永生化猪视网膜色素上皮细胞的建立及初步应用

【目的】建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系，为病毒学研究提供一种新的细胞材料。【方法】合成猪腺病毒3型E1基因，将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中，构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1，进行PCR和测序鉴定。提取pCI-neo-E1质粒，转染原代猪视网膜色素上皮细胞，用新霉素G418筛选猪永生化视网膜色素上皮细胞系（RPECs）。检测RPECs的角蛋白18和19，通过细胞计数测定其生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期，并对其进行染色体核型分析。分别将猪流行性腹泻病毒（PEDV）CV77毒株、猪圆环病毒2型（PCV2）DBN-SX07株和猪伪狂犬病毒（PRV）Bartha-K61株接种RPECs，同时将PEDV CV77毒株接种绿猴肾细胞（Vero细胞）,将PCV2 DBN-SX07株接种猪肾细胞（PK15细胞），将PRV Bartha-K61株接种仓鼠肾成纤维细胞（BHK细胞），观察细胞病变效应（CPE），并采用间接免疫荧光法测定病毒的滴度。【结果】PCR和测序结果显示，真核表达质粒pCI-neo-E1构建成功。将pCI-neo-E1转染原代猪视网膜色素上皮细胞，经G418筛选得到永生化细胞株，该细胞株表达角蛋白18和19，传代50代仍保持上皮样细胞形态，增殖活性良好，细胞周期及染色体核型特征与正常的二倍体细胞一致。PEDV CV77毒株感染猪RPECs 24 h后，CPE明显，滴度为10^5.25TCID₅₀/mL，低于其在Vero细胞中的滴度（10^8.125 TCID₅₀/mL）。PCV2 DBN-SX07毒株感染猪RPECs后可产生明显CPE，病毒滴度为10^6.125TCID₅₀/mL，略高于其在PK15细胞上的滴度（10^6.0TCID₅₀/mL）。PRV Bartha-K61毒株感染猪RPECs后，CPE明显，病毒滴度为10^8.75 TCID₅₀/mL，略低于其在BHK上的滴度（10^8.875 TCID₅₀/mL）。【结论】成功构建了永生化猪视网膜细胞系，可用于猪源病毒的培养，尤其是培养PCV2可产生明显CPE，易于观察，为后续开展疫苗工艺的提升提供了一种新的细胞材料。     

京津冀地区猪圆环病毒3型的全基因组克隆与分析

【目的】监测近期在京津冀地区流行的猪圆环病毒3型毒株及其基因变异情况。【方法】以近期京津冀地区猪圆环病毒3型阳性临床样品为模板，用PCR技术扩增猪圆环病毒3型全基因组片段，随后进行基因克隆、序列测定和序列分析。【结果】PCR扩增、序列测定和BLAST比对结果显示获得4株大小都为2 000个核苷酸的猪圆环病毒3型全基因组序列。基于全基因组核苷酸分析结果显示，这4株猪圆环病毒3型与选取的国内外15株猪圆环病毒3型的同源性均达98.4%以上，系统发育树显示上述PCV3毒株所处的分支虽有所不同但却都非常近，表明不同猪圆环病毒3型毒株之间的全基因组核苷酸有非常高的同源性和保守性。基于开放阅读框2基因核苷酸的系统发育树显示上述猪圆环病毒3型毒株被分成3个分支，所得4株猪圆环病毒3型分别归属于基因型a与c,并呈现出一定的地域差异。【结论】获得了京津冀地区4株猪圆环病毒3型全基因组序列，虽然它们具有很高的全基因组核苷酸同源性与保守性，但却分属于2种基因型，并呈现出一定的地域差异。     

2株猪圆环病毒2型的分离鉴定及全基因组序列分析

【目的】对河南部分地区疑似猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染猪进行病毒分离鉴定,并对分离株的全基因组序列进行分析。【方法】对郑州、焦作两地疑似PCV2感染的猪淋巴结、脾脏和肺脏组织进行PCR检测,对检测为阳性的病料进行PCV2的分离,利用间接免疫荧光试验和PCR扩增进行初步鉴定。用PCR扩增PCV2全基因,经克隆、测序后,用MEGA5.1软件对克隆的序列与GenBank上获取的其他PCV2全基因组进行序列比对。【结果】分离到2株病毒,分别命名为ZHENGZ-12株和JIAOZ-12株。间接免疫荧光试验结果显示,感染病毒的细胞出现了特异的亮绿色荧光。2个分离株全基因组长度均为1 767bp,与国内外PCV2参考毒株核苷酸序列同源性为92.6%~99.9%,2个毒株之间的核苷酸序列同源性为96.0%,与PCV1核苷酸序列同源性分别为74.6%和77.7%。系统进化树分析结果显示,2个PCV2分离株同国内外分离株的亲缘关系很近;PCV2核苷酸序列比较稳定,其进化不存在明显的地域相关性。【结论】初步证实分离病毒为PCV2,ZHENGZ-12株基因型为PCV-2a,JIAOZ-12株基因型为PCV-2b。     

猪圆环病毒2型陕西杨凌株的分离鉴定及全基因组分析

[目的]分离得到猪圆环病毒2型(PCV-2)陕西杨凌株,测定病毒滴度(TCID50),并进行全基因组序列比对,为研制针对性更强的PCV-2疫苗提供理论依据.[方法]从经PCR检测为猪圆环病毒2型阳性的病料中、分离病毒并接种PK-15细胞,通过PCR检测、间接免疫荧光试验及电镜观察,对分离病毒进行鉴定;用免疫过氧化物酶细...     

猪圆环病毒Ⅱ型ZZ株ORF1基因的扩增测序与序列分析

合成一对猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)ORF1基因特异性引物,对分离到的郑州分离株(ZZ株)猪圆环病毒PCV-2型的ORF1基因进行了扩增,经测序后,将所测序列与已公布的35株PCV-2ORF1序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树。结果显示,所测毒株间的ORF1基因核苷酸同源性为97.3%～100%;进化树分析表明各分离毒株ORF1基因在进化上比较保守。同时对PCV-2OFR1部分功能进行分析,发现该基因蛋白具有良好的抗原性。     

猪圆环病毒2型广东株全基因的克隆与序列分析

根据GenBank中发表的已知猪圆环病毒2型(Porcine Circovims-2,PCV-2)全基因序列,自行设计2对特异性引物,从2株接种疑似断乳仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning muhisystemic wasting syndrome,PMWS)仔猪病料的PK-15细胞中提取基因组DNA,以此为模板,用PCR方法分2段扩增2个PCV-2广东株(GZ株和ZS株)的全基因序列．应用序列分析软件DNAstar,对所测2组PCV-2序列与GenBank中的国内外PCV-2毒株进行同源性比较,并绘制系统进化发生树,进行了序列分析．结果表明,2个PCV-2广东株全基因组皆为1767bp,2个毒株间全基因序列核苷酸同源性为77．0％,第一开放阅读框(ORF1)间的核苷酸同源性仅为57．7％,而第二开放阅读框(ORF2)间的核苷酸同源性却高达99．1％．ZS株和GenBank中国内外其他的PCV-2参考毒株序列的核苷酸同源性在95．7％-99．5％之间;而GZ株和其他PCV-2参考毒株序列的核苷酸同源性仅在74．2％-77．1％之间．     

猪圆环病毒Ⅱ型ZZ株ORF2基因的扩增、测序与序列分析

扩增PCV-2 ZZ毒株ORF2基因,并进行序列分析和同源比较。根据GenBank中PCV-2毒株基因序列设计1对特异性引物,对郑州分离株(ZZ)猪圆环病毒PCV-2型的ORF2基因进行了扩增。测序后,将所测序列与已公布的PCV-2 ORF2序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树。通过扩增可获得702 bp的PCV-2 ORF2全基因,编码234个氨基酸,分子量27 995.93 D。所有毒株间的ORF2基因核苷酸同源性与氨基酸同源性均为89.2%~100%;ZZ株与HZ0201分离株的ORF2基因的核苷酸序列同源性较近(98.3%),而与hk102同源性较远(92.0%)。进化树分析表明,各分离毒株在进化上地理位置的相关性不明显。该研究对圆环病毒的流行病学和疫苗研究及其抗原的变异都具有重要参考价值。     

1株猪圆环病毒3型全基因组克隆与序列分析

【目的】克隆获得1株猪圆环病毒3型(PCV3)全基因组序列并进行序列分析。【方法】以PCV3阳性临床样品为模板,用PCR技术扩增PCV3全基因组片段,随后进行克隆、序列测定与分析。【结果】扩增出1株PCV3全基因组片段,序列测定结果显示,这株PCV3全基因组大小为2 000bp,与其他国内外14株PCV3的核苷酸同源性均达98.6%以上,表明获得1株PCV3全基因组序列,且不同PCV3之间的全基因组核苷酸有非常高的同源性。PCV3与PCV1、PCV2之间的全基因组核苷酸同源性都低于50%。系统发育显示,3种PCV分别处于明显不同的分支,表明各自属于不同的基因型。【结论】获得1株PCV3全基因组序列,其与其他PCV3毒株之间的核苷酸同源性很高。     

一株类猪圆环病毒2型因子P1的全基因组序列测定与分析

【目的】确定猪体内存在与猪圆环病毒2型核苷酸序列高度同源的因子。【方法】首先利用PCR方法对来自临床表现为猪断奶后多系统衰竭综合征的猪血清所抽提的DNA进行扩增,根据获得的序列再设计引物进行反向PCR,拼接得到类猪圆环病毒2型因子P1的全基因组序列,最后根据P1全基因组序列设计引物扩增其全基因组加以验证。【结果】首次完成了类猪圆环病毒2型因子P1的全基因组序列测定。测序结果表明P1因子为环状DNA基因组,全长648个核苷酸,包括3个开放阅读框。除5′端16个核苷酸外,P1因子与国内猪圆环病毒2型BF毒株的核苷酸同源率为98.42%。系统进化分析表明P1与猪圆环病毒有很近的亲缘关系。【结论】猪体内存在类猪圆环病毒2型因子P1。     

1株猪圆环病毒3型全基因组克隆与序列分析

【目的】克隆获得1株猪圆环病毒3型(PCV3)全基因组序列并进行序列分析.【方法】以PCV3阳性临床样品为模板,用PCR技术扩增PCV3全基因组片段,随后进行克隆、序列测定与分析.【结果】扩增出1株PCV3全基因组片段,序列测定结果显示,这株PCV3全基因组大小为2000bp,与其他国内外14株PCV3的核苷酸同源性均达98.6%以上,表明获得1株PCV3全基因组序列,且不同PCV3之间的全基因组核苷酸有非常高的同源性.PCV3与PCV1、PCV2之间的全基因组核苷酸同源性都低于50%.系统发育显示,3种PCV分别处于明显不同的分支,表明各自属于不同的基因型.【结论】获得1株PCV3全基因组序列,其与其他PCV3毒株之间的核苷酸同源性很高.     

产销通路的建立及招商引资意见

针对大陆农业发展存在的不足有必要建立产销通路 ,并提及物流在流通环节的重要性。最后就大陆各地的招商引资提出了意见     

秸秆切碎灭茬机的设计与试验

针对双轴击切式破碎秸秆和根茬所存在的问题，本文提出单轴压切原理和非等长刀切碎模型，并对秸杆切碎灭茬机的关键参数进行了优化设计。该机田间试验表明切碎率达91．4％，根茬破碎率达86．5％。该机的应用必将促进一年两熟平作旱区保护性耕作技术的发展。     

苦荞的成分功能研究与开发应用

苦荞具有丰富的营养价值 ,它既能食用 ,又能防病、治病 ,为许多其它主要食物所不及。我国有丰富的苦荞资源 ,对苦荞的深入研究和开发应用有利于改善和提高人们的食物结构 ,同时也有助于促进贫困山区的脱贫致富。本文就苦荞的营养价值、药用价值和开发应用等方面的问题进行了阐述     

秸秆切碎灭茬机的设计与试验

针对双轴击切式破碎秸秆和根茬所存在的问题，本文提出单轴压切原理和非等长刀切碎模型，并对秸杆切碎灭茬机的关键参数进行了优化设计。该机田间试验表明切碎率达91．4％，根茬破碎率达86．5％。该机的应用必将促进一年两熟平作旱区保护性耕作技术的发展。     

保护地茄果类蔬菜落花落果的原因及防治对策

从自身原因和外部环境条件两方面分析了保护地蔬菜落花落果的主要原因,提出防治措施,有效控制落花落果的发生。     

《机械原理》与《机械设计》实验教学改革实践

《机械原理》和《机械设计》两门课程的实验教学在培养学生的综合设计、创新设计能力等方面,有其他课程不可替代的重要作用,针对两门课程传统实验教学中存在的问题,提出了以独立设课为中心的实验教学改革和实践方案,取得了显著的效果。     

植物学与分子生物学研究创新型实验项目的设计与实施

以农杆菌渗入烟草表皮瞬间表达绿色荧光蛋白的观察实验为例,对植物学与分子生物学研究创新型实验的选题设计、教学过程和效果进行了探讨。该实验项目的实施培养了学生的团队精神、科学素养和创新意识,提高了实验设计和实际操作能力,是生物科学特色专业实验教学改革的有益尝试。     

灌水和过量施钾对烤烟养分含量及烟叶产量品质的影响

采用田间试验研究了灌水和过量施钾对烤烟（Nicotiana tabacum L.)养分含量和产量品质的影响。结果表明，在烤烟N：K2O用量比达到1：3的基础上随钾用量增加，烟株体内营养元素含量、烟叶产量和化学成分均没显著差异，灌水可以显著提高烟叶产量和上等烟比例，但灌水与钾用量互作对烤后烟叶养分含量和化学成分的影响不显著。     

秦川牛GH 、INS 的测定及体尺、体重分析

随机选取14头秦川牛(其中1.5岁的公、母牛各4头,2.0岁的公、母牛各3头),按性别分为两组。采用放射免疫法测定血液中生长激素(GH)、胰岛素(INS)的水平,并对每头牛的体高、体斜长、胸围、胸深、尻宽、腰角宽等体尺指标及体重进行测量并分析,结果表明:在1.5时公、母秦川牛体内的生长激素和胰岛素差异不显著(P>0.05);而在2.0岁时公、母秦川牛体内的生长激素和胰岛素差异显著(P<0.05);并且随着年龄的增加,秦川牛体内的生长激素呈下降趋势而胰岛素则呈增加趋势,且生长激素和胰岛素呈差异不显著的负相关(P>0.05)。通过对体尺指数进行分析得出:较1.5岁而言,2.0岁秦川牛体躯发育程度更大,胸围更宽,尻部增幅明显,骨骼等体躯部分生长速度相对减慢,而肌肉等体量部分增长速度则相对加快,符合肉牛的生长发育规律以及秦川牛中、晚熟的特点。将实测体重与经济性能划分标准比较,发现秦川牛仍属于役肉兼用型品种,但经过近几年的选育,体重有了很大的增加。     

副猪嗜血杆菌分离鉴定与PCR检测方法的建立及应用

从养猪场送检的猪肺病料中分离到3株疑似副猪嗜血杆菌(HPS)可疑菌株。经形态镜检、染色特性、生化和部分生物学特性试验,初步鉴定为HPS。在细菌学鉴定基础上,设计合成3对引物,分别以3株分离菌株的DNA为模板进行PCR扩增,结果均扩增出822 bp8、24 bp和1.9 kb的预期特异性条带。以HPS GD株作为参考阳性菌株,以P1、P2为引物,设计优化PCR反应程序,建立HPS PCR检测方法,并应用于临床病料检测。结果表明,所建立的HPS PCR检测方法特异与敏感性高、适用性强,可应用于HPS感染的诊断和检测。