奶牛脂肪来源间充质干细胞的分离培养及其生物学特性研究

[目的]建立奶牛脂肪间充质干细胞(AD-MSCs)体外分离培养体系,并进行增殖能力检测、分化能力鉴定及生物学特性研究,为推广AD-MSCs在畜牧生产及其疾病治疗等方面的应用提供理论依据.[方法]通过I型胶原酶消化法分离奶牛AD-MSCs并进行代传培养,绘制P3、P6和P9代奶牛AD-MSCs的生长曲线及测定其群体倍增时间,分别采用流式细胞术及RT-PCR检测细胞表面标志物;使用干细胞成骨/成脂诱导分化完全培养基进行奶牛AD-MSCs成骨成脂诱导分化,经茜素红和油红O染色后鉴定其成骨成脂分化能力;并检测冻存奶牛AD-MSCs复苏后的存活率.[结果]分离及传代培养获得的奶牛AD-MSCs在体外培养条件下呈长梭形,折光性强,生长状态良好,其生长曲线呈典型的S形,符合Logistic生长规律.奶牛AD-MSCs高表达MSCs表面标志物CD44、CD73、CD90和CD105,但不表达白细胞表面标志物CD45;分别使用干细胞成骨/成脂诱导分化完全培养基诱导的奶牛AD-MSCs经茜素红和油红O染色后,显微镜下可观察到大量的钙结节和红色脂肪滴.冻存6个月后进行细胞复苏,奶牛AD-MSCs的存活率高达96%;复苏奶牛AD-MSCs培养4 h内贴壁,呈典型的长梭形,生长状态良好,培养72 h细胞融合达80%~90%.[结论]通过I型胶原酶消化法从奶牛腹部脂肪组织分离获得的奶牛AD-MSCs具有良好的体外增殖能力及多向分化潜能,为畜牧生产研究及奶牛疾病治疗提供了一种良好的种子细胞来源.     

奶牛脐带间充质干细胞的体外培养与鉴定

[目的]在无菌环境下截取新生牛脐带20 cm,在体外进行原代奶牛脐带间充质干细胞分离培养,建立原代奶牛脐带间充质干细胞分离、培养、传代的方法,并进行形态学观察和多向分化能力检测.[方法]采用多重酶混合消化法,分离出原代奶牛脐带间充质干细胞,通过倒置显微镜下观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,向成脂、成骨诱导分化.[结果]培养出了奶牛脐带间充质干细胞.倒置显微镜下观察,细胞形态呈相对均一的梭形,平行排列生长或呈旋涡状生长.能够诱导分化为成脂、成骨细胞.细胞增殖能力强,可多次传代.[结论]胰酶消化法能够快速分离出原代奶牛脐带间充质干细胞,所获得的细胞纯度较高,具有一般间充质干细胞的生物学特性,具有多向分化潜能.     

羚牛骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

分离鉴定羚牛骨髓间充质干细胞,为开展羚牛细胞治疗与体细胞核移植的深入研究提供有效载体。分离培养来源于羚牛骨髓的间充质干细胞;通过染色体G显带技术进行核型分析;利用流式细胞技术检测细胞表面标记物;通过定向诱导培养探究细胞的分化潜能。结果表明,羚牛骨髓间充质干细胞能够维持正常核型,对间充质干细胞特异性表面标记 CD105、CD73、CD90、CD166、CD44呈阳性,对 CD14(单核细胞和巨噬细胞标记物),CD19(b细胞标记物),CD34(造血干细胞标记物),CD45(泛白细胞标记物)和 HLA-DR均呈阴性,具有成脂、成骨与成软骨多向分化潜能。表明成功分离羚牛骨髓间充质干细胞并对其表面抗原与分化潜能进行鉴定,为羚牛生物多样性保护与内源物种间充质干细胞的应用研究奠定基础。     

荷斯坦牛脐带间充质干细胞分离鉴定及分化研究

动物干细胞作为重要遗传种质资源和再生医学的可行性资源，拥有广阔研究和应用前景。对荷斯坦牛脐带细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs）进行分离、鉴定，并对其多向分化潜能等生物学特性进行研究。取3月龄健康荷斯坦牛胎牛脐带，采用Ⅳ型胶原酶分离细胞进行体外培养，获得的细胞贴壁后呈长梭形，生长曲线呈典型的“S”形，群体倍增时间随着代次的升高逐渐下降。免疫荧光和RT-PCR的检测结果都表明，分离的细胞中CD29、CD73、CD90、CD166均阳性表达，而CD45不表达。成脂肪诱导后，可见被油红染色液染色的脂滴，成脂肪关键基因LPL和PPAR-γ都阳性表达；成骨诱导分化后，可见被茜素红染色的钙结节，其表达成骨关键基因骨桥蛋白OPN和Ⅰ型胶原蛋白基因COL-Ⅰ；成软骨诱导分化后，可见被阿利新蓝染色的软骨组织，表达成软骨细胞关键基因转录因子基因SOX9和ACAN。成功从3月胚龄的荷斯坦牛脐带中分离出其具有良好的增殖活力及成脂肪、骨和成软骨能力的间充质干细胞，可为动物种质资源保存和再生医学提供依据和潜在可利用细胞资源。     

北京油鸡胚胎肝脏间充质干细胞的生物学特性

从7日龄北京油鸡胚胎肝脏中分离间充质干细胞,原代培养并传代至15代,免疫荧光法检测造血祖细胞/肝卵圆细胞的表面标志物CD34、CK19呈阴性表达; RT-PCR检测CD29、CD44、CD71、CD73呈阳性表达。尝试不同培养条件对细胞生长曲线的影响,选取最佳培养方案,同时对细胞进行细胞周期测定。肝脏间充质干细胞通过不同诱导液被成功诱导分化成脂肪细胞、心肌细胞,结果表明,从鸡胎肝中分离获得的间充质干细胞具有和人类间充质干细胞相似的生物学特性及分化潜能,其所具有多向分化的潜能,为今后临床广泛应用提供了可能。     

鸡脂肪源间充质干细胞的分离与鉴定

【目的】建立鸡脂肪源间充质干细胞的分离与鉴定方法.【方法】用I型胶原酶消化法分离天露黄鸡脂肪间充质干细胞(AMSCs),CCK-8检测细胞生长活力,RT-PCR鉴定其特异性标记物,化学法对其进行成脂和成骨分化诱导.【结果和结论】原代及传代的细胞呈成纤维细胞样形态,并能传代至10代,其活力无明显变化;细胞生长曲线呈S型;RT-PCR检测显示AMSCs的特异性标志物CD71、CD44和CD29表达呈阳性,而属于造血干细胞的特异性标志物CD34和CD45呈阴性;AMSCs通过不同诱导液被成功诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,在成脂分化过程中有脂滴形成,油红O染色呈阳性,过氧化物酶体增殖物激活受体基因γ(PPARγ)和脂肪酸基因(FAS)的mRNA表达量升高;在成骨分化过程中有钙结节形成,茜素红染色呈阳性,碱性磷酸酶(ALP)活性检测对照组与诱导组比较差异显著(P﹤0.05),ALP基因和骨形态发生蛋白基因(BMP2)的mRNA表达量升高.研究表明,鸡AMSCs具有分化为多种细胞的潜能.     

绵羊脐带间充质干细胞的分离、体外培养及诱导分化

通过多重酶混合消化法和胰酶消化筛选法体外分离、纯化及培养绵羊脐带间充质干细胞(MSCs),并观察其生物学特性,以此建立绵羊脐带间充质干细胞的分离培养流程.试验采集健康的哈萨克羔羊脐带组织,剔除血管后剪碎,添加复合消化酶消化24 h得到细胞,胰酶消化法筛选除杂并观察细胞形态,绘制第1代、第5代及第10代细胞生长曲线;取第10代细胞检测其体外诱导成骨细胞能力和诱导成脂细胞能力,cAKP染色检测其分化状态.结果表明,获得的细胞经传代培养达10代后无明显的形态和增殖能力改变;体外诱导成骨细胞和成脂细胞试验证明其具有被诱导分化成骨细胞和脂肪的能力,cAKP染色证明其处于未分化状态.试验获得的绵羊脐带间充质干细胞能在体外培养、扩增并且具有和骨髓间充质干细胞类似的生物学特征.     

体外定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

[目的]分离和克隆小鼠骨髓间充质干细胞,并诱导分化为神经元样细胞。[方法]利用Percoll密度梯度离心的方法进行小鼠骨髓间充质干细胞分离及培养,分别采用β-巯基乙醇和BHA诱导分化为神经元样细胞。用神经元特异性烯醇化酶和神经纤维丝蛋白免疫细胞化学方法对已分化的神经元样细胞进行鉴定和分化率分析。[结果]经2种诱导剂诱导的小鼠骨髓间充质干细胞均出现神经元样细胞的分化,胞体呈神经元状,伸出较长轴突样和树突样突起且有分支。而且免疫细胞化学鉴定显示,诱导分化后的神经元样细胞神经元特异性烯醇化酶染色和神经纤维丝蛋白免疫细胞化学染色均呈阳性,β-巯基乙醇诱导分化细胞表达NSE的阳性率为（86.8±2.7）%;诱导分化细胞表达Neurofilament200 kD的阳性率为（75.2±2.3）%;BHA诱导分化细胞表达NSE的阳性率为（80.5±2.2）%;诱导分化细胞表达Neurofilament200 kD的阳性率为（73.2±1.6）%。[结论]小鼠骨髓间充质干细胞能够在诱导剂β-巯基乙醇和BNA的诱导下体外诱导分化为神经元样细胞。     

犬骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

为了体外高效快捷地分离培养犬(canine)骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),实验分别用全骨髓差速贴壁法和密度梯度离心法对犬BMSCs进行分离培养,利用免疫组化和流式细胞术检测获得细胞的表面标志抗体,并用成骨和成脂方向的诱导分化等方法对其进行鉴定。结果表明,全骨髓差速贴壁法和密度梯度离心法都能成功培养出犬BMSCs,但后者相对前者获得的细胞经培养后其原代细胞分布更均匀,原代培养达到传代所需的时间更短,成活率更高;两种方法获得的P3和P8细胞的生长曲线基本保持一致;免疫组化和流式细胞术检测犬BMSCs表达CD105、CD90和CD29,但是不表达CD34和CD31;且能成功诱导为成骨细胞和脂肪细胞。证明采用全骨髓差速贴壁法和密度梯度离心法均能够成功分离和培养犬的BMSCs,而密度梯度离心法是一种较全骨髓差速贴壁法更适合犬BMSCs的分离方法。     

犊牛脂肪干细胞的分离、培养与鉴定

为给奶牛营养代谢病等相关研究提供种子细胞,本试验从犊牛肾周脂肪组织中分离出脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs),采用组织剪碎法结合0.25%Ⅰ型胶原酶消化法消化、收集原代犊牛ADSCs,通过细胞形态学观察,使用免疫荧光染色法检测第5代ADSCs表面特异性蛋白,并使用CCK-8法测定第5、10代细胞生长曲线,观察第10代细胞的成脂、成骨分化能力。结果显示,分离出的犊牛ADSCs接种4 d后细胞呈成纤维细胞样生长;免疫荧光染色结果显示,分离的细胞Vimentin、CD34、CD44、CD90呈阳性,CD31、CD45呈阴性;该细胞在适当的诱导条件下可以定向分化为脂肪细胞和成骨细胞。本试验分离培养的细胞是犊牛脂肪干细胞,具有成脂、成骨分化能力。     

马脐带间充质干细胞的分离培养与生物学特性研究

【目的】建立马脐带间充质干细胞（UC-MSCs）体外分离培养体系,研究其增殖能力、分化能力和生物学特性,为推广UC-MSCs在赛马运动损伤治疗方面的应用提供理论依据。【方法】采用I型胶原酶消化法从脐带组织分离马UC-MSCs,通过绘制生长曲线及计算群体倍增时间检测其体外增殖能力,结合流式细胞仪检测和RT-PCR扩增鉴定表面标志物（CD29、CD44、CD45、CD73、CD90和CD105）,并通过体外成脂成骨诱导分化检测其分化潜能。【结果】分离获得的原代马UC-MSCs为折光性强的圆形悬浮细胞,培养10 d后细胞融合达90%,且传代后细胞增殖速度明显提高,传代至P3代,细胞呈旋涡状生长,形态为均一的长梭形,生长趋势符合Logistic生长曲线规律,呈典型的S形。流式细胞仪检测结果显示,马UC-MSCs高表达CD29、CD44和CD90,表达率分别为98.45%、97.08%和96.56%,呈强阳性,但不表达CD45;RT-PCR扩增结果表明,马UC-MSCs表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105等MSCs表面标志物基因,但不表达CD45基因。以胰岛素、IBMX、罗格列酮和地塞米松为主要试剂进行马UC-MSCs体外成脂诱导,诱导第10 d发现细胞内有小脂滴形成,至诱导第18 d有大量脂滴形成;选用抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松为主要试剂进行体外成骨诱导,至诱导第7 d可观察到钙结节形成。【结论】采用I型胶原酶消化法分离获得的马UC-MSCs纯度高,且具有良好的体外增殖能力和多向分化潜能;掌握好马UC-MSCs的有效冻存方式,可为治疗赛马运动损伤提供优质的种子细胞。     

兔脂肪间充质干细胞分离培养及鉴定

为了建立一种体外培养兔脂肪间充质干细胞(ADSCs)的方法,在无菌条件下取家兔双侧腹股沟脂肪垫,Ⅰ型胶原酶消化后,用含10%胎牛血清的DMEM 培养液培养.细胞连续传代后,MTT法检测第3、5、10代细胞的增殖情况.采用油红染色法和Von Kossa染色法观察第3代ADSCs向成脂和成骨方向分化情况,并采用流式细胞仪分析细胞表面标志.结果显示,第3、5、10代的ADSCs生长曲线并无显著差异,细胞增殖较快;ADSCs成脂诱导后油红染色阳性,成骨诱导后Von kossa染色形成典型的黑色钙化结节.ADSCs 表面标志检测结果为:CD29 和CD90阳性,CD45和CD80阴性.成功分离和培养了兔的ADSCs,其具有成脂和成骨潜能,可作为组织工程的种子细胞.     

梅山猪骨髓间充质干细胞的分离培养及生物学特性分析

为建立梅山猪骨髓间充质干细胞(BMSC)体外分离培养方法及对梅山猪BMSC的生物学特性进行分析,本研究采用全骨髓法分离培养并传代梅山猪BMSC,倒置相差显微镜下观察细胞形态,以计数法检测细胞增殖状况,流式细胞术检测细胞周期,细胞压片进行染色体分析,免疫细胞化学和RT-PCR法检测细胞表面标志和转录因子的表达情况,并检测成骨和成脂分化能力.结果显示:梅山猪BMSC体外生长良好,细胞形态呈成纤维细胞样,具有稳定分裂增殖能力;CD29、CD44、CD90等表面标志基因及Fou5F1、Sox2、Nanog等转录因子基因表达呈阳性,CD45、Lin28表达呈阴性;在特定诱导液作用下,BMSC可分化为成骨样细胞及成脂肪样细胞.采用全骨髓法成功分离培养出大量纯度较高的梅山猪BMSC,其生长状态良好,可作为后续BMSC相关研究的种子细胞.     

鸭胚脐带间充质干细胞的分离培养及其生物学特性

为了给脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)的临床应用提供依据,以鸭胚UCMSCs为研究对象,采用胶原酶Ⅳ消化法分离脐带间充质干细胞,用表面标记分子CD29,CD44,CD71,CD73对纯化细胞进行鉴定,建立了鸭胚UCMSCs的体外培养体系。结果表明,UCMSCs能够诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞,证明了鸭胚UCMSCs的多能性。     

蒙古马脂肪来源间充质干细胞体外成脂和成骨诱导分化

取蒙古马背臀部皮下脂肪组织,通过Ⅰ型胶原酶消化、离心等步骤分离培养脂肪组织来源的间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADSCs),经过原代培养和传代培养,分别加入成脂诱导剂和成骨诱导剂培养,采用倒置显微镜观察诱导后的细胞形态变化,并通过油红O染色和茜...     

转EGFP基因猪胎儿神经干细胞的体外分化

 【目的】获得转EGFP基因神经干细胞并监测其自我更新、增殖和多向分化潜能;通过用EGFP对神经干细胞进行标记和体外追踪实验,为EGFP作为示踪标记对神经干细胞进行体内移植研究奠定基础。【方法】利用神经干细胞培养技术体系,从胎龄30 d猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入神经干细胞,诱导转基因神经干细胞贴壁分化,观察其体外增殖、分化特点。采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。【结果】成功分离培养出神经干细胞,获得转EGFP基因神经干细胞,神经干细胞在表达EGFP的同时仍具有多向分化潜能。神经干细胞中Nestin表达强阳性,NogoA、DCX、CyclinD2、CD133、Hes1、Oct4、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2);能分化为脂肪细胞(表达LPL和PPARγ-D)、成骨细胞(表达Osteonectin和Osteocalcin)、肌细胞(表达myf-5、myf-6和myoD)、内皮细胞(表达CD31、CD34、CD144和eNOS)和软骨细胞(表达COL2A1)。【结论】从猪胎儿大脑组织分离神经干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因神经干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能,可以用EGFP对神经干细胞进行标记、追踪,作为示踪标记进行神经干细胞体内移植研究。     

牛胎肺间充质干细胞体外培养及生物学特性研究

[目的]建立牛胎肺间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）体外培养体系并对其进行生物学特性研究。[方法]取3～5月龄牛胎儿肺脏,得到MSCs。通过控制胰酶消化时间,去除难消化的上皮样贴壁细胞,获得纯化的牛肺MSCs,研究其形态、增殖情况及体外诱导分化潜能。[结果]牛胎肺MSCs可在体外扩增培养,传至24代以上,表达CD29、CIM4和CDl66,不表达CDM、CIM5和BOL-DR,并具有向成骨细胞诱导分化的潜能。[结论]从牛胎肺中可以分离出MSCs,可以在体外培养,并可诱导分化为成骨细胞。     

山羊骨髓间充质干细胞生物学性能鉴定及诱导分化为心肌细胞的研究

 研究了关中奶山羊骨髓间充质干细胞的分离、培养和生物学特性，并在体外诱导分化为心肌细胞表型。结果表明，山羊MSCs具有很好增殖能力；能够耐受反复冷冻和解冻；表达细胞表面标志CD44、CD105、CD166，弱表达CD34、CD106，而不表达CD14、CD45。该类细胞用5-氮胞苷诱导分化后，能够表达心肌α-actin，并呈PAS染色阳性。     

山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及向神经细胞诱导分化的研究

采用体外细胞培养技术将山羊胎儿骨髓中的干细胞从骨髓血中分离并培养扩增;分别用含β-巯基乙醇或当归的培养液诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞,免疫组织化学鉴定神经丝蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达.结果表明,通过贴壁培养法,可使低丰度的山羊骨髓间充质干细胞在体外实现分离扩增;诱导后的细胞强表达神经丝蛋白和神经元特异性烯醇化酶.还建立了一种简单易行的体外分离与培养山羊骨髓间充质干细胞的方法,同时表明山羊骨髓间充质干细胞同样具有分化为神经细胞的潜能,为今后对某些疾病的治疗提供了理想的动物模型.     

间充质干细胞应用研究进展

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类具有高度自我更新、多向分化潜能和低免疫原性的干细胞,来源广泛,从骨髓、脐带血、脂肪、牙髓等多种组织中均可获得,因在不同的诱导环境下可分化为多种组织和细胞,如神经细胞、心肌细胞、骨、软骨、胰岛细胞等,使MSCs在治疗自身免疫性疾病、神经系统疾病、心血管疾病及血液系统疾病等方面有重要的研究和应用价值。结合MSCs的生物学特性综述了其在疾病治疗中的应用及进展。