ω 3脂肪酸脱氢酶基因Fat 1的真核表达载体构建与表达

培养线虫(Caenorhabditis elegans),提取RNA并通过PT-PCR获得其ω-3脂肪酸脱氢酶基因Fat-1,整合入真核表达载体,构建了哺乳动物细胞表达载体pFat-IRES2-GFP,转染牛胎儿成纤维细胞系并对其进行G418筛选获得稳定转染细胞株。对稳定转染Fat-1细胞株的RT-PCR分析及脂肪酸组成的HPLC分析结果表明,Fat-1基因已经整合入牛基因组中,并能够表达和发挥其ω-3脂肪酸脱氢酶的作用,促使-ω6PUFAs转变为相应的-ω3 PUFAs。ω-6脂肪酸总量从35.60%下降到25.47%,-ω3 PUFAs总量从5.75%上升到12.33%,多不饱和脂肪酸的比值从正常细胞中的6.19下降到阳性细胞中的2.07,说明Fat-1基因整合是成功的,能够在细胞中以相应的-ω6 PUFAs为底物合成-ω3 PUFAs。     

3种海洋微藻ω-3脂肪酸去饱和酶基因表达影响因素分析

研究了温度、光照和酸碱度对三角褐指藻、小球藻和球等鞭金藻-ω3脂肪酸去饱和酶基因表达的影响。实时定量PCR结果表明,10和15℃的低温处理,降低了3种微藻ω-3脂肪酸去饱和酶基因的表达丰度,提高处理温度至25和30℃(三角褐指藻除外),则促进该基因的转录;在5 000 lx的光照强度下处理48和72 h,可以提高3种藻类的ω-3脂肪酸去饱和酶基因的表达;酸碱度对3种微藻-ω3脂肪酸去饱和酶基因的表达影响与不同的物种有关,pH 5~9的培养结果显示,酸碱度对三角褐指藻影响较大,球等鞭金藻次之,而对小球藻影响较小。     

膜整合脂肪酸去饱和酶系统进化分析

将已报道的膜整合脂肪酸去饱和酶基因所编码的氨基酸序列进行比较,通过邻位相连法构建系统进化树.结果表明,膜整合脂肪酸去饱和酶氨基酸序列都具有3个高度保守的组氨酸簇,说明它们具有很近的亲缘关系.系统进化树由3个单系群组成:△9-脂肪酸去饱和酶;△12、15-脂肪酸去饱和酶;前端脂肪酸去饱和酶包括△4、5、6、8脂肪酸去饱和酶.△12、15-脂肪酸去饱和酶单系群与前端脂肪酸去饱和酶单系群构成姐妹单系群,它们可能是由△9-脂肪酸去饱和酶单系群进化分枝而来的.     

携带FAT1-FAT2基因打靶载体构建及其在猪肾细胞的表达与功能鉴定

【目的】ω-3多不饱和脂肪酸(PUFAs)对人类具有重要的营养价值与医疗作用。随着生物技术的发展,通过转基因技术可实现哺乳动物体内自身合成多不饱和脂肪酸,进而改变猪肉中不饱和脂肪酸的含量和种类,对人类的营养健康具有积极意义。【方法】克隆猪体内缺乏的ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶基因FAT1和Δ-12脂肪酸去饱和酶的关键基因FAT2,构建携带FAT1-FAT2双基因的多位点打靶载体。该载体以猪rRNA基因间的内部转录间隔序列为靶位点;为提高定点整合效率,引入NEO、TK正负筛选系统进行双重选择;加入EGFP报告基因和Cre/Loxp系统,便于筛选阳性同源重组细胞克隆及后期删除筛选基因。将所构建的携带FAT1-FAT2双基因的打靶载体,通过脂质体介导瞬时转染猪肾细胞PK15。【结果】RT-PCR结果显示,FAT1-FAT2双基因在猪肾细胞PK15中实现表达;脂肪酸测定结果显示,ω-6 PUFAs、ω-3PUFAs在对照组PN1(转染对照质粒PN1)、转染试验组PF1(转染携带FAT1基因)、转染试验组PF1F2(转染携带FAT1-FAT2双基因)中的含量分别为7.9%、7.03%、3.92%和5.64%、7.01%、9.43%,差异均显著;ω-6/ω-3比例由对照组的1.4显著下降到试验组的0.42～1。【结论】构建携带FAT1-FAT2双基因的打靶载体转染猪肾细胞PK15可以表达产生FAT1-FAT2 mRNA,且可以显著提高转染细胞中ω-3 PUFAs的含量,为下一步生产转FAT1-FAT2双基因猪奠定基础。     

表达sFat-1基因慢病毒载体的构建及病毒生产

为了建立有效地用于转基因动物生产的慢病毒表达系统,以线虫C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因(sFat-1)为目的基因构建了慢病毒表达载体,通过与慢病毒包装载体PLP1、PLP2和PLP/VSVG一起共转染293FT细胞系生产了慢病毒颗粒,并对其感染哺乳动物细胞NIH3T3细胞系的能力进行了检测。结果表明,该系统所生产的病毒滴度约为5.0×106TU/mL,这种病毒能够感染哺乳动物细胞,说明构建的慢病毒表达系统是有效的,应用其可以生产感染力良好的慢病毒颗粒,并高效地进行sFat-1基因转移。     

我国首例富含鱼油转基因克隆猪诞生

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、军事医学科学院生物工程研究所和河北省玉田种猪场玉田县牧富种猪繁育有限公司成功合作培养出一头转“ω-3”脂肪酸去饱和酶基因的克隆猪，出生体重1．15千克，目前健康状况良好。这使中国成为继美国之后第2个能培育富含“ω-3”多不饱和脂肪酸克隆猪的国家。     

猪胎儿成纤维细胞的分离与基因转染

为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。     

我国首例富含“鱼油”转基因克隆猪诞生

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、军事医学科学院生物工程研究所和河北省玉田种猪场玉田县牧富种猪繁育有限公司合作，顺利培养出一头转ω-3脂肪酸去饱和酶基因的克隆猪。出生体重1．15千克，目前健康状况良好。经分子生物学鉴定，证实此猪为转基因克隆猪。     

同源重组敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞的构建

 【目的】获得敲除肌肉生长抑制素（MSTN）基因的猪胎儿成纤维细胞。【方法】打靶载体的构建：以Neo为正筛选基因、HSV-tk为负筛选基因。在Neo的两侧分别插入同源长臂和同源短臂。同源长臂5 382 bp,包含MSTN基因的部分5′端,全部的exon1,intron1和exon2及大部分intron2;同源短臂844 bp,包含部分exon3及3′端的部分序列。取35 d胎龄的大白猪,用胰酶消化法,分离胎儿成纤维细胞并对其进行培养和建系。采用脂质体法将打靶载体导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞采用250 μg?ml-1 G418筛选7 d,再用200 μg?ml-1 G418+2μmol?L-1 GANC维持筛选。用RT-PCR法检测转染前转染后细胞MSTN基因表达量。【结果】成功构建了对猪MSTN基因部分intron2和exon3区域进行敲除的替代型打靶载体。共得到5个具有药物抗性的细胞克隆,经PCR检测,其中一个细胞克隆发生了正确的同源重组。转染后细胞MSTN基因表达量明显降低。【结论】获得了敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞。     

我国首例人治疗性抗体转基因奶牛诞生

一直被人看重的深海鱼油，有望从一种猪身上得到。由中国农科院北京畜牧兽医研究所、军事医学科学院生物工程研究所和河北省玉田种猪场玉田县牧富种猪繁育有限公司合作，顺利培养出一头转“ω-3”脂肪酸去饱和酶基因的克隆猪，出生体重1．15千克，目前健康状况良好。     

我国首例富含ω-3转基因克隆猪降生

一直被人看重的深海鱼油，有望从一种猪身上得到。由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、军事医学科学院生物工程研究所和河北省玉田种猪场玉出县牧富种猪繁育有限公司合作，顺利培养出一头转“ω-3”脂肪酸去饱和酶基因的克隆猪，出生体重1．15kg公斤，目前健康状况良好。     

山羊α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的构建 及核供体细胞的转染

为了构建α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体及提供山羊乳腺生物反应器α-乳清蛋白核移植供体细胞,提取乳腺组织中的总RNA,采用RT-PCR技术获得α-乳清蛋白基因cDNA,测序酶切后连接乳腺特异性表达载体pBCⅠ-Neo,并对重组载体进行酶切测序鉴定;取重组正确的载体酶切线性化后利用脂质体介导转染至山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选培养转染了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞。结果显示:经过RT-PCR特异性扩增克隆出α-乳清蛋白基因;克隆的基因碱基组成序列经测序与预期完全一致,α-乳清蛋白基因片段正向插入乳腺特异性表达载体;重组载体在山羊胎儿成纤维细胞中稳定转染,转入α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞生长迅速,仍保持原有的细胞生长形态。成功构建了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体,获得稳定转染的山羊胎儿成纤维细胞可用于核移植。     

fat-1基因密码子优化及在家兔胎儿成纤维细胞中的初步表达

根据家兔基因密码子使用偏好性,对引自GenBank的秀丽隐杆线虫fat-1基因编码序列进行密码子优化,通过全基因合成的方法获得优化后的fat-1基因(命名为opfat-1);从秀丽隐杆线虫中RT-PCR扩增获得fat-1.将扩增的fat-1和合成的opfat-1基因分别构建到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中.采用脂质体LipofectamineTM转染法将fat-1和opfat-1基因转入家兔胎儿成纤维细胞(Rabbit fetal fibroblast cells,rFFCs)中.对比不同DNA和转染试剂用量以及细胞暴露于DNA、转染试剂中作用时间探讨影响rFFCs转染效率的参数,经过优化,最优的rFFCs转染条件为:LipofectamineTM用量2～3μl,DNA量0.8～1.0μg,LipofectamineTM与DNA、细胞共培养时间为8 h.通过绿色荧光标记和RT-PCR检测转染细胞中融合蛋白和目的基因的表达.密码子优化的opfat-1与fat-1相比,体外瞬时表达效率有极为显著的提高;G418抗性筛选获得转基因单克隆细胞,RT-PCR初步验证fat-1和opfat-1基因均在家兔胎儿成纤维细胞中稳定转录表达.     

我国首例富含“鱼油”转基因克隆猪诞生

近期，由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、军事医学科学院生物工程研究所和河北省玉田种猪场玉田县牧富种猪繁育有限公司合作，顺利培养出一头转ω-3脂肪酸去饱和酶基因的克隆猪，出生体重1．15公斤，健康状况良好。中国农业科学院北京畜牧兽医研究所潘登科介绍．经分子生物学鉴定，证实此猪为转基因克隆猪。     

寿光黑鸡成纤维细胞的体外培养与冷冻保存

[目的]建立鸡成纤维细胞的体外培养体系。[方法]用组织块法和消化法分别分离培养鸡皮肤成纤维细胞;比较细胞生长速率及冻存复苏率。[结果]酶消化培养的成纤维细胞原代生长较快,约5 d便可形成单层;2种方法传代细胞的生长速度相似,仅需2~3 d就可形成单层;使用酶消化法和反复贴壁法,经3~4代后,可获得纯化的成纤维细胞;成纤维细胞经冷冻复苏后有75%~80%存活;分离纯化的胚胎和皮肤成纤维细胞的生长曲线均正常,可传至12代,传代后染色体数目不变。[结论]采用组织块法及酶消化法培养鸡成纤维细胞均可获得ES细胞建系所需的饲养层细胞。该研究为ES细胞系的成功建立奠定了基础。     

人α-乳白蛋白质基因的克隆及其在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达

采用PCR方法从人类基因组DNA中扩增hα-LA基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,并进行测序验证。通过双酶切法将测序正确的hα-LA亚克隆至真核表达载体pCEP4,构建真核表达载体pCLA并进行酶切鉴定。用脂质体法将pCLA转染至奶山羊胎儿成纤维细胞中,用RT-PCR法检测细胞中hα-LA基因mRNA的表达,用Western-blotting法检测培养上清液中hα-LA蛋白质的表达。结果显示:克隆的hα-LA基因序列完全正确,pCLA酶切鉴定正确,RT-PCR检测到转染细胞中hα-LA基因mRNA的表达,Western-blotting检测到转染细胞培养上清液中hα-LA蛋白质。表明所克隆的hα-LA基因组DNA能够在奶山羊胎儿成纤维细胞中正确转录和翻译。     

两种奶牛真皮成纤维细胞分离培养方法的比较

为了比较两种体外分离和培养奶牛真皮成纤维细胞方法，采集奶牛蹄部真皮组织，通过组织块贴壁法和双酶消化法（胰蛋白酶-Ⅰ型胶原酶）分离原代奶牛真皮成纤维细胞，通过传代培养进一步纯化并扩增。利用显微镜观察细胞形态及生长特性，MTT法用于绘制细胞生长曲线，利用细胞免疫荧光技术检测其表面标志物，鉴定细胞纯度。倒置显微镜下观察，贴壁后第6天有细胞爬出，形态多呈长梭形，排列紧密呈漩涡状或束状；双酶消化组第2天有长梭形细胞生长，混杂少量上皮细胞生长。生长曲线图表示，组织块贴壁组细胞生长速度较快。免疫化学荧光检测第四代奶牛真皮成纤维细胞，波形蛋白呈阳性表达，角蛋白-18呈阴性表达，表示细胞纯度较高。两种方法均能分离出奶牛真皮成纤维细胞，与双酶消化法相比，组织块贴壁法分离的细胞纯度更高，活性更佳，增殖周期更短，提示组织块贴壁法是分离培养奶牛真皮成纤维细胞的首选方法。     

西藏牦牛胎儿成纤维细胞的分离与培养

对西藏牦牛胎儿成纤维细胞的分离和培养进行了研究.利用组织块法和酶消化法均能成功分离培养西藏牦牛胎儿成纤维细胞,通过细胞的传代培养、形态学和动力学观察与分析,结果表明,所建立的西藏牦牛胎儿成纤维细胞系具有典型的成纤维细胞形态;西藏牦牛胎儿成纤维细胞要经历滞留期、对数期、平台期,分别为0～2 d、2～7 d、7～8 d.试验结果表明,已成功培养了西藏牦牛胎儿成纤维细胞.     

广西巴马香猪耳皮成纤维细胞的分离与培养

试验主要对广西巴马香猪耳皮成纤维细胞的分离和培养进行了研究.利用组织块法能够成功分离培养广西巴马香猪耳皮成纤维细胞,其大小范围在1～3 mm3,去除表皮有利于组织块贴壁和细胞的游出;而采用0.25%胰蛋白酶消化液4℃冷处理过夜,不仅有利于去表皮操作,减少取材处理时间,而且操作时间自由度大.在酶消化法中采用胰蛋白酶消化30 min,胶原酶继续消化30～40 min,能够成功分离培养广西巴马香猪耳皮成纤维细胞.广西巴马香猪皮肤成纤维细胞要经历滞留期、对数期、平台期,分别为0～2 d、2～8 d、8～12 d.     

乳腺特异性共表达4种脂肪酸合成酶载体 及其稳转山羊成纤维细胞系的构建

为改善山羊乳品质,创制乳汁中富含n-3不饱和脂肪酸的奶山羊育种新材料,首先构建了一种山羊乳腺特异性表达载体,以实现n-3不饱和脂肪酸合通路中4种脂肪酸合成酶基因(fat-1,fads2,elovl5和scd-1)的共表达。为初步验证该载体的有效性,通过脂质体法转染小鼠乳腺上皮细胞系C127,经G418筛选收集阳性C127转基因细胞,并对其进行反转录PCR(RT-PCR)检测。结果表明,4种基因均可在C127细胞转基因中表达。将该多基因共表达载体转染奶山羊成纤维细胞,通过G418筛选获得了稳定转染的细胞系。PCR结果显示,4个目的基因均成功整合到奶山羊成纤维细胞基因组中。总之,本研究成功构建了乳腺特异性共表达4种脂肪酸合成酶转基因载体及其山羊转基因细胞系,为创制乳腺特异性表达多不饱和脂肪酸的转基因奶山羊奠定了基础。