未知植物病毒分子生物学检测方法的研究现状

植物的真菌病原菌可以通过核糖体RNA或者其他通用引物进行鉴定,植物病毒缺乏通用引物,这给植物未知病毒病的鉴定带来较大挑战。随着分子生物学及测序技术的发展,出现了很多直接从植物病料中检测未知病毒的方法,这些方法推进了植物病毒的发掘和病原鉴定,取得了非常好的效果。本文主要阐述近年来应用于检测未知植物病毒的分子生物学方法。     

双链RNA技术与植物病毒研究

 90%以上的植物病毒基因组是RNA。含RNA基因组的病毒会产生特异的双链RNA（dsRNA）。从受到病毒侵染的植物组织中提取病毒相关的dsRNA，进行病毒的检测和分类，诊断植物病毒病，探索生物防治植物病毒病的新途径，是植物病毒研究的重要内容。本文就双链RNA技术在植物病毒研究中的应用做一综述。     

CTAB法用于染病烟草植株中烟草丛顶病毒RNA的提取

 CTAB法是一种广泛用于从染病植物中提取总核酸,并用于后续相关病原物PCR检测的核酸提取法,已普遍运用于DNA病毒、植原体、细菌、真菌侵染植物的总DNA提取和病原检测。本文尝试将CTAB法用于一种由RNA病毒（烟草丛顶病毒）引起的烟草丛顶病染病组织总核酸的提取,以总核酸进行烟草丛顶病毒的RT-PCR检测,并与常规RNA病毒核酸提取法——Trizol法作比较。结果表明CTAB法和Trizol法提取的核酸用于烟草丛顶病毒RT-PCR检测时,均能扩增到目的条带,检测结果一致。在对复合侵染材料进行检测时发现,CTAB法提取的染病植物组织总核酸既包括DNA也包含RNA,有利于对DNA和RNA病原物同时进行检测;CTAB法所用试剂较Trizol法便宜,毒性小,且提取的核酸量较多、保存时间较长。因此CTAB法是一种高效、简便、经济的从烟草丛顶病染病组织中提取烟草丛顶病毒RNA的方法。     

植物抗病毒基因工程研究进展

植物病毒是一类重要的植物病原微生物,每年都给全球的农业生产带来了巨大的损失.近年来,通过基因工程技术培育抗病毒植物已经成为抵抗植物病毒的有效手段.笔者阐述了目前植物抗病毒基因工程的主要方法策略,包括由蛋白质介导、RNA介导、非病毒来源基因介导及交叉保护介导的抗性机制,分析了这些机制的存在问题及发展趋势,同时还对一些RNA水平的抗性策略进行了探讨.     

以TMV为模式建立基于宏基因组学的植物病毒检测方法

用感染烟草花叶病毒(TMV)的烟株做阳性对照,提取dsRNA,采用随机引物扩增、高通量测序方法进行了序列分析。PCR产物宏基因组测序结果显示:TMV的检出频率为99.84%;属水平分类和丰度统计结果显示:Tobamovirus占99.913%,成功建立了以植物病毒dsRNA提取与高通量测序相结合的植物病毒探测方法。按照病毒类似颗粒提取的方法对感染TMV的烟株提取病毒类似颗粒,获得TMV病毒粒子,从中提取RNA,应用TMV特异引物,进行RT-PCR,结果显示:扩增产物序列与TMA序列同源性为99%。结果表明:用该病毒类似颗粒抽提方法能成功提取TMV病毒粒子及RNA,满足宏基因组分析要求。应用本研究构建的dsRNA及病毒类似颗粒的方法,提取20个表现植物病毒病症状的植物样本dsRNA与病毒类似颗粒的DNA,核酸检测质量较好,成功检测到10多种植物病毒。所构建的方法为宏基因组技术探测农业栽培区及非耕作区植物病毒种群与生态适应奠定了基础。     

食物源SARS病毒的巢式PCR检测研究

本研究利用巢式RT-PCR技术,针对SARS病毒RNA序列保守区域设计并筛选出实用、可靠、灵敏度高、忠实性好的引物,对食品中的所有RNA进行扩增,并对扩增产物进行分析检测,从而确定食品中是否被SARS病毒污染。通过研究发现建立的巢式RT-PCR检测技术方法可以检测到10-6μg／μL的RNA量水平,并且,通过限制性酶切分析,表明RT-PCR扩增产物具有很好的忠实性;在研究中还发现,用普通RT-PCR对食品进行检测时,会有非特异扩增条带的产生,而用RT-nested PCR方法可以消除这些非特异扩增条带的产生,从而消除由于非特异扩增条带干扰造成的假阴性结果。通过对食品样品的检测没有发现这些食品受到SARS病毒的污染。     

应用反转录-多聚酶链式反应检测鸡IBDV的方法研究

通过对鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）RNA的提取、反转录及PCR反应条件、检测灵敏度等进行探讨,结果表明,采用反转录-多聚酶链式反应（RT－PCR）是检测鸡传染性法氏囊病病毒的可靠方法,RNA的提取简单易行,不经过病毒提纯,可检出的病毒RNA最低量可达1pg。     

香石竹坏死斑点病毒的鉴定与检测

调查表明云南省昆明市团结乡香石竹普遍发生病毒病。电镜负染检测采自团结乡香石竹病毒病病样,病叶汁液中观察到弯曲长线型的病毒粒体,长度约1000~1600 nm,直径约12 nm。对这些病样的叶片进行间接ELISA检测,所有样品与香石竹坏死斑点病毒抗血清都呈阳性反应。按照报道的长线形病毒属简并引物合成引物,采用RT-PCR法对血清反应呈阳性的香石竹总RNA扩增了1059ntsHSP70基因部分编码序列,将其克隆到pMD18-T载体上,并进行序列分析。根据测序结果设计引物建立RT-PCR扩增检测方法并测定其灵敏度。结果表明,使用简并引物和新设计的引物均能从CNFV感病香石竹组织中扩增出与预期大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物。灵敏性测定结果表明该特异性引物RT-PCR可从稀释106植物总RNA中检测出病毒。     

植物抗病毒机制研究进展

植物病毒病是一类严重影响植物生长和危害农作物生产的重要病害。病毒虽然结构简单,却变异复杂,所以一直给农业发展带来持续性的挑战。植物的先天免疫系统和RNA沉默是两种比较保守的抗病毒机制。植物的先天免疫系统包括两层,第1层是病原的相关分子模式触发的免疫,能够阻碍病毒等病原物入侵植物细胞;第2层是病原效应物触发的免疫,植物抗性蛋白能够识别病原物释放到植物细胞中的效应蛋白。这两层免疫系统的功能行使依赖于细胞膜上和细胞内的免疫受体蛋白。当病毒成功侵染植物细胞后,病毒的核酸需要利用植物的蛋白质合成系统完成自我复制,RNA沉默介导的植物抗病毒机制在此过程发挥重要的作用。病毒侵染的植物细胞内会产生病毒来源的小分子RNA(vsiRNA)。vsiRNA既可以靶向病毒RNA也可以靶向宿主转录本,引起转录后基因沉默(PTGS),也可以通过DNA甲基化、异染色质化,引起转录基因沉默。围绕先天免疫系统和RNA沉默介导的两种保守的植物抗病毒机制进行综述,旨在更好地理解植物与病毒之间的互作关系,为利用基因工程培育抗性品种和发展更有效的病毒防御策略提供思路。     

病毒诱导的基因沉默

    "病毒诱导的基因沉默"(virus-induced gene silencing,VIGS)一词最早用于描述被病毒侵染的植物的"恢复"现象,是一种植物抗病毒侵染的自然机制,现在已被开发成通过插入目的基因片段的重组病毒抑制植物内源基因表达的遗传技术,用于基因功能分析VIGS由小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)驱动,siRNA单链与RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex,RISC)结合后,特异性地和与siRNA同源的靶标RNA结合,并降解RNA模板已有源于15种不同类型病毒的VIGS载体得到开发和应用在VIGS栽体中插入的目的片段、重组VIGS病毒载体的植物导入方法、沉默处理时的寄主生育期、沉默处理后的植物培育条件等均显著影响VIGS的效率作为一种新型的基因鉴定和功能研究技术工具,VIGS具有无需事先知道目的基因全长序列、获取表型迅速、无需构建转基因植株等诸多优点,已越来越广泛地被应用于植物基因功能研究