鲤鱼白细胞介素-1β全长cDNA的克隆·鉴定及其差异表达分析（摘要）（英文）

[目的]进行鲤鱼白细胞介素-1β（IL-1β）全长cDNA的克隆、鉴定及其差异表达分析。[方法]利用DD-RTPCR方法获得差异表达cDNA片段,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行筛选,克隆了鲤鱼IL-1β的全长cDNA,并进行了序列分析和差异表达分析。[结果]获得的阳性克隆含有1个大小为831bp编码276个氨基酸的完整开放阅读框。聚类分析表明,鲤鱼IL-1β氨基酸序列与日本鲤鱼紧密聚为一支,氨基酸序列的同源性达95%,之后聚类顺序依次为鲫鱼、斑马鱼、猪、牛、马、人和小鼠。差异表达分析表明,经有丝分裂原刺激后前期（2h）白细胞中IL-1β的表达量显著增大,但随着时间推移（12,24h）并非一直较同期大,表达量总体趋势成峰形。[结论]为进一步研究IL-1β在体内的表达方式、功能特点和调控机理以及在炎症反应、应急反应和免疫应答的作用机制奠定了基础。     

鲤鱼白细胞介素10(IL-10)基因cDNA克隆及序列分析

[目的]获取鲤鱼全长IL-10(interleukin 10)cDNA,并对其序列进行分析。[方法]利用DD-RTPCR(differential display RT-PCR)方法获得差异表达IL-10 cDNA片段,以地高辛标记做为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IL-10全长cDNA,并对该序列进行序列分析和同源性比较。[结果]鲤鱼全长IL-10 cDNA共1 117 bp,包含55 bp的5'端非编码区,一个540 bp的编码179个氨基酸的开放阅读框及522 bp的3'端非编码区,其中,3'非编码区包含3个mRNA不稳定基序"ATTTA";该蛋白序列具有IL-10家族的典型序列特征;序列同源性比较表明,所获得的序列与GenBank上登录的鲤鱼IL-10基因同源性为89.1%。[结论]该试验为进一步研究IL-10在体内的表达方式、功能特点、调控机理及其在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。     

鲤鱼白细胞介素10(IL-10)基因cDNA克隆及序列分析(英文)

[目的]获取鲤鱼全长IL-10(interleukin 10)cDNA,并对其序列进行分析。[方法]利用DD-RTPCR(differential display RT-PCR)方法获得差异表达IL-10cDNA片段,以地高辛标记做为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IL-10全长cDNA,并对该序列进行序列分析和同源性比较。[结果]鲤鱼全长IL-10cDNA共1117bp,包含55bp的5’端非编码区,一个540bp的编码179个氨基酸的开放阅读框及522bp的3’端非编码区。其中,3’非编码区包含3个mRNA不稳定基序"ATTTA";该蛋白序列具有IL-10家族的典型序列特征;序列同源性比较表明,所获得的序列与GenBank上登录的鲤鱼IL-10基因同源性为89.1%。[结论]该试验为进一步研究IL-10在体内的表达方式、功能特点、调控机理及其在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。     

鲤鱼干扰素γ-2β全长cDNA的克隆及序列分析(英文)

[目的]进行鲤鱼干扰素γ-2β(IFNγ-2β)全长cDNA的克隆、鉴定及序列分析。[方法]以鲤鱼外周血白细胞干扰素γ-2β(interferon γ-2β,IFNγ-2β)EST序列为基础,以地高辛标记作为探针对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IFNγ-2β的全长cDNA,并进行序列分析。[结果]获得了3个阳性克隆。对其序列分析结果显示,该序列包含119bp的5’非编码区,218bp的3’非编码区,开放阅读框ORF长537bp,共编码178个氨基酸,在其3’非编码区存在几个ATTTA不稳定基序。序列同源性比较结果表明,所获序列与GenBank上登录的鲤鱼IFN基因的同源性达97%;蛋白质序列和结构分析发现,该序列其具有IFN家族的典型序列特征。[结论]为进一步研究IFNγ-2β在体内的表达方式、功能特点和调控机理以及在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。     

鲤鱼干扰素γ-2β 全长cDNA的克隆及序列分析

[目的]进行鲤鱼干扰素γ-2β(IFNγ-2β)全长cDNA的克隆、鉴定及序列分析。[方法]以鲤鱼外周血白细胞干扰素γ-2β(inter-feronγ-2β,IFNγ-2β)EST序列为基础,以地高辛标记作为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IFNγ-2β的全长cDNA,并进行序列分析。[结果]获得了3个阳性克隆,对其进行序列分析,结果显示,该序列包含119 bp的5'非编码区,218 bp的3'非编码区,开放阅读框ORF长537 bp,共编码178个氨基酸,在其3'非编码区存在几个ATTTA不稳定基序;序列同源性比较结果表明,所获序列与GenBank上登录的鲤鱼IFN基因的同源性达97%;蛋白质序列和结构分析发现,该序列具有IFN家族的典型序列特征。[结论]为进一步研究IFNγ-2β在体内的表达方式、功能特点和调控机理以及在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。     

鲤鱼IL8的克隆及序列分析*

 利用DD-RTPCR（正常鲤鱼外周血白细胞和经有丝分裂源刺激后白细胞的总RNA）获得的差异显示片段B₁₀克隆（编码IL8的一段序列）,对该基因进行DIG标记,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,从0.8×10⁴个重组噬菌体中,经过2轮筛选最终获得阳性克隆,挑选了3个分别命名为IL8-1,IL8-2,IL8-3。测序后经NCBI Blast分析表明,阳性克隆具有完整阅读框架,均为编码鲤鱼IL8的全长cDNA,编码的多肽由98个氨基酸残基组成,其相对分子质量理论推导值为 10 848.9 Da,等电点为8.68。且与2003年12月Dev Comp Immunol.杂志报道的荷兰鲤鱼氨基酸的同源性达84%。     

青鳉DNA聚合酶β基因的电子克隆与分析

[目的]为了进行青鳉DNA聚合酶β基因的电子克隆与分析的试验。[方法]利用生物信息学手段克隆了青鳉DNA聚合酶β（OlPolβ）基因全长cDNA序列,并对其启动子和编码蛋白结构进行分析。[结果]该cDNA序列的全长1716by,编码含338个氨基酸残基的蛋白。OlPolβ具有14个外显子和13个内含子。OlPolβ启动子上发现了SP1等一些转录因子的潜在结合位点。[结论]OlPolβ蛋白序列与其他脊椎动物的蛋白序列具有高度一致性。     

绵羊激活素受体 IIB（ActRIIB）基因的克隆、序列分析及原核表达

[目的]旨在克隆绵羊激活素受体 IIB （ActRIIB）基因,并构建原核表达载体进行体外表达,为进一步验证功能奠定基础。[方法]以绵羊肝脏组织为材料,以提取总 RNA反转录得到的 cDNA为模板,利用同源序列克隆技术,对绵羊 ActRIIB基因的 cDNA全长进行克隆,并对其进行生物信息学分析。再根据克隆序列设计引物,将其与原核表达载体 pET41a连接,构建重组表达质粒 pET41a-ActRIIB,经IPTG诱导后进行表达鉴定。[结果]扩增获得绵羊ActRIIB基因cDNA全长1564 bp（ Genbank登陆号为：JX422071.1）,最大开放阅读框为1539 bp,共编码512个氨基酸;其氨基酸序列与牛的同源性最高（99.6%）,ActRIIB的 C末端区域高度同源且属于 TGFβ家族。原核诱导表达获得符合预期大小（约92 kD）并带有组氨酸标签序列的 ActRIIB重组蛋白。[结论]绵羊 ActRIIB基因的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

三元杂交猪IL-18全基因的序列测定及分析

[目的]为进一步研发新型抗病毒制剂和疫苗佐剂、有效控制猪重大传染病奠定基础。[方法]根据GenBank中猪白细胞介素-18基因（IL-18）序列,设计1对特异性引物,应用RT-PCR方法从河南三元杂交猪脾脏淋巴细胞中扩增猪IL-18基因,并进行克隆、序列测定和分析。[结果]猪IL-18基因全长为579 bp,编码192个氨基酸的无活性前体蛋白,但前体蛋白并不含典型的疏水信号肽,在第35位氨基酸残基处有1个潜在的白细胞介素1β转换酶（ICE）剪切位点,剪切后变为具有生物活性的猪IL-18成熟蛋白。序列分析结果表明,该试验获得的猪IL-18基因与已知猪IL-18基因序列同源性很高,均为96%以上,其推导的氨基酸同源性在98%以上。[结论]该研究成功构建了猪IL-18基因的重组真核表达载体并得到了具有生物活性的瞬时表达产物。     

鲤鱼HSP70基因组织表达差异研究

[目的]研究HSP70是否可作为鲤鱼养殖中的应激监测指标。[方法]根据鲤鱼HSP70序列（AY120894）设计并合成1对引物,提取鲤鱼肝脏组织总RNA,通过RT-PCR方法克隆得到鲤鱼HSP70部分cDNA片段,然后检测其在鲤鱼心脏、肠、粘液、性腺、鳔、鳃、鳍等不同组织中的表达差异。[结果]RT-PCR扩增获得鲤鱼HSP70基因cDNA部分序列为480 bp。将测序后推测的氨基酸序列与其他种类的鱼进行同源性比较,结果发现与鲤鱼、斑马鱼、虹鳟、牙鲆、剑尾鱼、鲋鱼的同源性依次为96%、98%、98%、96%、96%、96%。HSP70在鲤鱼8个组织中均检测到表达,其中在心脏中表达最高,其次是鳔、鳍,二者之间无显著差异（P〉0.05）,在肠、粘液与脂肪3个组织中的表达无显著差异（P〉0.05）,但显著高于在性腺与鳃中的表达水平（P〈0.05）。[结论]HSP70作为鲤鱼养殖中应激程度、应激能力、健康状况检测的分子标记物是可行的。     

青鱼将DNA聚合酶β基因的电子克隆与分析

[目的]为了进行青鱼将DNA聚合酶β基因的电子克隆与分析的试验。[方法]利用生物信息学手段克隆了青鱼将DNA聚合酶β(OlPolβ)基因全长cDNA序列,并对其启动子和编码蛋白结构进行分析。[结果]该cDNA序列的全长1 716 bp,编码含338个氨基酸残基的蛋白。OlPolβ具有14个外显子和13个内含子。OlPolβ启动子上发现了SP1等一些转录因子的潜在结合位点。[结论]OlPolβ蛋白序列与其他脊椎动物的蛋白序列具有高度一致性。     

用于DNA转染的PRRSV全长感染性cDNA克隆改建及应用

[目的]利用核酶自我剪切功能使PRRSV的基因组获得1个精确的基因组3′末端,提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率。[方法]用3步PCR方法将获得含有丁型肝炎病毒核酶序列的片段并将其克隆到PRRSV全长cDNA克隆pAPRRS的poly（A）下游,再通过酶切,连接将牛生长激素多聚腺甘酸转录终止序列插入到核酶序列后,构建成全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB,新构建的克隆转染MARC-145细胞,72h后用间接免疫荧光检测病毒N蛋白和非结构蛋白2（nsp2）的表达,并用检测细胞上清中病毒的滴度。[结果]成功构建了含有核酶序列的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB。新构建的全长感染性cDNA克隆能够较好地拯救出病毒,拯救效率比pAPRRS提高10倍左右。[结论]该结果为研究PRRSV基因结构与功能奠定了基础。     

用于DNA转染的PRRSV全长感染性cDNA克隆改建及应用

[目的]利用核酶自我剪切功能使PRRSV的基因组获得1个精确的基因组3′末端,提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率。[方法]用3步PCR方法将获得含有丁型肝炎病毒核酶序列的片段并将其克隆到PRRSV全长cDNA克隆pAPRRS的poly（A）下游,再通过酶切,连接将牛生长激素多聚腺甘酸转录终止序列插入到核酶序列后,构建成全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB,新构建的克隆转染MARC-145细胞,72h后用间接免疫荧光检测病毒N蛋白和非结构蛋白2（nsp2）的表达,并检测细胞上清中病毒的滴度。[结果]成功构建了含有核酶序列的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB。新构建的全长感染性cDNA克隆能够较好地拯救出病毒,拯救效率比pAPRRS提高10倍左右。[结论]该结果为研究PRRSV基因结构与功能奠定了基础。     

高邮麻鸭白细胞介素-2基因的克隆与序列分析

[目的]对高邮麻鸭白细胞介素-2（CIL-2）基因进行克隆和序列分析。[方法]以高邮麻鸭外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,根据已发表的鸭IL-2基因cDNA序列设计并合成1对引物,应用两步RT-PCR技术扩增出IL-2基因的特异性片段。将扩增片段插入pGEM-T-easy载体,并进行测序分析和结果验证。[结果]阳性克隆所含插入片段的DNA序列全长为433bp,与预期大小一致,含有1个423bp大小的开放性阅读框,共编码141个氨基酸的前体蛋白,N端21个氨基酸形成信号肽,成熟蛋白为120个氨基酸,分子量约为13.66kD,含1个糖基化位点。该序列与绿头鸭、绍兴鸭、固始鸭相应序列的同源性均为99.8%,与广州白鸭的同源性为99.3%,存在少量核苷酸差异。[结论]高邮麻鸭IL-2编码区基因相对高度保守,为其用于临床疾病治疗提供了一定参考。     

虾夷马粪海胆TLR基因cDNA克隆及表达分析

采用同源克隆和cDNA末端快速扩增（ RACE）技术克隆获得一条虾夷马粪海胆Strongylocentrotus in-termedius TLR基因的全长cDNA序列SiTLR-1（GenBank： HQ259110）,并采用实时定量PCR技术分析了其在组织中的分布以及在致病弧菌Vibrio fortis、β-D葡聚糖和dsRNA刺激后的表达情况。结果表明： SiTLR-1全长序列为3637 bp,形成16个α螺旋、33个β折叠; SiTLR-1蛋白有两个跨膜区段,在725-750位有跨膜区,发现1个信号肽（1-32aa）、1个亮氨酸重复富集区（LRR）; SiTLR-1在检测的各组织中均有表达,在体腔液中表达量显著高于围口膜、管足和齿间肌（ P〈0.05）;经V. fortis、β-D-葡聚糖刺激后,体腔液中的SiTLR-1表达量显著上升,刺激后12 h达到最高值;经dsRNA刺激后,体腔液中的SiTLR-1表达变化较小,仅在3 h 时略有升高。研究表明, TLR 基因参与虾夷马粪海胆的免疫应答,克隆获得的SiTLR-1可特异性识别细菌和β-D-葡聚糖。     

绵羊激活素受体IIB(ActRIIB)基因的克隆、序列分析及原核表达

[目的]旨在克隆绵羊激活素受体IIB(ActRIIB)基因,并构建原核表达载体进行体外表达,为进一步验证功能奠定基础。[方法]以绵羊肝脏组织为材料,以提取总RNA反转录得到的cDNA为模板,利用同源序列克隆技术,对绵羊ActRIIB基因的cDNA全长进行克隆,并对其进行生物信息学分析。再根据克隆序列设计引物,将其与原核表达载体pET41a连接,构建重组表达质粒pET41a-ActRIIB,经IPTG诱导后进行表达鉴定。[结果]扩增获得绵羊ActRIIB基因cDNA全长1 564 bp(Genbank登陆号为:JX422071.1),最大开放阅读框为1 539 bp,共编码512个氨基酸;其氨基酸序列与牛的同源性最高(99.6%),ActRIIB的C末端区域高度同源且属于TGFβ家族。原核诱导表达获得符合预期大小(约92 kD)并带有组氨酸标签序列的ActRIIB重组蛋白。[结论]绵羊ActRIIB基因的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

银杏HDR基因的克隆与功能分析

[目的]获得银杏HDR基因的克隆并研究HDR基因的功能。[方法]采用RT-PCR技术获得银杏HDR的全长cDNA,命名为Gb-HDR（GenBank登录号：DQ364231）,该基因cDNA全长为1827bp,包含1425bp的开放阅读框,编码474个氨基酸残基的蛋白;并构建GbHDR的原核表达载体pTrcGbHDR,与原核表达载体pAC-BETA共转入大肠杆菌XL1-Blue,获得β-胡萝卜素工程菌。[结果]克隆获得实际长度为1441bp的GbHDR基因,该序列包含1425bp的HDR基因ORF,编码474个氨基酸残基的蛋白,其预测分子量为53.2kD,等电点预测为5.76。功能互补分析表明,GbHDR能推动工程菌XL1-Blue＋pTrcGbHDR＋pAC-BETA超量表达β-胡萝卜素,在颜色互补平板上呈现β-胡萝卜素特有的橘黄色,证实GbHDR具有典型的HDR基因功能。[结论]获得1株可高量积累β-胡萝卜素的大肠杆菌工程菌,为最终实现β-胡萝卜素代谢工程提供侯选基因和作用靶点。     

小鼠IL-5真核表达质粒的构建及表达

[目的]克隆小鼠白细胞介素-5（mIL-5）cDNA构建真核表达质粒,并转染293细胞检测其是否表达。[方法]以小鼠脾脏细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-5基因cDNA,酶切后插入pRc-CMV/Fc真核表达质粒中,构建重组真核表达质粒mIL-5/Fc-pRc-CMV,转染293细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。[结果]Fc-pRc-CMV中插入DNA序列与mIL-5 cDNA一致,重组质粒转染293细胞后,ELISA可检测出质粒能在293真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。[结论]该研究成功克隆了小鼠IL-5基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

银杏HDR基因的克隆与功能分析（摘要）（英文）

[目的]获得银杏HDR基因的克隆并研究HDR基因的功能。[方法]采用RT-PCR技术获得银杏HDR的全长cDNA,命名为GbHDR（GenBank登录号：DQ364231）,该基因cDNA全长为1 827 bp,包含1 425 bp的开放阅读框,编码474个氨基酸残基的蛋白;并构建GbHDR的原核表达载体pTrcGbHDR,与原核表达载体pAC-BETA共转入大肠杆菌XL1-Blue,获得β-胡萝卜素工程菌。[结果]克隆基因实际长度为1 441 bp的GbHDR基因,该序列包含1 425 bp的HDR基因ORF,编码474个氨基酸残基的蛋白,其预测分子量为53.2 kD,等电点预测为5.76。功能互补分析表明,GbHDR能推动工程菌XL1-Blue ＋pTrcGbHDR＋pAC-BETA超量表达β-胡萝卜素,在颜色互补平板上呈现β-胡萝卜素特有的橘黄色,证实GbHDR具有典型的HDR基因功能。[结论]获得1株可高量积累β-胡萝卜素的大肠杆菌工程菌,为最终实现β-胡萝卜素代谢工程提供侯选基因和作用靶点。     

草鱼BPI/LBP基因的克隆及特征研究

【目的】克隆草鱼杀菌通透性增加蛋白/脂多糖结合蛋白（Bactericidal permeability-increasing protein/LPSbinding protein,BPI/LBP）基因的cDNA全长,分析其结构特征,研究其表达规律,为进一步探明其功能奠定基础。【方法】首先用同源克隆及快速扩增cDNA末端技术(RACE),克隆草鱼BPI/LBP基因的cDNA全长,然后用生物信息学方法分析BPI/LBP基因的结构特征,最后用半定量RT-PCR检测BPI/LBP基因在草鱼不同组织（血、脑、眼睛、前肠、中肠、后肠、鳔、鳃、头肾、中肾、心脏、肝胰脏、肌肉、皮肤和脾脏）中的表达模式。【结果】草鱼BPI/LBP cDNA全长1 568 bp,编码473个氨基酸,其中包括18个氨基酸组成的信号肽、BPI1结构域（BPI/LBP/CETP N-terminal domain）和BPI2结构域（BPI/LBP/CETP C-terminal domain）。该蛋白的分子质量为51 551 u,等电点为8.69。氨基酸序列同源性分析结果显示,草鱼与鲤鱼BPI/LBP的同源性最高（90%）,其次为虹鳟（73%）、斑点叉尾鮰（73%）、香鱼（72%）等。在系统进化树中,草鱼BPI/LBP首先与鲤科的鲤鱼聚为一类。通过半定量RT-PCR分析可知,草鱼BPI/LBP基因在被检测的15个组织中都有表达,其中在鳃中的表达量最高,其次为头肾、中肾等。【结论】成功克隆了草鱼BPI/LBP基因的cDNA全长,该基因在草鱼体内不同组织中广泛表达。