用继代培养获得的粗壮的芦荟单株茎段作为转化外植体,以OD=0.55～0.68的EHA105农杆菌工程菌液侵染25min,在MS+蔗糖10g/L+100～mol/L乙酰丁香酮的共体培养基上培养3d,在MS+...     

脆壁克鲁维酵母基因置换技术的建立

以中性乳糖酶生产菌脆壁克鲁维酵母为材料,构建以kan基因为筛选标记、以脆壁克鲁维酵母乳糖酶基因上游调控区为同源臂的质粒pPkan。将质粒pPkan电击转化脆壁克鲁维酵母,对受体菌生长时期、电场强度、电击后培养时间等条件进行优化。结果表明,以OD600为0.8的脆壁克鲁维酵母为受体、电压1.5 kV、电场强度为7.5 kV.cm-1、电击后培养时间为90 min,可获得较高的转化率,最高转化效率为2.37×102转化子.μgDNA。在电击转化的同时加入限制性内切酶10μL,对电击转化的转化率无显著影响。经PCR筛选证实87.5%的转化子为同源重组,从而建立一套有效的脆壁克鲁维酵母基因置换技术。     

转SrPCS2烟草的获得及Cd抗性评价

由已克隆得到的长喙田菁(Sesbania rostrata)植物螯合肽合成酶SrPCS2编码177个氨基酸,以pHAN-NIBAL及pART27为基础,构建了CaMV35S启动子驱动的SrPCS2基因植物表达载体pAM23,采用电击转化方法将pAM23导入根癌农杆菌EHA105,并用该菌株对烟草进行了转化,Northern-blot分析结果表明得到了转录该基因的烟草,但转录该基因的烟草没有提高对Cd的抗性。     

银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体的构建

[目的]构建银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体。[方法]以银杏为材料,采用DNA重组技术克隆GGPPS基因质体转运肽（TP）序列,并将其与高效植物表达载体p1304＋连接形成融合表达载体（p1304＋-TP）;冻融法转化根瘤农杆菌EHA105,构建工程菌（EHA105-p1304＋-TP）。[结果]成功构建了银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体及农杆菌工程菌。[结论]为进一步研究TP转运肽的亚细胞定位奠定基础,有助于阐明银杏内酯前体生物合成关键步骤的分子机理,同时为银杏内酯的代谢工程研究提供重要依据。     

农杆菌介导番茄“美粉一号”遗传转化体系优化研究（英文）

[目的]研究农杆菌介导番茄＂美粉1号＂遗传转化体系的优化。[方法]以番茄美粉1号无菌苗的子叶为外植体,通过农杆菌介导法对其遗传转化效率进行了优化,建立高效番茄子叶农杆菌介导的遗传转化体系。[结果]外植体在MS＋2mg/L6-BA＋0.5mg/LIAA进行2d的预培养后,用农杆菌EHA105（浸染浓度为OD=0.4）浸染5min,转化效率最高;经过PCR检测初步证明nptⅡ基因已整合到番茄再生植株中。[结论]该研究结果为今后优良基因导入番茄品种美粉1号奠定了基础。     

将TERF1基因导入糖橙的研究

用携带TERF1基因的EHA105和LB4404 2种农杆菌分别转化糖橙实生苗节间茎段.根据已建立的再生体系和转化体系,对已得到的抗性芽经PCR和RT-PCR检测,验证已获得7个转TERF1基因的糖橙株系.此外,还比较了2种农杆菌菌株对糖橙的浸染能力,结果表明,EHA105农杆菌的浸染能力强于LB4404.     

花粉管介导的准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白转基因棉花的筛选

利用新疆荒漠昆虫抗冻蛋白基因进行遗传转化是培育新疆棉花抗寒品种的新途径. 研究采用RT-PCR结合RACE技术从新疆荒漠昆虫准噶尔小胸鳖甲(Microdera puntip ennis dzungarica)中克隆获得抗冻蛋白(Antifreeze protein)基因Mp AFP149.将MpAFP149克隆至 pBI121上,获得重组质粒后采用电转化法将重组质粒转入农杆菌EHA105内,PCR筛选鉴定重组子,并测序确定抗冻蛋白植物表达载体构建正确.将pBI121-MpAFP通过田间的花粉管导入技术转化棉花,收取转化的棉花种子,经检测证明在转化10 000朵花中,卡那霉素抗性筛选出 13株,PCR检测有2株阳性植株.实验结果为进一步开展抗冻蛋白基因转化棉花的研究奠定了基础.     

根癌农杆菌介导茶树转基因体系的建立

利用茶树[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]品种"农抗早"的叶片进行培养,诱导形成愈伤组织。选择生长旺盛、致密的愈伤组织块与根癌农杆菌EHA105进行共培养,通过潮霉素(Hygromycin)抗性筛选、GUS染色及PCR的验证,获得部分转基因愈伤组织。在添加100μmol·L-1的乙酰丁香酮(AS)处理后,转化率约为10%。同时试验结果证明,AS可以提高农杆菌的转化效率,增加渗透压却不能提高转化率。