刺参不同组织中MnSOD基因在脂多糖刺激下的定量表达分析（英文）

刺参由于其重要的经济价值和药用价值,已经成为我国海水养殖的重要种类。MnSOD对于增强吞噬细胞防御能力和整个机体的免疫功能具有重要作用,与生物体抵御病毒细菌等能力密切相关。通过研究在脂多糖刺激下MnSOD基因的定量表达情况,分析MnSOD在刺参免疫系统中的作用。结果显示:MnSOD基因的表达量由肠、肌肉到管足逐渐降低,体壁的表达量与体腔液基本一致。当刺参暴露于脂多糖中时,除肠以外其他的四种组织中MnSOD基因均出现过表达。其中,体腔液和体壁组织中MnSOD基因的表达量于12 h达到峰值;肌肉和管足中MnSOD基因的表达量于48 h达到峰值;体腔液中MnSOD基因的表达量于12 h达到对照组的4 115倍,而肠组织中MnSOD基因的表达量在48 h的实验过程中呈波动性降低。总体上来说,在脂多糖刺激下刺参各组织中MnSOD基因的表达量呈规律性波动。实验结果表明:在脂多糖刺激下刺参个体会产生强烈的抗氧化反应以保护刺参免受病原微生物的感染。     

低盐胁迫下仿刺参DD104基因的定量表达分析

以2龄仿刺参Apostichopus japonicus为试验材料,利用实时定量PCR技术分析了DD104基因在仿刺参不同组织中以及低盐胁迫后不同时间的表达情况.结果表明:DD104基因在仿刺参管足中的表达水平最高,在体腔液、触手、呼吸树中的表达水平次之,在体壁、肌肉和肠中的表达水平较低;仿刺参在受到低盐胁迫后,体内DD104 mRNA的表达随盐度胁迫时间的增加呈现波动性增减,胁迫72 h时DD104基因的表达最强,在肌肉和管足中的表达量达到最大;胁迫48 h时肠组织中的表达量最大;胁迫24 h时体腔液中的表达量最大.研究表明,低盐胁迫后DD104基因在仿刺参不同组织中的表达发生变化的时间点不同,低盐胁迫下DD104基因表达量的变化规律说明该基因的表达可能与渗透胁迫密切相关.     

刺参4个功能基因的表达分析

为研究刺参Apostichopus japonicus的生长发育,采用实时定量PCR方法,对刺参腱生蛋白基因、胶原蛋白α2基因、整合蛋白αV基因和整合蛋白βL基因等4个候选功能基因不同月龄的组织表达进行了分析。结果表明:刺参12、13、14月龄时,腱生蛋白基因在刺参肠、管足、呼吸树、皮肤、体壁、体腔液细胞、疣足和纵肌等8个组织中均有不同程度的表达,其中在体腔液细胞和呼吸树组织中的表达量较高(P0.05);胶原蛋白α2基因在刺参管足、呼吸树、体壁、疣足和纵肌组织中的表达量随月龄的增加而逐渐增加,其中在呼吸树组织中表达量最高,在纵肌、疣足、体壁、肠和体腔液细胞等组织中的表达量逐渐降低;整合蛋白αV基因在纵肌组织中的表达量随月龄的增加而逐渐增加;整合蛋白βL基因在皮肤、体壁、疣足和管足组织中的表达量较低。本研究结果为深入研究刺参这4个功能基因提供了参考。     

中间球海胆smad2/3基因克隆、组织表达及其脂多糖刺激响应

为明确中间球海胆Strongylocentrotus intermedius smad2/3基因(命名为Si-smad2/3)信息,初步研究了该基因的序列特征、组织表达模式及脂多糖对其表达的影响,采用RACE技术克隆获得了成体中间球海胆Si-smad2/3基因的全长cDNA序列。结果表明:Si-smad2/3基因的cDNA全长为2146 bp,共编码446个氨基酸;生物信息学分析发现,Si-smad2/3基因所编码的蛋白相对分子质量为50 300,等电点为6.93,属于亲水性非跨膜蛋白;通过与9种已公布物种的smad2/3蛋白氨基酸序列进行多重序列比对和系统进化分析发现,中间球海胆Si-smad2/3蛋白的氨基酸序列与其他真核生物smad2/3蛋白序列具有较高的相似性,与紫球海胆Strongylocentrotus purpuratus smad2/3蛋白的一致性高达96%,符合中间球海胆的分类和进化地位;实时定量PCR(qRT-PCR)检测结果显示,Si-smad2/3基因在中间球海胆不同组织中均有表达,其相对表达量从高到低为体腔细胞管足性腺围口膜肠齿间肌;利用脂多糖(LPS,0.1 mg/mL)对中间球海胆进行免疫刺激发现,与对照组相比,LPS刺激后Si-smad2/3基因在中间球海胆体腔细胞、管足和围口膜中均呈先升高后降低的表达趋势,其中,Si-smad2/3基因在中间球海胆体腔细胞中的相对表达量在LPS刺激9 h时达到峰值,管足中表达量在LPS刺激6 h时达到峰值,而围口膜中的表达量在LPS刺激72 h时达到峰值。研究表明,Si-smad2/3可能参与中间球海胆的免疫应答过程且免疫响应具有组织特异性。     

仿刺参过氧化氢酶基因全长cDNA的克隆及表达分析

研究仿刺参（Apostichopus japonicus）免疫相关基因的功能和作用机制可为仿刺参养殖病害的防控提供科学依据。克隆了仿刺参过氧化氢酶（catalase）基因的全长cDNA序列,全长1 885 bp,其中5′\|非翻译区（5′\|untranslated region,UTR）长76 bp,3′\|UTR长306 bp,开放阅读框（open reading frame,ORF）1 503 bp,编码500个氨基酸,预测蛋白分子量为56.56 kDa。氨基酸序列比对结果显示,仿刺参Catalase与三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）和紫海胆（Strongylocentrotus purpuratus）的相似度最高,为75%。仿刺参catalase cDNA推导的氨基酸序列具有过氧化物酶定位信号PTS2、与还原型辅酶Ⅱ(NADPH) 结合的氨基酸残基及与其它物种高度保守的Catalase近端血红素配体签名序列（351RLFSYSDTH359）。系统进化分析显示仿刺参处于无脊椎动物分支中,和紫海胆位于同一小支上。实时定量PCR结果显示,catalase mRNA在仿刺参肠、体壁、肌肉、呼吸树、体腔细胞和管足中均有表达,在肠中表达量最高。在细菌脂多糖LPS刺激后4 h,体腔细胞中catalase mRNA表达量显著升高,表明仿刺参的catalase基因在应对外来病原菌刺激的免疫应答中发挥了重要作用。     

仿刺参7个盐度相关基因在低盐胁迫下的表达模式

从仿刺参Apostichopus japonicus低盐转录组数据库中选取肌腱蛋白-R1 (TN-R1）、肌腱蛋白-R2(TN-R2)、乙酰胆碱受体亚基α-3(CHRNA3）、脂肪酸结合蛋白6(FABP6)、单羧酸转运蛋白2(SLC16A7)、纤维胶凝蛋白1 (Fcn1)、黑素转铁蛋白(Mfi2)共7个盐度调节相关基因, 利用 qRT-PCR 技术分析这7个基因在低盐胁迫下不同组织中的表达水平及表达丰度。结果表明TN-R1基因在仿刺参体腔液中表达水平最高,呼吸树次之,肠表达较低;TN-R2基因在仿刺参体腔液中表达水平最高,在肠中表达较低,呼吸树中不表达。SLC16A7、FABP6、Fcn1、CHRNA3和Mfi2均在体腔液中表达最高。Mfi2基因在体腔液中明显上调表达,在呼吸树组织和肠组织中下调表达,且与对照组均呈显著性差异。Fcn1在体腔液中的表达量在胁迫后1.5 h达到最高,为对照组的669倍,在胁迫48 h之前均呈明显上调。低盐胁迫下这7个基因表达丰度的变化,说明这些基因或作为功能基因直接参与机体的盐度适应的代谢调节,或作为调控基因调节盐度相关功能蛋白的表达和活性来提高仿刺参对低盐胁迫的耐受能力。上述结果表明仿刺参的盐度适应过程是一个需要多基因参与的应激反应信号转导网络,为仿刺参盐度调节适应机制的研究奠定基础。     

仿刺参profilin基因全长cDNA的克隆及表达分析

仿刺参（Apostichopus japonicus）是我国北方沿海重要养殖品种之一。克隆了仿刺参profilin基因全长cDNA序列,并分析了基因的表达规律。该基因cDNA序列全长787 bp,5′-非翻译区（5′-untranslated region,UTR）长205 bp,3′-UTR长204 bp,开放阅读框378 bp,编码125个氨基酸,预测蛋白分子量13.4 kDa。仿刺参Profilin蛋白的PROF保守结构域中含有肌动蛋白互作位点、多聚脯氨酸结合位点和PIP2互作位点。氨基酸序列比对结果显示,仿刺参Profilin与丝盘虫（Trichoplax adhaerens）和囊舌虫（Saccoglossus kowalevskii）相似度最高,为46%。Quantitative real-time PCR结果显示,profilin mRNA在仿刺参未受精卵、受精卵、多细胞期、囊胚期、原肠期、小耳状幼体、中耳状幼体、大耳状幼体、樽型幼体、五触手幼体和稚参11个发育阶段及幼参的体壁、体腔细胞、肠道和呼吸树中均有表达;在仿刺参的不同发育阶段中,未受精卵至原肠期profilin mRNA表达量低,从小耳状幼体至稚参表达量增高;在仿刺参的不同组织中,profilin mRNA在体腔细胞中的表达量最高。经过棘皮动物免疫系统有效激活物脂多糖LPS的刺激,体腔细胞中profilin mRNA表达量显著升高,为仿刺参养殖病害的防控提供科学依据。     

刺参温度相关基因在模拟不同海域冬春季水温条件下的表达研究

为探讨不同海域冬春季水温对刺参温度相关基因的表达影响,在实验室内模拟了俄罗斯沿海地区、大连沿海地区、福建沿海地区12月至翌年4月刺参Apostichopus japonicus生长的海水温度,并从已构建的刺参耐寒基因筛选cDNA文库和刺参高温胁迫正反消减cDNA文库中选取了7个差异基因:hsp70、gp96、UQCRFS1、ferritin、lysozyme、mtLSU、proeintl(2)efl,利用实时荧光定量PCR方法研究了这7个基因在3种海域冬春季模拟水温条件下的表达情况。结果表明:3个水温组刺参同一组织中hsp70基因的表达量变化不明显,但在不同组织中的表达量存在差异;模拟福建沿海地区冬春季水温组刺参各组织中gp96基因的表达量整体上均高于其他两个水温组,并且在模拟福建沿海地区冬春季水温组刺参呼吸树中的表达量显著高于该组肠和体壁(P0.05);模拟俄罗斯沿海地区冬春季水温组刺参各组织中UQCRFS1基因的表达量均高于其他两个水温组;3个水温组刺参各组织中ferritin基因的表达模式及表达量均不相同;3个水温组刺参各组织中lysozyme和proeintl(2)efl两个基因的表达量均在呼吸树中达到最高,且显著高于肠和体壁(P0.05);3个水温组刺参各组织中mt LSU基因的表达模式基本相同,其表达量均表现为体壁显著高于肠和呼吸树(P0.05)。     

刺参补体AjC3活性相关miRNA的筛选与初步研究

为了从miRNA调控方面探索刺参Apostichopus japonicus的免疫机制,用脂多糖刺激刺参,在第0、6、12 h取样(记为样本A00、A06、A12),以海胆Strongylocentrotus purpuratus基因组为参照基因,运用高通量测序和相关生物信息学方法筛选与刺参补体(AjC3)相关的miRNAs,并通过实时定量PCR验证相关miRNA和AjC3 mRNA的表达变化。结果表明:经比对筛选出刺参体腔细胞的miRNA共41个;通过靶基因预测和差异表达分析,共得到靶基因为补体AjC3的miRNA有3个,分别为spu-miR-133、spu-miR-137、spu-miR-2006;3种miRNA和AjC3 mRNA实时定量PCR显示,spu-miR-133表达量呈先升高后降低的趋势,12 h达到最高值,spu-miR-137表达量呈先降低后升高的趋势,9 h达到最低值,12 h达到最高值,spu-miR-2006表达量呈先升高后降低的趋势,9 h达到最高值,AjC3 mRNA表达量呈先升高后降低的趋势,9 h达到最高值。研究表明,spu-miR-133、spu-miR-137可能共同抑制调控补体AjC3基因表达,spu-miR-2006在免疫反应中对其他靶基因进行调控。     

仿刺参cytb和β-actin基因表达稳定性比较

基因表达分析需要采用内参基因来校正目的基因的表达量。采用半定量RT-PCR的方法分析了cytb和β-actin基因在仿刺参(Apostichopus japonicus)未受精卵、受精卵、多细胞期、囊胚期、原肠期、小耳状幼体、中耳状幼体、大耳状幼体、樽型幼体、五触手幼体、稚参11个发育阶段和幼参的体壁、体腔细胞、肠道和呼吸树中的表达情况。结果表明:cytb在不同发育阶段和不同组织中稳定表达;β-actin基因在稚参之前不同发育阶段中表达水平有显著差异,在幼参的体壁、肠道和呼吸树中稳定表达。此外,cytb在lipopolysaccgarides (LPS)刺激前后的原肠胚、小耳状幼体、中耳状幼体、大耳状幼体、樽型幼体、稚参和幼参四种组织中表达量无显著差异;β-actin基因在LPS刺激前后的幼参体腔细胞、肠道和呼吸树中表达量无显著差异。本研究为仿刺参功能基因表达分析中,cytb与β-actin基因作为内参基因的可行性提供了依据。     

仿刺参补体类似物活性的测定

用3种方法对仿刺参Apostichopus japonicus体腔液、体腔液上清液及体腔细胞中的总补体溶血活性和补体类似物AjC3、AjC4活性进行测定.结果表明:在仿刺参体腔液、体腔液上清液和体腔细胞中能够检测到总补体溶血活性和补体类似物AjC3、AjC4,表明仿刺参体内存在有脊椎动物的补体类似物,且活性与正常人补体活性相似.仿刺参体内总补体溶血活性和补体类似物AjC3、AjC4的活性依次顺序均为体腔液＞体腔细胞＞体腔液上清液.     

用改良的TRIZOL法快速提取仿刺参和中间球海胆的总RNA

用改良的TRIZOL法和普通TRIZOL法分别提取仿刺参Apostichopus japonica体壁、肠、体腔液和中间球海胆Strongylocentrotus intermedius的管足、性腺、齿间肌的总RNA。结果表明:用普通TRIZOL法提取时间长,电泳条带不很清晰,存在降解且各个组织提取的状况不稳定,杂质量多;而用改良TRIZOL法能够快速提取仿刺参、海胆组织的总RNA,电泳后得到的28S rRNA和18S rRNA条带清晰、完整性好、纯度高、得率高,其A/A为2.04~2.14,总RNA浓度为44.96~115.02 ng/μL。     

复方中草药对仿刺参免疫力和抗病力的影响

将以黄芪、党参为主药并加入另外5味中草药所配伍的复方中草药粉碎制剂,以质量分数分别为0%（对照组）、0.5%、1.5%和2.5%的剂量添加于基础饲料中,连续投喂仿刺参Apostichopus japonicus37d,在试验开始后第1、2、3、4周采样,测定仿刺参的肠、触手、体壁、肌肉和体腔液中的抗菌活力及体腔细胞的吞噬活性;于试验开始后第4周,用仿刺参＂化皮病＂病原菌黄海希瓦氏菌Shewanella marisflavi以3.7×108个/mL的浓度在每头仿刺参背部注射0.1 mL的菌悬液,每天观察记录死亡个体症状,统计死亡率,计算相对保护率（共观察记录7 d）。结果显示：各组的抗菌活力均随着用药时间的延长、用药浓度的加大而升高,总体趋势表现为2.5%添加组〉1.5%添加组〉0.5%添加组〉对照组;各用药组仿刺参的体腔细胞吞噬能力均随着用药时间的延长呈现先升高后降低的趋势,第2、3周达峰值,总体趋势表现为1.5%添加组〉2.5%添加组〉0.5%添加组〉对照组;攻毒试验结果显示,对照组仿刺参3 d后全部死亡,第7天各用药组相对保护率依次为1.5%添加组〉0.5%添加组〉2.5%添加组,分别为30.0%、20.0%和10.0%。由此表明,该复方中草药可以显著提高仿刺参的免疫力和抗病力,以1.5%添加剂量组的效果最佳。     

仿刺参体腔细胞原代培养方法初探

以仿刺参Apostichopus japonicus体腔细胞为材料,分别用体腔液和MEM、L-15两种培养基进行原代培养,初步探讨了仿刺参体腔细胞培养的基本条件。结果表明：在18℃下封闭培养,体腔细胞在体腔液中直接培养能够贴壁、伸展,细胞呈球形和上皮样,但凝集现象严重;在合成培养基（MEM、L-15）中,体腔细胞凝集明显减少;与MEM培养基相比,体腔细胞在L-15培养基中贴壁时间长,伸展状态好,上皮样细胞较多,可培养至72h;培养基中血清的添加量与细胞的培养状态和可培养时间关系不明显。     

仿刺参不同组织液的抗菌活性

采用平板菌落计数法测定仿刺参Apostichopus japonicus体腔液、体腔液上清液、体腔细胞悬液和体壁内皮组织匀浆液对哈氏弧菌Vibrio harveyi的抑制作用,并对健康仿刺参与感染后仿刺参的体壁内皮组织匀浆液的抑菌作用进行了比较;采用乙醇沉淀、离心等方法从仿刺参体壁内皮组织中粗提得到一种水溶性成分,测定了该成分对哈氏弧菌、白色葡萄球菌Staphylococcus albus和迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda的抑菌活性,并初步研究了该成分的基本性质。结果表明：仿刺参体壁内皮组织匀浆液对哈氏弧菌的抑制效果显著,体腔液、体腔液上清液、体腔细胞悬液对哈氏弧菌的抑制效果不显著;感染状态下,仿刺参体壁内皮组织匀浆液的抑菌作用与健康状态相比有所降低。提取的水溶性成分对哈氏弧菌、白色葡萄球菌和迟钝爱德华氏菌均有明显的抑制作用;该成分的茚三酮反应呈阳性,其中蛋白质的质量分数为17.48%;该成分经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得到5个蛋白条带,相对分子质量大约为55 300、46 100、34 700、19 500和14 500,初步认为其含有肽类抗菌活性物质。     

不同添加量的益生菌组合对仿刺参消化和免疫指标的影响

将筛选自仿刺参Apostichopus japonicus肠道的乳酸菌L-2、芽孢杆菌K-3和芽孢杆菌J-9以3种不同浓度(0、103、105cfu/mL)按正交实验设计分为9个处理的配比添加到饲料中,进行仿刺参饲养试验。经过30 d养殖后测定仿刺参肠道内蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化物歧化酶和溶菌酶的活性。结果表明:添加益生菌剂可以提高仿刺参消化酶的活性,尤其是蛋白酶和淀粉酶的活性,并且对提高动物免疫功能有积极作用,其中处理6组的蛋白酶活力为对照组的5倍,淀粉酶活力是对照组的两倍,各处理间的纤维素酶活力变化不明显;处理6组的超氧化物歧化酶和溶菌酶活性在所有处理中最高;统计分析表明,处理6组为最佳配比,即乳酸菌L-2添加量为103cfu/mL,芽孢杆菌K-3添加量为105cfu/mL,芽孢杆菌J-9添加量为0。