石蒜根际拮抗细菌HH1的筛选鉴定及其抑菌活性研究

[目的]以小麦赤霉病菌(Fusarium gramiuearum)为筛选靶标,分离石蒜根部土样中的拮抗细菌并研究其抑菌特性及机制。[方法]通过抑菌活性筛选拮抗菌株,根据菌落及细胞形态观察、生理生化试验结果和16S rRNA基因序列分析进行菌种鉴定,并对拮抗菌株产活性抗真菌成分的最佳培养基和培养条件进行优化。通过显微观察拮抗菌发酵上清液对病原菌生长的影响,对活性物质的热稳定性、酸碱稳定性及对蛋白酶K敏感性进行测定。[结果]共获得有稳定拮抗效果的菌株7株。以其中1株对小麦赤霉病菌具有较好拮抗作用的细菌HH1作为进一步研究的对象,鉴定其为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。抑菌试验发现菌株HH1能够分泌抑制小麦赤霉病菌孢子和菌丝生长的物质。沉淀菌株HH1发酵上清液中活性物质的最适硫酸铵饱和度为60%。优化了菌株HH1产活性抗真菌成分的培养基和培养条件。对活性物质热稳定性、酸碱稳定性及对蛋白酶K敏感性的测定结果显示:拮抗物质在p H中性和低于70℃的条件下较稳定,70℃以上的温度和蛋白酶K处理抗菌物质,其抑菌活性显著下降。[结论]初步推测菌株HH1所产拮抗物质可能是蛋白质类。     

南极适冷菌Rheinheimera sp.97产抗菌活性物质发酵条件的优化

[目的]优化南极适冷菌Rheinheimera sp.97产抗菌活性物质的发酵条件。[方法]通过单因素和正交试验对南极适冷菌R.sp.97产抗菌活性物质的发酵培养基进行了优化,并通过单因素试验对其发酵条件进行了优化。[结果]菌株R.sp.97产抗菌活性物质的最佳培养基为：蛋白胨3.0g/L,硫酸铵1.0g/L,淀粉2.0g/L,NaCl15.0g/L;最佳发酵条件为：发酵培养基初始pH8,发酵温度10℃,摇瓶装液量30.0%（V/V）,接种量1.0%（V/V）。优化后菌株R.sp.97发酵液的抗菌活性较优化前提高了18.1%。[结论]为研究南极适冷菌R.sp.97的活性物质奠定了基础。     

南极适冷菌Rheinheimera sp.97产抗菌活性物质发酵条件的优化

[目的]优化南极适冷菌Rheinheimerasp．97产抗茵活性物质的发酵条件。[方法]通过单因素和正交试验对南极适冷茵R．sp．97产抗茵活性物质的发酵培养基进行了优化,并通过单因素试验对其发酵条件进行了优化。[结果]菌株R．sp．97产抗菌活性物质的最佳培养基为：蛋白胨3．Og／L,硫酸铵1．0g／L,淀粉2．0g／L,NaCl15．0g／L;最佳发酵条件为：发酵培养基初始pH8,发酵温度10℃,摇瓶装液量30．0％（V／V）,接种量1．0％（V／V）。优化后菌株R．sp．97发酵液的抗茵活性较优化前提高了22．2％。[结论]为研究南极适冷茵R．sp．9r7的活性物质奠定了基础。     

灭草烟在甘蔗愈伤分化阶段和刚成苗阶段浓度筛选试验

从催吐萝芙木中分离到1株对香蕉炭疽菌拮抗作用较强的菌株LYM3,皿内拮抗活性达到64％,通过常规鉴定结合16S rDNA序列分析,将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).通过单因素法对其产抗菌活性物质的发酵条件进行了优化,获得其最适培养基组成为:可溶性淀粉2％,胰蛋白胨1％,酵母粉0.8％,NaCl 1％,初始pH 6.0、28℃、180 r/min发酵培养60 h,抗菌活性物质产量达到最高,抑菌圈直径为3.42cm.     

抗真菌活性菌株BP08的鉴定及培养条件和培养基的优化

【目的】对抗真菌活性菌株BP08进行鉴定,并对其最适培养条件和最佳培养基组分进行优化。【方法】从华南农业大学杀虫植物标本园土壤中筛选出1株BP08拮抗菌株,采用形态和生理生化鉴定方法、16S rDNA序列测定和系统发育分析对菌株BP08进行鉴定;以菌体生物量和发酵液拮抗水稻纹枯病菌活性为指标,通过单因素试验,对培养基初始pH值、发酵温度、装液量、接种量等进行优化,在此基础上以发酵液拮抗水稻纹枯病菌活性为指标,对发酵培养基组分进行优化。【结果】筛选的菌株BP08初步鉴定为短小芽孢杆菌;在培养基初始pH值7.0~8.0,发酵温度30℃,装液量100 mL/L,接种量为3%,180 r/min条件下,菌株BP08生长量及拮抗水稻纹枯病菌的活性较高。培养基最佳碳源、氮源、无机盐分别为葡萄糖、牛肉膏、CaCl2。【结论】短小芽孢杆菌菌株BP08在优化培养条件下能够得到大量的抗真菌物质,具有一定的开发利用潜力。     

钩丝孢属真菌高产蛋白酶菌株的筛选及其发酵条件优化

【目的】筛选钩丝孢属真菌高产蛋白酶菌株,并优化其产酶培养基和发酵条件,为寄生线虫病的生物防治提供优良菌种。【方法】以15株钩丝孢属真菌为材料,在28℃、180 r/min振荡培养10 d后,采用福林酚法测定其蛋白酶活性,筛选高产蛋白酶菌株,测定其产酶周期,并利用全齿复活线虫测定该菌株发酵液的杀线虫率。通过单因素试验和正交试验对高产蛋白酶菌株的产酶培养基及发酵条件进行优化,并对优化条件进行验证。【结果】从15株钩丝孢属真菌中筛选出1株高产蛋白酶菌株H6,其蛋白酶活性在发酵5 d最高。最佳产酶培养基成分为葡萄糖8 g/L、明胶8 g/L、蛋白胨8 g/L、酵母提取物4 g/L。最佳发酵条件为pH 7.0、20℃、260 r/min、接种2块直径5 mm的菌块。在此优化条件下,菌株H6蛋白酶活性为216.42 U/mL,比优化前(67.84 U/mL)提高了2.19倍。【结论】筛选出1株钩丝孢属高产蛋白酶菌株H6,获得了其优化产酶培养基和发酵条件。     

烟草黑胫病拮抗菌HZ15的发酵条件优化

采用平板对峙法研究了烟草黑胫病菌的拮抗菌铜绿假单胞菌HZ15菌株对烟草疫霉的抑菌活性;以HZ15菌株发酵液的细菌浓度即在波长600 nm处的OD值为指标,采用单因素试验和正交试验对HZ15菌株的基础发酵培养基和发酵条件进行了优化.结果表明:HZ15菌株的发酵培养以YSP培养基(其组分为蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、蔗糖20 g/L、蒸馏水1 L)为最适的基础培养基,以蔗糖为最佳碳源,以蛋白胨为最佳氮源;最佳发酵条件为pH 7、温度36℃、光照时间12 h/d、发酵时间48 h、装液量40 mL/250 mL、转速220 r/min、接菌量2.5％.优化后的培养基和发酵条件提高了HZ15菌株的培养效率,节约了发酵成本.     

一株生姜青枯病拮抗菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

[目的]筛选对生姜青枯病菌有较强拮抗活性的细菌菌株,鉴定并优化拮抗菌株的发酵条件,为拮抗菌株的田间应用和活性产物开发提供必要的前期基础.[方法]从生姜青枯病发病较重的田块采集17份健康生姜根际根围土样,采用稀释平板分离和室内活性测定,筛选对生姜青枯病菌有较强拮抗活性的细菌菌株;对拮抗菌株进行形态学、生理生化特性和分子生物学鉴定,并通过改变碳源、氮源、发酵温度、初始pH和发酵时间的长短等外界条件对拮抗菌株进行发酵条件优化.[结果]筛选出1株对生姜青枯病菌有较强拮抗活性的细菌菌株YA-1.结合形态学、生理生化特性和16S rDNA鉴定,确定YA-1菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).结合发酵条件的改变和室内活性测定,确定YA-1菌株的最佳发酵条件为:发酵温度32℃、初始pH 7.5、发酵时间48h,最佳培养基配方为NaC1 1.0％、CaCO3 0.2％、酵母粉0.5％、NH4H2PO4 0.05％、(NH4)2HPO40.05％和蛋白胨1.0％.发酵条件优化后,处理48 h,抑菌圈平均直径由优化前的23.0 mm提高到29.0 mm.[结论]YA-1菌株对生姜青枯病菌具有较高的拮抗活性,具有开发成生物农药的潜力.     

一株香樟炭疽病拮抗菌的鉴定及其发酵条件优化

为寻获香樟炭疽病生物防治的优良菌种资源,通过形态学观察、生理生化检测和基于16S rDNA系统发育分析,对一株香樟炭疽病拮抗菌SWUJ1进行了菌种鉴定;通过单因素试验优化该菌株产生抑菌活性物质的发酵条件,并釆用抑菌圈法检测其发酵液抑菌活性;进而利用菌丝生长速率法测定该菌株的抑菌谱.菌种鉴定结果表明SWUJ1为革兰氏阳性杆状菌株、产芽孢,在LB固体培养基上菌落呈圆形、边缘整齐光滑、湿润、呈乳白色黏稠状,过氧化氢酶呈阳性且具运动性;基于16S rDNA序列的系统发育分析结果显示该菌株与登录号为NR116240的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)的亲缘关系最近,且处于系统发育树的同一分枝,故将SWUJ1菌株鉴定为甲基营养型芽孢杆菌,命名为B.methylotrophicus SWUJ1;发酵条件优化结果表明该菌株产抑菌活性物质的最佳氮源为酵母粉,碳源为乳糖,无机盐离子为MgSO_4,初始pH值为5.0,培养温度为25℃,接种量为1.0%,发酵时间为96 h,优化后拮抗细菌B.methylotrophicus SWUJ1等量发酵上清液对香樟炭疽病菌的拮抗作用显著提高,且其发酵上清液对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)及旋孢腔菌(Cochiobolus sativus)等10余种常见植物病原菌具不同程度的抑制作用.研究结果表明,B.methylotrophicus SWUJ1菌株可作为开发香樟炭疽病生防制剂的候选菌株.     

内生菌HT5产生抗菌物质培养基及发酵条件优化

内生菌HT5发酵无菌滤液对番茄早疫病菌的菌丝生长和孢子萌发均有强烈的抑制作用。试验以内生菌HT5发酵液无菌滤液对番茄早疫病菌的抑菌活性作为优化指标,测定菌株HT5产生抗菌物质培养所需的碳源、氮源、无机盐,并通过均匀试验对菌株产生抗菌物质的培养基配方进行了优化,同时利用正交试验对菌株产生抗菌物质的发酵条件进行了优化。结果表明,菌株HT5产生抗菌物质的最佳碳源、氮源和无机盐分别为葡萄糖、酵母浸膏和硫酸镁;最优培养基组合配方为:葡萄糖22.3 g/L,酵母浸膏29.9 g/L,硫酸镁5 g/L;最佳发酵条件组合为:温度28℃,接种量4%,pH值6.5,转速150 r/min,装液量50 mL,培养时间6 d。     

Vc混菌发酵中不同伴生菌伴生能力差异的研究

为考察不同伴生菌伴生的差异与2-酮基-L-古龙酸产量之间的关系,本研究比较了维生素C混菌发酵中2株伴生菌——巨大芽孢杆菌25B和短小芽孢杆菌HJ04的生长特性、胞外蛋白含量,并分别测定了它们与普通生酮基古龙酸杆菌组成的混菌发酵体系的抗氧化能力。结果表明:相对于25B,HJ04生长能力更强,在发酵18和42h,胞外蛋白含量分别为92.2和89.1μg/mL,分别高于前者13.6和4.8μg/mL;与普通生酮基古龙酸杆菌组成的混菌体系的总抗氧化能力在发酵18和42h分别为42.3和57.3U/mL,分别高于前者4.09U/mL(P0.05)和2.73U/mL(P0.05),谷胱甘肽还原酶活力为33.6和59.8U/L,分别高于前者14.5U/L(P0.01)和6.1U/L(P0.05);在Vc混菌发酵中2-KGA的产量提高了10.3mg/mL(P0.05)。研究认为,伴生菌分泌活性蛋白能力及抗氧化能力与混菌体系2-酮基-L-古龙酸产量呈正相关性。     

黑核桃内生真菌HJ1油脂制备生物柴油的研究

对黑核桃内生真菌HJ1油脂制备生物柴油的关键技术进行研究。利用单因素试验和验证试验优化反应条件。用气相色谱-质谱联用仪（Thermo Finnigan Trace DSQ）对油脂的成分进行分析。选择甲醇为萃取剂进行降酸处理,根据植物油脂酸值测定法GB/T5530-1985进行酸值测定。采用均相碱催化酯交换法制备生物柴油,并用气相色谱内标法对所制备生物柴油的脂肪酸甲酯的组成和含量进行测定。较好的工艺条件是:醇-油摩尔比8∶1,催化剂浓度1%,反应温度60 ℃,反应时间2 h。在此条件下,甲酯含量超过98%,生物柴油得率超过66%。结果表明,HJ1油脂制备的生物柴油可以被发展为石化柴油代替品之一。     

放线菌HJ1-2菌株发酵液抑菌谱及稳定性的研究

采用菌丝生长速率法、管碟法和活体组织法测定发酵液的抑菌活性,在不同条件下测定发酵液的稳定性,捷克溶剂系统纸层析法鉴别发酵液中抗生素类型.发酵液的抑菌活性测定结果表明,放线菌HJ1-2菌株发酵液对20种供试病原真菌均具有不同程度抑制作用,其10倍稀释液对其中10种病原真菌菌丝生长的抑制率达到80%以上;供试7种细菌中放线菌HJ1-2菌株发酵液对白菜软腐病菌的抑制作用最强,抑菌圈直径为17.75 mm;放线菌HJ1-2菌株发酵液对油菜菌核病和番茄灰霉病的抑制率分别为100 %和71.39 %.发酵液的稳定性测定结果表明,发酵液对热、酸和紫外线均较稳定,发酵液在80℃处理后抑菌活性开始下降,发酵液在pH3～9条件下抑菌活性稳定.捷克溶剂系统纸层析法测定表明,发酵液中主要抑菌活性物质为大环内酯类抗生素.该菌株的代谢产物具有广谱抑菌活性和较强的稳定性,具有一定开发价值.     

黑核桃内生真菌HJ_1发酵产物的除草活性

对从黑核桃中分离到的21种内生真菌的发酵产物进行除草活性研究。结果表明,这些内生真菌的发酵液对供试受体(小麦、油菜)均有不同程度的除草活性,其中HJ1、HJ2、HJ9、HJ10等14种除草活性较好,HJ1对供试受体的抑制率均达到92%以上,除草效果最好。HJ1发酵液的萃取物对4种供试受体(小麦、油菜、萝卜和绿豆)均有不同程度的除草活性,在质量浓度50 mg/mL时,乙酸乙酯萃取物对油菜幼根和幼芽的抑制率均在90%以上,除草活性最好;正丁醇萃取物次之,萃余水相效果最差。对同一受体而言,随着乙酸乙酯萃取物质量浓度的降低抑制作用减弱,对不同受体而言,相同质量浓度的乙酸乙酯萃取物的抑制作用也存在显著差异。     

许氏平鲉微卫星标记的开发及评价

采用磁珠富集法筛选具多态性的许氏平鲉微卫星标记,并用一个野生群体对其多态性进行了评价。三引物PCR法筛选出58个阳性克隆进行了测序,共得到47个含微卫星核心的DNA序列,筛选出15对具有多态性的微卫星引物。所有位点上共得到66个等位基因片段,每个位点的观测等位基因数(A)为2~14个,平均等位基因数为4.4,观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)范围分别为0.062 5~0.968 8、0.061 5~0.929 1。每个位点的多态信息含量(PIC)显示,有6个位点表现出高度或中度多态。经Bonferroni校正后,HJ2-32、HJ4-27、HJ4-45和HJ4-47四个位点的等位基因频率显著偏离了Hardy-Weinberg平衡。连锁不平衡检测表明,各位点间无连锁不平衡现象。     

大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium ddjaponicum）的血清型研究

以自东北地区分离的8株大豆慢生根瘤菌为供试菌用交叉凝集反应比较了它们与目前国内外已报道 的15株大豆慢生根瘤菌标准血清型菌株之间的血清学关系。研究结果表明：（1）菌株93H10F5和HJ15不与供试标准血清型菌株发生交叉凝集瓜在，分别命名为O14和O15血清型，（2）菌株HJ19、HJ28、93F42与标准血甭型菌株USDA94有交叉凝集反应，进一步的抗原吸收试验结果表明：HJ19和HJ28的抗原组成完全相同，命名为O3bxl血清亚型；USDA94仅与HJ19有交叉反应，命名为O３ab血清亚型，９３Ｆ４２也与ＨＪ１９有部分共同抗原，命名为Ｏ３de血清亚型。（３）菌株９３ＨＡ８与标准血清型菌株USDA135有部分共同抗原，分别命名为O12bc和O12ab血清亚型，（4）标准菌株USDA127、USDA129与USDA123有交叉凝集反应，抗原吸收试验分别将其细分为O12bc和O12ab血甭亚型。（4）标准菌株USDA127、USDA129与USDA123有交叉凝集反应，抗原吸收试验分别将其细分为O10ab。O10de和O10xxl等3个血清亚型。（5）将USDA的10个标准菌株重新命名为O1，O2，O4，O5，O6，O7，O8，O9，O11和O13血清型。     

5%锐劲特悬浮剂防治水稻稻纵卷叶螟田间药效试验

以不同浓度5％锐劲特悬浮剂、20％三唑磷乳油和40％毒丝本乳油等3种药剂进行防治水稻稻纵卷叶螟田间药效试验。结果表明,在1～2龄幼虫高峰期,每公顷使用5％锐劲特悬浮剂300～600mL,对水稻稻纵卷叶螟的防治效果最高可达97．6％,且药效期长,防效明显优于20％三唑磷乳油等常用药剂。从使用成本与防治效果两方面综合考虑,生产上5％锐劲特悬浮剂的使用剂量以450mL／hm^2比较合适。     

5种常用除草剂对绿豆杂草的田间防除效果

为了筛选适宜绿豆田杂草防除的除草剂,以市场销售量大、易购买为前提,选择5种常用除草剂,采用大区对比试验设计,以人工锄草和不锄草处理为对照,设75%噻吩磺隆90 g/hm2+960 g/L精异丙甲草胺1 872 m L/hm2、乙草胺2 250 m L/hm2播后苗前土表喷施处理,15%乙羧氟草醚乳油900 m L/hm2、15%乙羧氟草醚乳油900 m L/hm2+15%精稳杀得乳油1 050 m L/hm2、15%精稳杀得乳油1 050 m L/hm2苗后茎叶喷施处理,进行了不同除草剂及配比对绿豆(冀绿10号)田杂草防除效果的研究。结果表明:参试除草剂均对绿豆安全,其中,75%噻吩磺隆90 g/hm2与960 g/L精异丙甲草胺1 872 m L/hm2复配在绿豆播后苗前进行土表喷施对杂草防效显著;15%乙羧氟草醚乳油与15%精稳杀得乳油复配在绿豆出苗后定向喷施对绿豆田杂草防除效果最好,施药后30 d对绿豆田主要阔叶草杂草马齿苋、反枝苋及禾本科杂草牛筋草的鲜重防效分别为100%、100%和95.62%,绿豆产量为2 799.14 kg/hm2,较人工锄草处理增产2.57%。在绿豆播后苗前用75%噻吩磺隆90 g/hm2与960 g/L精异丙甲草胺1 872 m L/hm2复配剂进行土表喷施、绿豆出苗后用15%乙羧氟草醚乳油与15%精稳杀得乳油复配剂进行茎叶喷施对绿豆田杂草防除效果较好,可以用于绿豆田间杂草防除。     

催乳素和牛卵泡液对胚胎体外成熟及未成熟的牛卵母细胞的影响

对催乳素和牛卵泡液在水牛卵母细胞体外成熟中的作用进行了探讨．来自屠宰场水牛卵巢的卵母细胞和卵丘细胞复合体，在含体积分数为5％CO2的培养箱中培养24～26h，然后通过体外受精测定其受精和胚胎发育能力．实验1在成熟液中添加1．0μg/mL催乳素(PRL)，卵母细胞的囊胚发育比例(12．8％)比对照组(9．1％)高但不显著．实验2添加5％牛卵泡液(BFF)，卵母细胞卵裂的比例明显高于对照组，但囊胚形成率则几乎一样；添加1．0μg/mL PRL和5％ BFF组卵母细胞卵裂的比例为38．1％，而发育成囊胚阶段的卵母细胞的比例为14％．试验结果表明：添加适宜浓度的BFF和PRL能促进未成熟的水牛卵母细胞体外成熟后的胚胎发育能力．     

基于环境一号卫星数据的洞庭湖叶绿素a浓度反演

通过星地同步地面试验,建立起洞庭湖水体的叶绿素a浓度遥感反演模型,运用2011年4月~2012年4月的多期环境一号卫星CCD数据,对洞庭湖叶绿素a浓度进行动态监测和分析。结果表明:环境一号卫星CCD数据第三通道(HJ3)反射率与第二通道(HJ2)和第四通道(HJ4)反射率之和的比值与洞庭湖水体叶绿素浓度具有较高的相关性,从而构建基于环境一号卫星多光谱数据的洞庭湖叶绿素a浓度反演模型;采用多期环境一号卫星CCD数据对洞庭湖的叶绿素a浓度进行了连续监测,较好地反映了洞庭湖叶绿素a的时空分布变化。