尿激酶原基因cDNA在BHK21细胞中的表达

将人尿激酶原（Ｐｒｏ－ＵＫ）基因ｃＤＮＡ分别插入到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子和ｐＳＶ２－ｎｅｏ的ＳＶ４０启动子下游,构建了重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ,分别将这两种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞。ＥＬＩＳＡ检测结果表明,ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ在哺乳动物细胞中能够表达,７２ｈ表达量分别为２８．７ｎｇ／ｍｌ和１３．５ｎｇ／ｍｌ。     

诸葛菜基因启动子的分离

利用启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ２首次从诸葛菜总ＤＮＡ中克隆了７个具有启动功能的ＤＮＡ片段，转化Ｅ．ｃｏｌｉ表明最高卡那霉素（ｋｎａ）抗性为１４０μｇ／ｍｌ，最低为２０μｇ／ｍｌ。含启动子片段的７个重组质粒子分别命名为ｐＳＵＰＺ１－７，Ｓｏｕｔｈｒｅｎ印迹表明ｐＳＵＰＺ６对Ｋｎａ的抗性功能来源于诸葛菜的１０ｋｂ，５ｋｂ和３．９ｋｂ片段。     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA真核表达质粒的构建与鉴定

将组织型纤溶酶原激活剂基因ｃＤＮＡ经多次亚克隆插入到真核表达载体ｐＳＶＬ的ＳＶ４０启动子和ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游,构建了重组表达质粒ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ。经酶切和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定,ｔ－ＰＡ基因的插向正确,可用于哺乳动物细胞和个体表达系统中表达。     

含有IBV S1基因的昆虫杆状病毒表达载体的构建

以含有鸡传染性支气管炎病毒Ｈｏｌｔｅ株Ｓ１基因的重组质粒ｐＵＣ１８－Ｓ１．Ｈｏｌｔｅ和ｐＵＣ１８－Ｓ‘１．Ｈｏｌｔｅ为材料,分别构建了可表达ＩＢＶ Ｓ１基因的昆虫杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３－Ｓ１．Ｈｏｌｔｅ（含ＩＢＶ先导序列）,ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３／４－Ｓ１．Ｈｏｌｔｅ（ＩＢＶ先导序列为融合短肽）,ｐＡｃＧＨＬ－Ｃ－Ｓ１,Ｈｏｌｔｅ。     

IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建

利用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），扩增克隆传染性法低囊病病毒超强毒（ｖｖＩＢＤＶ）ＨＺ株ＶＰ２基因，并ＶＰ２基因进行全序列测定、序列分析和聚类分析，同时将ＶＰ２基因与真核表达载体ｐｃＮＤＡ３相连接。结果克隆到ＶＰ２基因全序列长１３５６ｂｐ，分析表明ＨＺ株与欧洲超强毒株ＵＫ６６１高度相似，同时将ＶＰ２基因正向插入ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游，得到了ＶＰ２基因的真核表达质粒。为ＩＢＤＶ分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础。     

鸡白细胞介素-2 cDNA克隆

用哺乳动物细胞表达克隆系统克隆了鸡ＩＬ－２ｃＤＮＡ。以ＣｏｎＡ（２０μｇ／ｍＬ）诱导ＳＰＦ鸡脾脏淋巴细胞,第２０小时收集细胞,提取ｍＲＮＡ,以ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍｆｏｒｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ试剂盒合成ｃＤＮＡ,定向连结于穿梭质粒ｐＳＶ·ＳｐｏｒｔⅠ,构建ｃＤＮＡ文库。将文库分组提取重组质粒,转染ＣＯＳ－７细胞,表达ｃＤＮＡｓ。以淋巴细胞增殖试验检测表达产物ＩＬ－２活性。经过３轮筛选,获得１４个具有ＩＬ－２活性的克隆。选择其中４个进行酶切分析,结果显示这４个ｃＤＮＡ大小分别为１．５,１．０,０．８和０．８ｋｂ。     

家蚕核多角体病毒Lef—1和DA26基因的克隆及部分序列分析

ｌｅｆ－１和ＤＡ２６基因分别位于ｅｇｔ基因的上游和下游．从ｐＵＡｃ－ｅｇｔ中分离出ＥｃｏＲＩ－ＸｂａＩ１．１ｋｂ的ｅｇｔ基因片段，进行缺口平移标记，获得探针。与ＢｍＮＰＶＤＮＡ经ＨｉｎｄⅢ酶切、电泳、转移至ＮＣ膜的ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交，发现ＢｍＮＰＶＤＮＡ的ＨｉｎｄⅢＤ片段呈阳性。从ＢｍＮＰＶ基因组中分离出１０．４ｋｂ的ＨｉｎｄⅢＤ片段，用ＥｃｏＲＩ酶切得到ＨｉｎｄⅢ－ＥｃｏＲＩ２．２ｋｂ、ＥｃｏＲＩ１．４ｋｂ和ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ６．８ｋｂ３个片段，分别克隆于ｐＵＣ１９中，命名为ｐＵＨＥ２．２、ｐＵＥ１．４和ｐＵＥＨ６．８。经双链测序并与ＡｃＮＰＶ相关基因序列进行比较，发现ｌｅｆ－１基因被克隆于ｐＵＨＥ２．２中，ＤＡ２６基因克隆于ｐＵＥＨ６．８中。从所测定的ｌｅｆ－１和ＤＡ２６基因的启动子及５＇端部分序列来看，它们在ＡｃＮＰＶ和ＢｍＮＰＶ之间有极高的同源性。     

尿激酶原基因在小鼠体内的表达

将构建的２种重组表达质粒ｐＳＶ２－ｕＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｕｐＡ分别直接注入小鼠骨骼肌,观察了Ｓｃｕ－ＰＡ ｃＤＮＡ在小鼠体内的表达情况。体外凝血试验显示注射质粒ＤＮＡ后,第５ｄ凝血时间有所延长,第１５ｄ凝血时间延长幅度最大,较对照组平均延长６ｍｉｎ左右;第２０ｄ体内诱导产生ＤＩＣ,体外凝血时间试验组较对照组延长一倍,抗凝效果明显,２种表达质粒在体内的表达水平无明显差异。     

从重组人Bcl-2质粒中制备pBluescript Ⅱ KS(-)载体

目的：从重组人Ｂｃｌ－２质粒中制备对基因重组和ＤＮＡ测序等有用的ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ（－）载体。方法：先将重组人Ｂｃ１－２质粒转化ＤＨ５α菌株,小规模制备此质粒ＤＮＡ,然后从低熔点琼脂糖凝胶中回收其中用ＥｃｏＲⅠ酶切的线性ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ（－）载体,用Ｔ４ＤＮＡ连接酶催化连接并再次转化ＤＨ５α细菌,并用限制酶切鉴定,最后进行冻存和大量制备及纯化。结果：限制酶切分析证明两次转化的细菌分别是含重组人Ｂｃｌ－２质粒和ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ（－）载体的工程菌。实验还大量制备了这两种质粒或载体ＤＮＡ,并用聚乙二醇沉淀法进行了纯化。结论：利用分子生物学技术成功地从重组人Ｂｃｌ－２质粒制备出ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ（－）载体。     

根癌农杆菌介导的mMT-IcDNA转化枸杞及其表达的研究

报道了小鼠金属硫蛋白－ＩｃＤＮＡ通过根癌农杆菌介导转入枸杞,并在枸杞体内表达产生富集锌的转基因枸杞。用带有嵌合ｍＭＴ－ＩｃＤＮＡ及ｃａＭＶ３５ｓ启动子的含非致癌性Ｔｉ质粒载体的概癌农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｃａＭＶ３５ｓ：ｍＭＴ－ＩｃＤＮＡ：ｎｏｓ）感染枸杞幼茎外植体,在含有Ｋｍ１００μｇ／ｍｌ和Ｚｎ＾２＋５０μｍｏｌ／Ｌ的选择培养基上筛选转化的愈伤组织,并在含Ｋｍ５０μｇ／ｍｌ,Ｚｎ＾２＋１００μｍ     

拟南芥ATLP-3基因在转基因烟草中的整合和表达

将拟南芥ＡＴＬＰ－３基因从质粒ｐＵＣＴＬ亚克隆到植物表达载体ｐＢＩ１２１中,得到了质粒命名为ｐＢＩＴＬ。被亚克隆到重组质粒ｐＢＩＴＬ的ＡＴＬＰ－３基因通过农杆菌ＬＢＡ４４０４介导法导入烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｂａｃｃｏ Ｌ．ｖａｒ Ｇｅｘｉｎ Ｎｏ．１）。通过卡那霉素抗性筛选,得到１９株再生烟划植株。ＰＣＲ（用根据ＣａＭＶ３５ｓ启动子和ＮＯＳ终止子序列合成的引物）分析表明,ＡＴＬＰ－基因是在     

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

本文报道采用反转录酶—聚合酶链式反应，体外扩增芜菁花叶病毒（ＴｕＭＶ）外壳蛋白基因及其克隆，并在大肠杆菌中获得表达的结果；从抗州市郊区感病的油菜上分离到一株致病力极强的芜菁花叶病毒分离物，提纯后，经５０ｎｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ和０．５％ＳＤＳ处理，苯酚／氯仿和氯仿抽提两次，酒精沉淀，获得了纯化的病毒ＲＮＡ，该ＲＮＡ与ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）＿（１５）退火后，在ＡＭＶ反转录酶的作用下合成了单链ｃＤＮＡ，然后加入用以扩增ＴｕＭＶ－ＣＰ基因的上下游引物，３５个循环后，得到了一条长约０．８５ｋｂ的片段，将该片段克隆到ｐＵＣ１８质粒的ＳａｌⅠ限制性酶切位点，分析了限制性酶切图谱，分析表明该片段含有ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ以及引物设计时带人的ＭｃｏⅠ三个酶切位点，该片段克隆到大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）原核表达载体ｐＫＫ２３３－２质粒的ＮｃｏⅠ和ＨｉｎｄⅡ位点后，经ＩＰＴＧ诱导，以该病毒的抗血清为第一抗体，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测该基因的表达产物，结果表明该基因的表达产物为ＴｕＭＶ－ＣＰ蛋白，因而认为所获得的扩增片段确为芜菁花叶病毒外壳蛋白基因。     

人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因农杆菌工程菌株的构建

采用固相亚磷酸三酯法人工化学合成了人胰岛素样生长因子－Ⅰ（ｈｕＩＧＦ－Ｉ）基因的４条寡核苷酸 片段，再通过片段１、２与３、４末端互补配对和Ｋｌｅｎｏｗ酶促补平及酶切连接成为完整的ｈｕＩＧＦ－ＩＤＮＡ片段，用 ＥｃｏＲ　Ｉ／ＰｓｔＩ酶切后克隆于 ｐＧＥＭ Ｔ－Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ，经测序证明所得 ＤＮＡ序列与设计的序列完全一致；选用植物 偏爱密码子校正了启始密码子ＡＴＧ下游的６个密码子，并在ＡＴＧ处增加Ｋｏｚａｋ序列后，插入ｐＢＩ１２１的ＢａｍＨＩ／ ＳａｃＩ位点，构建了以 ３５Ｓ为启动子的植物表达载体；以 Ｈｉｎｄ ＩＩ／ＥｃｏＲＩ切下“３５Ｓ－Ｋｏｚａｋ－ＩＧＦ－Ｉ－ＮＯＳ（ｔｅｒ．）”插入 ｐＣＡＭＢＩＡ２３００之Ｈｉｎｄ ＩＩ／ＥｃｏＲ　Ｉ位点，构建成ｈｕＩＧＦ－Ｉ植物表达载体；通过ＣａＣｌ２直接转化法将表达载体导入农 杆菌ＥＨＡ１０５（Ｒｉｆ．ｒ），并以菌落原位杂交技术和 ＤＮＡ ｄｏｔ ｂｌｏｔ对重组农杆菌进行了筛选，所获得的重组农杆菌菌株为培育ｈｕＩＧＦ－Ｉ豆药用植物奠定了基础。     

牛生长激cDNA的表达与检测

利用低融点琼脂糖凝胶电泳，回收牛生长激素ｃＤＮＡ全序列，克隆于原核表达载体ＰＴ７７－７中Ｔ７启动子下游，转化大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α，经分离，酶切分析，获得６个牛生长有质粒ＰＴＧＨ１－６，选取其中两质粒ＰＴＧＨ１１－２，转化Ｅ．ｃｏｌｉＫ８３＝ｐＧ１－２，４２℃诱导３０ｍｉｎ，收集，破裂菌体，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测，于２２ＫＤ处有一特异性蛋白带，经ＳｈａｍａｄｚｕＣＳ９３０扫描测定，其表达量     

旋毛虫肌幼虫ES抗原基因TSPGⅡ在真核细胞中的表达

用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ从克隆载体ｐＵＴＳⅡ中工出一个０．９８８ｋｂＴＳＰＧⅡ基因,经ＥｃｏＲⅠ和ＢｓｔＸⅠ酶切鉴定;表达载体用相同的酶切,经琼脂糖凝胶电泳,分别回收ＴＳＰＧⅡ基因和ＰＳＶ．ＳＰＯＲＴⅠ表达载体,用Ｔ４ＤＮＡ连接酶定向接连,转化大肠杆菌感受态细胞,挑取重组,经ＥｃｏＲⅠ,ＢｓｔＸⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切鉴定,构建了重组表达质粒ＰＳＶ．ＴＳⅡ。利用脂质体作载体,将重且表达质粒转     

马传染性贫血病病毒L株前病毒全基因组核苷酸序列分析

 本实验所用的马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）Ｌ株（ＥＩＡＶ－Ｌ）是我国研制成功的ＥＩＡＶ弱毒疫苗的原始强毒株。以ＥＩＡＶ－Ｌ感染马外周血液白细胞中ＤＮＡ为模板，利用ＰＣＲ技术，分４个片段扩增ＥＩＡＶ－Ｌ前病毒ＤＮＡ，并分别克隆到载体质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ中，得到 ４个重组质粒ｐ２．８、ｐ２．４、ｐ３．１和 ｐ１．２，经酶切鉴定后测序。对测序结果分析、拼接，得到 ＥＩＡＶ－Ｌ前病毒基因组全序列。ＥＩＡＶ－Ｌ前病毒基因组全长 ８２３５ｂｐ，其中 Ｇ＋Ｃ含量为 ３８％。通过使用计算机软件ＤＮＡＳＩＳ分析，ＥＩＡＶ－Ｌ与马传贫驴强毒和马传贫驴白细胞疫苗毒序列同源性分别为９８．４％和９６．９％。同源性如此接近反映了它们之间的亲缘关系，另外 ＥＩＡＶ－Ｌ与驴强毒的同源性高于其与驴白细胞弱毒疫苗株的同源性，这符合驴白细胞弱毒疫苗株的衍生过程。基因组两端是长为３１６ｂｐ的ＬＴＲ，其中Ｕ３为１９７ｂｐ，Ｒ为８０ＢＰ，Ｕ５为３９ｂｐ。前病毒基因组有 ３个较大的开放阅读框架（ＯＲＦ），分别编码 ｇａｇ、ｐｏｌ和 ｅｎｖ基因。ｇａｇ基因位于 ７１３～１９１２位碱基之间，全长１２００ｂｐ；ｐｏｌ基因位于 １７０８～５１０９位碱基之间，全长     

PEG法GUS基因在水稻原生质体及其愈伤组织中的瞬间表达初报

本文作者构建了ｐＸＭ１和ｐＧＣＹ６两个质粒，其中质粒ｐＸＭ，含有高赖氨酸基因和ＧＵＳ报告基因，质粒ｐＧＣＹ６则由裂解多肽Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｂ基因和ＧＵＳ基因组成。这两个基因均以ＣａＭＶ３５Ｓ作为启动子，以ＮＯＳ作为终止子。经纯化的质粒ＤＮＡ以ＰＥＧ法导入４个水稻品种：８９－２、Ｌａｃｃａｓｉｎ、Ｃｙｐｒｅｓｓ、台北３０９细胞悬浮系的原生质休中，组织化学检测结果表明，ＧＵＳ基因在原生质体、愈伤组织及     

旋毛虫ES抗原结构基因TSPGⅡ重组表达质粒构建

用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ,从克隆载体ｐＵＴＳⅡ中切出一个０．９８８ｋｂＴＳＰＧⅡ基因,经ＥｃｏＲＩ和ＢｓｔＸＩ酶切鉴定,同时表达载体也用相同的酶进行酶切,经琼脂糖凝胶电泳,分别回收ＴＳＰＧⅡ基因和ｐＳＶ·ＳＰＯＲＴⅠ表达载体,用Ｔ４ＤＮＡ连接酶定向连接,转化大肠杆菌感受态细胞,挑取重组子,经ＥｃｏＲⅠ,ＢｓｔＸⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切鉴定,构建了重组表达质粒ｐＳＶ·ＴＳⅡ．     

苜蓿花叶病毒复制酶（P2亚基）基因全长cDNA植物表 …

利用含有苜蓿花叶病毒中国分离株（ＡＩＭＶ－Ｃｈ）复制酶（Ｐ２亚基）基因编码区５’端ｃＤＮＡ（１３０６ｂｐ）的重组质粒ｐＡＭ５和编区３’端及其非编码区（１２３４ｂｐ的重组质粒ｐＡＭ３构建了含有复制（Ｐ２亚基）基因全长ｃＤＮＡ及其３’端非编码区的重组质粒ｐＡＭ３５,并将其重组于植物表达载体ｐＧＡ６４３,构建其正链ＲＮＡ的表达载体ｐＧＡ３５,为进一步开展转基因研究创造条件。     

番茄乙烯形成酶基因的克隆及其反义基因的表达载体构建

从成熟的番茄果实中提取总ＲＮＡ,进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增合成乙烯形成酶ｃＤＮＡ,并将其克隆至载体Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ的ＥｃｏＲＶ位点,经限制酶谱分析,构建亚克隆进行全序列测定和序列分析。将所克隆基因以反义基因的形式定向重组到载体ｐＳＰＲＯＫ上,同时将带有完整启动子和终止子的标记基因ＢＡＲ基因引入ｐＳＰＲＯＫ中,最终获得表达乙烯形成酶反义基因和ＢＡＲ基因的植物表达载体ｐＢＡＲ－ＥＦＥ。