广东兰花两种主要病毒的检测

采用双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)对44个兰花病样分别检测建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV )和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV),结果显示,有59.1%的兰花检出CyMV,36.4%的兰花检出ORSV,22.7%的兰花复合感染了CyMV和ORSV.采用一步逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)对24个兰花病样进行检测,结果有83.3%的兰花检出 CyMV,75%的兰花检出ORSV,66.7%的兰花复合感染了CyMV和ORSV,可见RT-PCR检测灵敏度高于ELISA.     

蝴蝶兰2种病毒的同步检测及其CP融合反义表达载体构建

【目的】建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)是侵染蝴蝶兰最主要的2种病毒,给蝴蝶兰产业造成巨大经济损失。本文建立了快速检测这2种病毒的方法,并为培育同时抗CyMV和ORSV的蝴蝶兰新品种奠定基础。【方法】根据2种病毒CP基因序列设计了2对特异性引物,运用RT-PCR方法同时检测这2种病毒,利用反义RNA技术构建2种病毒CP基因的融合表达载体。【结果】利用设计的特异性引物检测12株蝴蝶兰样品,有25%同时检测出2种病毒,在同一PCR反应体系中,扩增出2个目的条带清晰无杂带。从感病蝴蝶兰叶片总RNA中克隆出CyMV CP基因的125 bp片段和ORSV CP基因的164 bp片段。将CyMV的CP基因片段以3’→5’方向与表达载体p CAMBIA1300连接,命名为p CAMBIA1300-CyMV,经酶切及菌落PCR鉴定可获得125 bp的小片段;再将ORSV的CP基因片段以3’→5’方向与p CAMBIA1300-CyMV连接,命名p CAMBIA1300-CyMV-ORSV,经酶切及菌落PCR鉴定可获得289 bp的片段。【结论】所设计的2对特异性引物能够在同一PCR体系中快速高效地检测出CyMV和ORSV,含2种病毒CP基因的反义融合表达载体构建成功。     

福建建兰病毒病调查研究

2014-2015年,对福建主要建兰种植基地进行病毒病危害情况调查。结果表明,福建建兰病毒病症状多以斑驳花叶型最为普遍。调查还发现,建兰的病毒病发病率与龄期呈正相关,不同品种间略有差异。应用RT-PCR方法鉴定,确定危害福建建兰的病毒主要为齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)、建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)和菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus,BYMV),其中ORSV为优势种,有时出现ORSV和CyMV二者复合,或ORSV、CyMV和BYMV三者复合感染。     

不同处理方法对3种大丽花病毒的脱毒效果比较

为了进一步完善大丽花脱毒技术,获得优质大丽花脱毒苗,以感染大丽花花叶病毒(DMV)、黄瓜花叶病毒 (CMV D2)和烟草花叶病毒(TMV)的大丽花为试材,采用茎尖结合热处理、化学处理方法对大丽花脱毒效果进行了探讨。各培养单株经酶联免疫法(ELISA)检测,结果表明,茎尖结合热处理能有效脱除DMV和CMV D2,脱毒率分别达到747%和669%,但不能有效脱除TMV,对3种病毒均脱除的比率为106%;茎尖结合化学处理能有效脱除DMV,CMV D2和TMV,脱除率分别为831%,805%和771%,对3种病毒的脱除率为243%。     

云南部分兰花病毒病的病害调查及病原鉴定*

 对云南部分兰花种植区的文心兰、蝴蝶兰、大花惠兰上发生的病毒病进行了调查与病原鉴定。兰花感染病毒后,主要以在叶片形成黑褐色的坏死斑为主。在文心兰不同品种中,T系列的病毒病发病率最高。经电子显微镜、血清学和RT-PCR等方法综合鉴定,确定危害云南兰花的主要病毒为建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV ) 和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV ),其中CyMV为优势种,有时出现CyMV 和ORSV复合侵染的情况。     

双重RT-PCR同时检测兰花两种主要病毒的研究

以利用Trizol试剂盒提取的蝴蝶兰组培苗叶片总RNA为模板,根据已报道的建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglussm ringspot virus,ORSV)外壳蛋白基因(cp)的保守序列设计特异性引物,探索RT-PCR反应条件,建立了可同时检测CyMV和ORSV的双重RT-PCR体系。     

杂交兰种苗超低温脱毒技术研究

以携带建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)的杂交兰根状茎为试材,采用包埋玻璃化超低温保存法对杂交兰病毒脱除进行研究。结果表明：低温炼苗21 d的茎尖,在0.5 mol/L的蔗糖浓度预培养基中培养3 d,然后浸入0.4 mol/L高糖液体培养基中加载90 min,之后转入玻璃化溶液PVS2(protect vitrification solution 2)中冰上处理6 h,再液氮保存1 h,最后于37℃水浴中解冻2~3 min,1.2 mol/L高糖液体培养基中卸载20 min,待恢复培养后,杂交兰茎尖成活率为64%以上,随机检测30个样品,两种病毒脱毒率均为100%。研究为杂交兰种苗脱毒奠定了一定的理论基础。     

‘滁菊’病毒脱除及脱毒苗品质分析

[目的]本文旨在比较3种脱毒方法对‘滁菊’病毒脱除的效果,并对‘滁菊’脱毒苗和非脱毒苗在遗传稳定性、产量和品质等方面的表现进行分析和比较。[方法]采用电镜观察和巢式PCR两种方法检测‘滁菊’8种(类)病毒;比较茎尖分生组织培养、热处理结合茎尖分生组织培养及病毒唑结合茎尖分生组织培养3种脱毒方法的脱毒率,筛选出确定‘滁菊’病毒脱除的最适方法。采用SRAP分子标记技术检测脱毒苗和非脱毒苗的遗传稳定性,并以总黄酮、绿原酸以及鲜花产量等为检测指标,比较脱毒苗与非脱毒苗的产量品质。[结果]病毒检测结果表明:侵染‘滁菊’的主要(类)病毒为菊花B病毒(CVB)和菊花矮化类病毒(CSVd)。热处理结合茎尖分生组织培养和病毒唑结合茎尖分生组织培养脱毒效果较单独采用茎尖分生组织培养脱毒效果好且差异显著,当2种(类)病毒CVB和CSVd都脱除时,脱毒率能达到35.21%、36.62%。3种脱毒方式均能保持‘滁菊’的遗传稳定性。采用脱毒‘滁菊’种苗生产,其在单株产量和品质上都显著优于非脱毒苗‘滁菊’,花直径、单株花数、单株产量分别比非脱毒苗高4.5%、21.2%、24.0%。[结论]茎尖分生组织培养结合热处理或病毒唑处理脱除‘滁菊’病毒效果明显,采用脱毒‘滁菊’种苗生产能有效提高产量和品质。     

百合病毒脱除技术研究

为了探究生产脱毒百合种球的最佳途径,通过对5种百合进行茎尖切块大小、热处理方式以及病毒唑浓度三方面的试验,探茎尖培养、茎尖培养结合热处理、茎尖培养结合病毒唑、茎尖培养加热处理结合病毒唑4种方法对LVX,CMV,LSV 3种病毒的脱除效果。结果显示:综合考虑存活率和脱毒率,单纯的茎尖培养难以脱除病毒,3种方法结合脱毒的效果最好。即茎尖培养(0.5～0.8mm)加热处理(变温热处理)结合病毒唑(10mg/L)的方法脱除病毒的效果最好。     

文心兰3种主要病毒多重RT-PCR检测体系的建立

根据GenBank中已发表的建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)、齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)和菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus,BYMV)外壳蛋白(CP)基因序列保守区域分别设计特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能同时检测文心兰3种病毒的多重PCR检测体系。该体系能够一次扩增出CyMV、ORSV和BYMV的特异片段,其大小分别是551、325和212bp。测序结果表明,3种病毒序列与相应的参考序列相似性均达98%以上。灵敏度测定结果表明,从相当于或大于10-2 mg的感病植物组织中能够检测到这3种病毒。     

广东兰花病毒病的鉴定和检测研究

用建立的ＤＡＣ－ＥＬＩＳＡ法，检测了来自广东省７市１８个场场或兰圃的２０种兰共１５９个感病兰花样本，建兰花叶病毒（ＣｙＭＶ）和齿兰环斑病毒（ＯＲＳＶ）以及ＣｙＭＶ和ＯＲＳＶ复合感染分别在４０，２６和６个样本中检测到，分别占所检测样品的２５．２％，１６．４％和３．８％，占所检测的２０个兰种的５０％（１０／２０），３５％（７／１０）和１５％（３／２０），感染ＣｙＭＶ的兰种有墨兰，文心兰，大花惠兰（组培     

侵染兰花引起坏死斑症状的病毒种类鉴定

 在昆明市文心兰栽培基地发现了具有病毒病症状的感病文心兰和大花惠兰植株。感病文心兰和大花惠兰样品在电镜下可观察到长约460～500nm的线状病毒粒体和长约300nm的杆状病毒粒体，它们分别与已报道的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒粒体大小一致。利用ELISA技术在感病文心兰和大花惠兰样品可以检测到建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒。利用建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的特异性引物，运用RT-PCR方法可以扩增到与引物设计预期大小一致的核酸条带。由此证明，云南文心兰和大花惠兰病毒病由建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒中的一种或两种侵染引起。     

3种热带兰感染2种病毒的症状探讨

建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus,CymMV）和齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）是危害海南兰花最普遍的2种病毒。CymMV侵染蝴蝶兰后引发黄化斑、坏疽凹陷斑、畸形生长等多种症状;侵染石斛兰引发花叶、黄化斑、全叶黄化或红化、契形坏死、疱状突出等症状;侵染文心兰引发花叶、黄化、坏死、畸形生长等症状。ORSV的症状种类则相对简单,蝴蝶兰上引发环斑、系统性黄化、凹陷坏死、疱状突出等症状;文心兰上主要表现花叶;石斛兰上未检测到ORSV。     

热带兰花2种病毒的ELISA检测

采用三抗夹心酶联免疫吸附法（TAS-ELISA）和双抗夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）检测了海南主要兰花种植基地的疑似病毒感染的兰花叶片。结果表明,海南兰花病原病毒主要为建兰花叶病毒（Cym-bidium mosaic virus,CymMV）、齿兰环斑病毒（Odontoglossum ring-spot vi...     

兰花两种主要病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据建兰花叶病毒(Cymbidiummosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspot virus,ORSV)这两种主要兰花病毒的保守序列设计特异性引物,在CymMV和ORSV单一RT-PCR优化体系的基础上,建立了同时检测CymMV和ORSV的双重RT-PCR检测方法。此方法可特异性地从感染CymMV和ORSV的样品中扩增出2条目的带,即CymMV(781 bp)和ORSV(588 bp)。扩增产物测序表明,CymMV扩增产物与GenBank中登陆的分离物核苷酸同源性为84%~97%,ORSV扩增产物与GenBank中其它分离物的核苷酸序列同源性为98%~99%。运用该方法对随机抽取的田间样品及组培苗样品进行检测,都得到了特异性扩增条带,其灵敏度达到了10-5。     

兰花病毒病分子生物学及抗病毒基因工程研究进展

建兰花叶病毒(CymMV)、齿兰环斑病毒(ORSV)和建兰环斑病毒(CyRSV)是危害兰花的主要病毒。文章综述这几种重要兰花病毒的病毒分子结构、分子检测、卫星RNA、DI RNA、SiRNA及其转基因研究进展,并就今后的研究重点和方向作了展望。     

牛呼吸道疾病综合征相关病毒BVDV、BPIV3、IBRV和BRSV多重PCR检测方法的建立

根据Genbank发表的牛呼吸道综合征相关病毒中牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)N基因、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′-UTR和牛副流感3型病毒(BPIV3)N基因设计特异性引物,建立了在同一体系内同时对4种病毒进行检测的多重PCR方法。该方法可以同时检测出DNA病毒IBRV的长306bp和反转录病毒BPIV3长422bp、BRSV长600bp及BVDV长130bp的特异性片段。本项研究中以已知IBRV、BPIV3、BRSV和BVDV作为参考毒株,对来自内蒙古、辽宁、安徽和吉林4个省、自治区的33例临床样品进行检测。结果表明,合并感染2种病毒较为多见,分别为BVDV和BRSV共感染,BPIV3和BRSV共感染,BPIV3和IBRV共感染,未检测到4种病毒同时感染临床样品。