梨病毒病及无病毒化栽培概述

概述了中国梨的几种重要病毒病:梨环纹花叶病毒病(PRPMV)、梨脉黄病毒病(PVYV)、榅桲矮化病毒病(QSV)、苹果茎沟病毒病(ASGV)、梨石痘病毒病(PSPV)及其危害性,较全面地介绍了目前梨病毒病的几种检测方法。现在研究认为,以PCR技术和核酸分子杂交技术为基础的分子生物学方法结合较成熟的ELISA检测以及电镜观察能比较准确、快速地检测出中国梨的病毒病;热处理、茎尖培养、微体嫁接、化学制剂处理及其联合应用为梨病毒的脱毒提供了有效途径;并根据梨无毒苗的生长特点提出了梨无病毒化栽培的管理技术。     

不同系统梨种质遗传多样性与分类关系的SSR分析

利用SSR分子标记技术深入探讨了梨主要栽培种白梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)、砂梨(Pyrus pyrifolia(Burm.f.)Nakai)、秋子梨(Pyrus ussuriensis Maxim.)、西洋梨(Pyrus communis L.)、新疆梨(Pyrus sinkiangensis Yü)和野生种以及种间杂交新选育品种共150份资源的遗传多样性、亲缘关系以及系统分类地位.通过筛选出的25对SSR引物共检测到407个位点,不同引物检测位点数5-25个,其中多态性位点数390个,占检测位点的95.82%,检测位点杂合度为0.4～0.7,不同品种间的遗传多样性指数为0.67-1.00.应用NTSYS-pc2.0l软件,以非加权数据分析法(UPGMA)对获得的多态性位点进行聚类分析,系统聚类结果将150份梨种质分为2大类群,即西洋梨和东方梨类群.西洋梨类群包括了西洋梨品种及具西洋梨亲缘的种间杂交品种.东方梨类群包括了中国白梨、砂梨、秋子梨、新疆梨、野生资源以及日韩梨品种,在相似系数0.708处又分为2大组,并可细分为7个亚组.其中,中国的白梨、砂梨和秋子梨相互交错在一起,没有独自成组.中国砂梨表现出最丰富的遗传多样性;其次是中国白梨.日本梨与中国砂梨表现了高度的亲缘关系,并且没有独立成组.多数新选育品种的遗传关系表现出趋母本聚类型或趋父本聚类型.     

梨品系85-10-10果实发育规律研究

[目的]研究梨品系85-10-10的果实发育规律。[方法]对新疆塔里木大学杂交梨新品系85-10-10的果实进行生长发育规律研究。[结果]结果表明,杂交梨85-10-10母株和其高接繁殖营养系二者果实生长都呈S型生长曲线,前期都是纵径生长较快,超过横径,具有形成大果的潜在基础。[结论]该研究结果为制定梨品系栽培技术提供理论依据。     

地高辛标记探针检测5种葫芦科作物病毒的斑点杂交方法

 【目的】探索5种葫芦科作物病毒即小西葫芦黄花叶病毒（Zuccini yellow mosaic virus，ZYMV）、西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、番木瓜环斑病毒西瓜株系(Papaya ringspot virus watermelon strain，PRSV-W)和南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus，SqMV)的斑点杂交检测技术，为葫芦科作物种子带毒的快速准确鉴定、流行病学研究和转基因检测等提供技术和方法。【方法】以构建的重组质粒为模板，用PCR方法合成了相应的地高辛标记的cDNA探针。通过斑点杂交检测西葫芦病叶汁液来考察探针的灵敏性和特异性。同时设计了3种不同长度的SqMV探针（0.55、1.6、2.7 kb）对杂交效果进行了研究。【结果】ZYMV、WMV、CMV、PRSV-W和SqMV的5种探针检测各自侵染西葫芦病汁液的稀释低限分别为1﹕160、1﹕160、1﹕320、1﹕160、1﹕320，而每种探针与健康西葫芦和其它4种病毒的反应均为阴性。不同长度的SqMV探针杂交结果相同。【结论】用PCR方法合成的地高辛标记的探针，能够直接在植物组织中将5种病毒检测出来，具有较好的灵敏性、特异性和重复性。探针的长度对杂交的灵敏性和特异性没有影响。     

H3亚型猪流感病毒HA基因核酸探针的制备与应用

以地高辛(DIG)标记H3亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的保守片段制成核酸探针,与H3及H1亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的cDNA、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的DNA、猪瘟病毒(CSFV)cDNA、猪伪狂犬病病毒(PRV)的DNA进行斑点杂交,检测探针的特异性.结果显示,该探针仅与H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA杂交呈阳性,与其余病毒杂交呈阴性;敏感性试验结果显示,探针最低能检出约6 pg/μL的H3亚型的SIV RT-PCR产物.应用该探针对35份疑似SI临床病料进行检测,结果检出4份阳性病料,与RT-PCR检测结果一致.研究表明,建立的DIG标记的核酸探针特异性强,敏感性高,适合于对H3亚型SI的诊断和流行病学调查.     

利用斑点杂交法和RT-PCR技术检测甘蔗花叶病毒

利用地高辛标记不同长度的 DNA探针通过斑点杂交法对甘蔗花叶病毒进行检测 .结果表明 ,可检测出2 0 0 mg稀释度为 1/10 4 病叶中的病毒 .但不同长度的探针表现出一定的差异 ,较长的探针显示出较高的灵敏度 .根据克隆所得的病毒基因序列设计特异引物 ,利用反转录 -聚合酶链式反应的方法进行检测 ,同样得到较好的检测效果 ,但灵敏度略低于杂交检测 .     

生物素标记cDNA探针检测苹果锈果类病毒

以含苹果锈果类病毒(ASSVd)全长序列的重组质粒PUC为模板DNA,加入ASSVd类病毒特异性引物,应用聚合酶链式反应技术(PCR)合成了生物素标记的cDNA探针,在斑点杂交反应中,探针最适使用浓度为1/10,探针检测感病的ASSVd类病毒的最大稀释倍数是1/100。利用制备的探针进行田间检测,结果与RT-PCR检测结果一致,阴性对照均无杂交信号出现。     

猪瘟病毒基因芯片检测技术的建立与应用

应用寡聚核苷酸基因杂交技术建立一种快速可靠的检测猪瘟病毒的方法.在CSFV病毒保守序列5′非编码区设计了两对特异性引物,在此引物之间设计了特异的核苷酸探针(22～30 mer).通过PCR扩增Cy5标记的DNA片段与固定在玻片表面的探针杂交进行CSFV检测.该技术结合了PCR方法的高度敏感性和DNA-DNA杂交技术的选择特异性.并利用该方法对87例临床样品进行了检测鉴定,结果分析显示,可准确鉴别CSFV病毒,灵敏度与琼脂糖凝胶检测接近,可检测到的质粒最低浓度为0.4 pg/μl.结果表明寡核苷酸基因芯片技术可有效地应用于CSFV临床诊断和分子流行病学调查.     

应用RT—PCR、斑点杂交法和SDS—PAGE检测水稻黑条矮缩病毒

用RT－PCR技术、PCR标记的探针点杂交和SDS－PAGE检测了生产上严重危害玉米和水稻的水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）。由RT－PCR扩增的RBSDV第7片段第921－1411碱基作探针，用PCR法DIG标记后点杂交，可以从100ng玉米病叶中检测到RBSDV，灵敏度是RT－PCR的1／10；10％SDS－PAGE只能检测到从1g玉米病叶中提取的病毒dsRNA，但对江苏玉米田间分离的不同的RBSDV样品电泳发现，该病毒基因组dsRNA有差异，表明该技术是研究RBSDV基因组多样性的简单有效的方法。     

梨树感染茎沟病毒后生长速度与内源激素的变化

对感染茎沟病毒的2年生梨幼树和梨苗的干径、株高及枝梢生长速度进行了测定，同时还分析了接种茎沟病毒的梨苗内源激素（吲哚乙酸、赤霉素和细胞分裂素）的变化。结果表明，感染茎沟病毒（SGV）后植株生长速度显著降低，其中2年生梨树的干径生长速度降低63.0%，茎高降低58.0%，枝梢长降低51.0%；梨幼苗干茎降低11.7%，苗高降低13.5%。试验不发现，梨幼苗感染茎沟病毒后长缓慢主要与生长期几种促进生长的内源激素大幅下降有关，其中IAA、GA3、CTK分别降低15.0%、19.0%和59.0%。     

Dot-Blot Hybridization for Detection of Five Cucurbit Viruses by Digoxigenin-Labelled cDNA Probes

Dot-blot hybridization was applied in this paper to detect five viruses infecting cucurbitaceous crops,Zuccini yellow mosaic virus(ZYMV),Watermelon mosaic virus(WMV),Cucumber mosaic virus(CMV),Papaya ringspot virus watermelon strain(PRSV-W)and Squash mosaic virus(SqMV),as a good alternative assay in seed health test and epidemiological and transgenic research.Digoxigenin-labelled cDNA probes of the five viruses were synthesized by PCR with the specific primers and applied in dot-blot hybridization to detect five viruses in crude extraction of the infected leaves.And three SqMV probes of different lengths(0.55,1.6,and 2.7 kb,respectively)were designed to investigate the effect of hybridization.The results showed that the sensitivity for detecting the crude extraction of infected leaves by ZYMV,WMV,CMV,PRSV-W,and SqMV was down to 1160,1160,1320,1160,and 1320,respectively.Three SqMV probes of different length showed no differences on the sensitivity and specificity.The digoxigenin-labelled probes prepared by PCR could be used for accurate and rapid identification of 5 viruses infecting cucurbitaceous crops with good stabilities,sensitivities,specificity,and reproducibilities.     

建立环介导间接PCR同时检测3种主要猪源性病毒

 【目的】建立同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的环介导间接PCR方法,实现3种病毒快速检测。【方法】根据GenBank数据库中猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的核苷酸序列设计3对特异性探针,利用PCR技术分别标记于大豆Lectin基因片段的两端形成3种不同的报告基因,此标记的报告基因与3种待测靶标基因经杂交、缺口补平、环化后,采用1对引物反向PCR扩增报告基因,建立了PCV2、CSFV和PRRSV的环介导间接PCR检测方法,扩增片段大小分别为564 bp、434 bp和338 bp,该方法即可用于单病毒检测又可用于多病毒检测。【结果】灵敏度和特异性试验结果表明,无论是单病毒检测还是多病毒检测,该法都具有高度特异性,与其它病原检测无明显交叉反应;对PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒同时检测的底限分别为0.8、25和6.2 pg•μL-1,和单个病毒的检测灵敏度相同。利用环介导间接PCR和常规PCR对20份临床样本进行比较检测,结果表明,无论单病毒检测还是多病毒检测,其结果均与常规PCR检测结果完全一致。【结论】环介导间接PCR检测技术可用于PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒的同时检测,是一种简便快速、灵敏、特异的病原学诊断工具。     

鸡传染性支气管炎病毒地高辛标记探针检测方法的的建立和应用

根据GenBank中已经发表的IBV N基因的保守序列,设计合成一对引物,利用RT-PCR技术扩增IBVN基因的582 bp的核酸片段,并制备出地高辛标记的IBV核酸探针。特异性检测结果表明,该探针能与不同毒株的IBV核酸发生特异性杂交,而与对照的NDV、鹅副粘病毒的核酸杂交反应为阴性;敏感性检测结果表明,该探针对IBV的最低检出量为10 pg,显示所制备的核酸探针用于IBV的检测是可行的。     

草莓斑驳病毒的分子杂交检测

为探索分子杂交技术在草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus,SMoV)检测中的运用,利用CTAB法从草莓叶片中提取总核酸,并以此为模板,利用特异引物扩增SMoV非编码区序列,经克隆、测序获得SMoV非编码区序列。系统进化分析结果显示:本研究中的分离物与GenBank中已报道的分离物的亲缘关系较远,独立形成1个小的进化支。以带有病毒特异片段的质粒为模板,运用PCR技术制备了地高辛标记的cDNA探针。以草莓感染SMoV叶片为试材,利用地高辛标记探针可有效检测草莓叶片中的SMoV,草莓总核酸样品稀释10倍后仍可有效检测。     

生物素标记IBDV─RNA探针的制备及其对IBDV─RNA检测的初步研究

以传染性法氏囊病毒强毒株接种９日龄鸡胚尿囊腔，待鸡胚死亡后，收集其尿囊液，提取病毒。纯化的病毒ＲＮＡ在３％琼脂糖凝胶电泳上呈现出２９０ｂｐ和３４００ｂｐ的两条带。收集这两条带，以病毒全基因组制备生物素标记的探针。此探针有良好的特异性。它不与其它３种禽类病毒（ＮＤＶ，ＩＢＶ，ＩＬＶ）的核酸抽提物发生交叉反应。此试验是快速、敏感、可重复的。其敏感度达０．５ｐｇ。     

生物素标记IBDV─RNA探针的制备及其对IBDV─RNA检测的初步研究

以传染性法氏囊病毒强毒株接种９日龄鸡胚尿囊腔，待鸡胚死亡后，收集其尿囊液，提取病毒。纯化的病毒ＲＮＡ在３％琼脂糖凝胶电泳上呈现出２９０ｂｐ和３４００ｂｐ的两条带。收集这两条带，以病毒全基因组制备生物素标记的探针。此探针有良好的特异性。它不与其它３种禽类病毒（ＮＤＶ，ＩＢＶ，ＩＬＶ）的核酸抽提物发生交叉反应。此试验是快速、敏感、可重复的。其敏感度达０．５ｐｇ。     

8种猪呼吸道和繁殖障碍病病原体GeXP检测方法的建立

【目的】建立了一种同时鉴别H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎、猪圆环病毒病、猪细小病毒病和猪伪狂犬病8种病毒性呼吸道和繁殖障碍病病原体的GeXP 高通量检测方法。【方法】根据这8种病原体的基因保守序列,设计并合成了9对特异性引物, 在每对特异性引物的5′端均加上一段通用引物,形成特异性嵌合引物。运用GeXP单重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA为模板验证引物的可行性;建立GeXP多重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA模板、阳性cDNA/DNA混合模板验证GeXP多重检测体系的特异性和准确性;将含猪圆环病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒靶基因的克隆质粒及体外转录的RNA（H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎）分别梯度稀释为10³,10²,10¹拷贝/µL,运用GeXP多重PCR方法进行单一病原体灵敏度分析;根据单一病原体的灵敏度分析结果,优化各对特异性嵌合引物的工作浓度,将含有体外转录好的6种RNA模板和3种克隆质粒等量混合,将混合物梯度稀释为10⁴,10³,10²,10¹拷贝/µL,运用GeXP多重PCR方法分析同时检测8种病原体的灵敏度。运用建立好的GeXP多重检测体系对23份临床样品进行检测,并与常规单重PCR进行比较,对该GeXP多重检测体系的临床应用进行评价。【结果】基于GeXP系统的单重PCR检测体系和GeXP多重PCR检测体系均能扩增出特异性片段,验证了引物的可行性、GeXP多重检测体系的特异性和准确性;GeXP多重检测体系的单一病原模板灵敏度分析结果显示,多重检测体系对单一病原体检测的下限均为10¹拷贝/µL;GeXP多重检测体系在8种病原体同时检测的灵敏度分析结果显示,多重检测体系可在10³拷贝/µL水平可同时检测到8种病原体;比较GeXP多重PCR检测方法和常规PCR方法对临床样品的检测结果,两种检测方法的检测结果相符。【结论】成功建立了基于GeXP系统的多重PCR检测体系,可以同时检测8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体;本研究建立的同时鉴别8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体的GeXP检测方法具有高通量、特异性强和灵敏度高的特点,为猪病毒性呼吸道和繁殖障碍性疾病的分子诊断提供了新型的检测方法。     

猪病毒性繁殖障碍病低密度基因芯片诊断方法的建立

应用PCR(或RT-PCR)分别扩增猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒-2型、日本乙型脑炎病毒和猪瘟病毒的一段保守序列,克隆到pMD 18-T Simple Vector构建重组质粒,用于制备各病毒的探针。将各探针按一定的阵列点加到硝酸纤维素膜上并加以固定,制备成低密度检测基因芯片。在多重PCR扩增过程中用生物素标记的dUTP(Bio-11-dUTP)对待检样品进行标记,扩增产物与芯片杂交,用扫描仪对杂交结果进行扫描分析。经对68份样品检测结果证明,该方法可以同时检测待检样品中上述6种病毒核酸的存在情况,与PCR方法相比,显示了较高的灵敏度。该方法的建立,为大批量快速诊断、普查猪病毒性繁殖障碍疫病提供了保证。     

鸡3种主要DNA病毒多重感染复合PCR检测方法的建立

依据Gen Bank中注册的鸡马立克氏病病毒(MDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡痘病毒(FPV)基因组核苷酸序列中的保守序列设计引物,3种病毒各设计3对引物,共计9对引物,经生物学软件筛选后,得到3对相互匹配较佳的引物。3对匹配引物经单一PCR验证后,优化复合PCR反应条件,确定最佳的退火温度、引物浓度和Taq DNA聚合酶浓度;经特异性、敏感性试验及简化PCR试验,建立简易复合PCR检测方法。复合PCR扩增出的3条带大小与预期一致,即228 bp(MDV)、400 bp(ILTV)、499 bp(FPV);建立的复合PCR方法能同时检测出100 fg MDV、ILTV、FPV的DNA。同时依据PCR技术原理,将经典的三温热循环改进为二温热循环试验,即将退火和延伸合并为一步(62℃),缩短了反应时间。建立的3种病毒的复合PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性,可以用于临床病料的快速诊断。