水稻干旱胁迫诱导DNA甲基化时空变化特征分析

 【目的】研究水稻抗旱导入系DK106和旱敏感轮回亲本IR64苗期和分蘖期干旱胁迫前后DNA甲基化的变化情况,并比较分析叶片和根部DNA甲基化变化特征,探讨DNA甲基化在水稻干旱胁迫反应中的作用。【方法】用甲基化敏感扩增多态性技术（methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP）和高效液相层析（high performance liquid chromatography,HPLC）方法分析DNA甲基化变化情况;从聚丙烯酰胺凝胶回收甲基化多态性片段并克隆测序及序列比对。【结果】MSAP分析结果显示,水稻基因组中约有20%的CCGG位点发生了胞嘧啶甲基化;水分胁迫导致DNA甲基化平均水平明显增加,其中根部增加幅度尤为明显;DNA甲基化水平及状态变化在品种间存在差异,同时具有时期及组织特异性。对干旱胁迫特异诱导DNA甲基化片段序列分析结果表明,基因编码区和非编码区发生DNA甲基化的频率基本相同。【结论】干旱胁迫反应过程中DNA甲基化表现出一定时空特异性和品种特异性,且与品种抗旱性差异相关。     

家鸡胚胎发育过程DNA甲基化的MSAP检测

[目的]检测鸡胚不同发育阶段时的DNA甲基化水平。[方法]以不同发育阶段的家鸡胚胎为试验材料,提取基因组DNA,采用甲基敏感扩增片段多态性（methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP）技术对其甲基化水平进行了初步检测。[结果]共发现甲基化位点880个,CCGG位点单链外侧的胞嘧啶甲基化位点比例为20．48％,双链CCGG位点的内侧胞嘧啶甲基化19．30％,两者总比例为39．78％。[结论]鸡胚发育过程,DNA甲基化随着胚胎的发育呈升高趋势。     

冷驯化草莓组培苗DNA甲基化水平及模式的变化

DNA甲基化是植物表观遗传的重要方式之一,非生物胁迫会引起植物DNA甲基化水平及模式的改变。为探讨草莓的低温响应与DNA甲基化的关系,本文以章姬组培苗为材料,利用甲基化敏感多态性技术(MSAP)检测冷驯化(4℃)不同时间及恢复后的植株DNA甲基化水平及模式变化。结果表明,14对选择性引物在冷驯化过程中共检测出2499个基因位点;冷驯化过程中,DNA总甲基化水平整体呈下降趋势,0 d、1 d、3 d、5 d、7 d和10 d,基因组MSAP比率分别为27.17%、20.73%、25.77%、22.69%、22.69%和22.41%,恢复5 d后MSAP比率上升为26.05%;在DNA甲基化模式变化方面,有甲基化和去甲基化现象发生,且以去甲基化现象为主。回收、克隆并测序某些草莓基因组的甲基化修饰位点,分离得到5条存在甲基化修饰的基因组DNA序列。BLAST比对分析表明,在这些序列中都存在明显的"CCGG"二核苷酸成簇富集现象,与MSAP结果一致。     

水稻Osrdr1突变体全基因组CCGG位点甲基化的研究

DNA胞嘧啶甲基化变异调控植物基因组内功能基因表达和转座子转座活性,影响植物生长和发育的稳定性。RNA-dependent RNA polymerase 2(RDR2)基因参与RNA-directed DNA methylation(RdDM)途径指导合成CHH(H=G、T、A)甲基化,CHH甲基化在基因和转座子上表现不同,是目前DNA胞嘧啶甲基化的研究热点之一。拟南芥中RDR1基因与RDR2属于同一家族,最新研究结果证实,RDR1基因不仅可以指导CHH甲基化形成,并且其功能缺失会不同程度影响CG和CHG甲基化。前期研究工作表明,水稻中其同源基因OsRDR1功能缺失可在特异位点影响DNA胞嘧啶甲基化,但是否大规模影响全基因组DNA甲基化尚不明确。在此基础上,采用甲基化敏感多态性扩增(Methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术研究OsRDR1基因功能缺失突变体全基因组CCGG位点的甲基化情况。结果同野生型比较分析发现,OsRDR1基因功能缺失没有引起全基因组CCGG位点甲基化水平的显著变化,但一定程度产生CHG去甲基化变异。由于MSAP试验方法的局限性,关于Osrdr1突变体全基因组DNA胞嘧啶甲基化变异还需更深入研究论证。     

NaCl胁迫对黄瓜种子萌发的影响及DNA甲基化的MSAP分析

【目的】研究黄瓜种子萌发过程中DNA甲基化动态变化情况以及外源施加NaCl对种子萌发及种子DNA甲基化水平的影响,探索DNA甲基化在黄瓜种子萌发过程及NaCl胁迫反应中的作用。【方法】运用甲基化敏感扩增多态性（methylation se nsitive amplified polymorphism,MSAP）技术,分析0、150、200 mmol•L-1 NaCl处理下,黄瓜种子萌发过程（0、1、2、4、6、8 d）的DNA甲基化水平及动态变化情况。【结果】MSAP结果显示,黄瓜种子CCGG位点的甲基化水平约15.25%,以双链甲基化方式为主。种子中DNA甲基化水平在萌发1—2 d略有升高,而在整个萌发过程中呈下降趋势;NaCl处理加剧了甲基化的变化幅度,并使萌发末期的甲基化水平更低。萌发过程中甲基化升高和降低同时发生,分别在不同萌发时期占主导,不同变化类型中CG/CHG（H=A,T,C）位点胞嘧啶甲基化同时变化的类型占主导。甲基化变化同时发生在编码序列和非编码序列中。【结论】黄瓜种子萌发过程的DNA甲基化表现出复杂性,甲基化和去甲基化进程同时进行,并具有时空特异性。NaCl处理降低了种子基因组甲基化水平的稳定性,对种子萌发有抑制作用。     

橡胶树MSAP反应体系的建立及其对无性系DNA的甲基化分析

采用改良CTAB法提取橡胶树幼嫩叶片的基因组DNA,通过电泳检测酶切与连接、预扩增和选择性扩增等,建立橡胶树MSAP甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析体系,并利用MSAP技术在基因组水平上对橡胶树幼态优势的形成机理进行研究。结果表明:利用该体系可获得扩增位点多、条带清晰、重复性好的图谱(共扩增出740个条带,404个甲基化位点,平均多态性比例为54.6%),并能有效区分基因组DNA甲基化的状态,为开展橡胶树同一品种不同类型种植材料的表观遗传变异研究奠定了基础。     

NaCl和Na2CO3对不同棉花基因组的DNA甲基化影响

【目的】探究不同盐胁迫后的棉花基因组DNA甲基化变化情况,并比较分析叶片和根部DNA甲基化变化差异,进而探究DNA甲基化与棉花耐盐性之间的关系。【方法】以陆地棉耐盐品种中9806和盐敏感品种中S9612为试验材料,分别用NaCl和Na2CO3（浓度均为0.4%）处理。提取对照和处理材料的DNA,进行双酶切、连接、预扩增和选择性扩增,然后采用MSAP技术（甲基化敏感扩增多态性）分析棉花幼苗在盐胁迫前后的DNA甲基化情况。从聚丙烯酰胺凝胶中回收纯化多态性片段并进行测序,通过NCBI进行比对分析;设计引物,用实时荧光定量PCR对多态性片段在棉花幼苗中的表达量进行验证。【结果】盐胁迫分析表明不同类型盐胁迫对棉花幼苗的影响不同;0.4%的中性盐NaCl对棉花幼苗的影响相对较小,各部分组织的形态变化不明显,而0.4%的碱性盐Na2CO3对棉花幼苗的影响较大,使棉花幼苗子叶变软,茎基部和根部发黑;MSAP分析结果表明,NaCl胁迫后中9806和中S9612叶片的甲基化比率分别为23.5%和27.7%,其中,全甲基化比率分别为20.3%和22.9%,根部的甲基化比率分别为24.7%和27.1%,其中,全甲基化比率分别为19.6%和21.6%;Na2CO3胁迫后中9806和中S9612叶片的甲基化比率分别为28.9%和28.1%,其中,全甲基化比率分别为24.3%和24.5,根部的甲基化比率分别为25.7%和27.6%,其中,全甲基化比率分别为21.5%和24.0%。叶片和根部甲基化水平存在差异,随着盐类型由中性盐向碱性盐转变的过程中,基因组DNA甲基化水平迅速增加,并在Na2CO3处达到最大值。通过分析胁迫以后的甲基化状态,在NaCl和Na2CO3胁迫后,中9806叶片的甲基化条带所占多态性条带比率分别为40.00%和50.00%,去甲基化条带所占多态性条带比率分别为54.12%和46.67%,中9806根部的甲基化条带所占多态性条带比率分别为35.53%和43.59%,去甲基化条带所占多态性条带比率分别为56.58%和51.28%。而中S9612叶片和根部中的甲基化条带比率和去甲基化条带比率的变化不明显。对多态性片段回收共获得6条序列,这6条序列涉及不同的同源基因,在基因编码区和非编码区均有分布,参与不同的代谢反应。qRT-PCR分析结果表明,6个同源基因在对照和处理之间的表达差异显著。【结论】耐盐性不同的棉花品种对盐胁迫反应不同,耐盐品种中9806在中性盐NaCl胁迫后基因组甲基化水平降低,诱导相关耐盐基因表达来抵抗胁迫而盐敏感品种中S9612则缺乏相应的耐盐基因使植株受到伤害增加,在Na2CO3处理以后受到伤害最大,对照与处理间甲基化水平差异显著,叶片和根部甲基化水平存在差异,具有组织特异性;多态性片段比对分析可知,同源性基因涉及多条代谢途径,通过多种代谢途径间的协同作用来抵抗胁迫。     

鹿茸干细胞基因组DNA甲基化的检测方法

以鹿茸干细胞为研究对象,分别采用甲基化敏感性扩增多态性(MSAP)和荧光标记甲基化敏感性扩增多态性(F-MSAP)方法对鹿茸干细胞进行全基因组DNA甲基化检测。结果表明:MSAP方法共检测到387个位点,F-MSAP方法共检测出1 524个位点。2种方法所得结果中均发现Ⅰ型条带数最多,Ⅲ型条带数最少。与MSAP方法比较,F-MSAP方法在数据分析和实际操作过程中具有安全、高效、高通量、自动化等特点,更适用于检测鹿茸干细胞基因组DNA甲基化。     

大麦不同组织成熟过程中DNA甲基化的MSAP分析

DNA甲基化参与调控生长植物发育。使用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)方法并结合毛细管自动电泳分析仪,对大麦(Hordeum vulgare L)的种子、根、茎、叶等4种组织在成熟过程中的DNA甲基化修饰进行了分析。结果表明,大麦不同组织在成熟过程中基因组总甲基化水平改变较小,但44.90%~65.17%的CCGG位点甲基化模式在不同组织在成熟过程中发生了改变。在大麦种子成熟过程中,CCGG位点半甲基化水平急剧升高,达到65.40%,全甲基化位点显著下降仅为13.39%,与其他组织的甲基化特征差异显著。结果显示,在大麦组织成熟的过程中,DNA甲基化修饰发生了巨大的变化。     

20株香菇菌株的ISSR和F-MSAP分析

利用简单序列重复区间扩增多态性(inter-simple sequence repeat,ISSR)和荧光标记甲基化敏感扩增多态性(fluorescence-labeled methylation-sensitive amplified polymorphism,F-MSAP)分子标记技术对收集到的20株香菇Lentinula edodes菌株进行遗传及甲基化多样性分析。ISSR结果表明,8对引物共可扩增出98条稳定清晰可辨的条带,其中多态性条带89条,多态性比率为90.82%,样品间的遗传相似系数范围为0.520 4~0.9897。F-MSAP结果表明,15对引物共扩增产生13 487个CCGG位点。在全部检测位点中,半甲基化位点为1 704个,平均半甲基化率12.6%;全甲基化位点为1 865个,平均全甲基化率13.8%。进一步将MSAP数据分为甲基化敏感多态性(methylation sensitive polymorphism,MSP)和甲基化不敏感多态性(methylation insensitive polymorphism,MISP)。Mantel检测结果表明,ISSR与MISP分子标记的分析结果有显著的相关性,但ISSR与MSP分子标记的分析结果无显著相关性。说明香菇不同株系间广泛存在DNA甲基化多样性,在育种中具有重要的应用价值。     

氯化钠胁迫下的蒙古黄芪基因组MSAP分析

利用甲基化敏感扩增多态性(Methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术研究高盐胁迫过程中蒙古黄芪(Astragalus membranaceus)基因组DNA甲基化变化.结果表明,扩增22对引物共检测出不同盐浓度间甲基化位点179个.总体趋势是高盐引起蒙古黄芪...     

Patterns of Cytosine Methylation in Parental Lines and Their Hybrids of Large White and Meishan Reciprocal Crosses

The extent and patterns of cytosine methylation in blood DNA were assessed, using the technique of methylation-sensitive amplified polymorphism(MSAP),in Meishan, Large White pigs and hybrids of their reciprocal crosses. In all, 1 508 fragments, each representing a recognition site cleaved by either or both of the isoschizomers, MspI and HpaII, were amplified using 20 pairs of selective primers. 10.3% of CCGG sites were methylated in Meishan pigs, 10.5% in Large White pigs, and 10.2% in the hybrids. Cytosine methylation was not significantly different among parental lines and hybrids of reciprocal crosses. Four classes of patterns were identified in a comparative assay of cytosine methylation in the parents and hybrids: (1) the same level of methylation in both parental lines and the hybrids; (2) the same level of methylation in either parent or hybrid; (3) an increased level of methylation in the hybrids compared to the parents, and (4) a decreased level of methylation in the hybrids. 11 crossspecific methylation sites were detected in F1 hybrids of Large White×Meishan, and 10 crossspecific methylation sites in the hybrid of Meishan×LargeWhite. In conclusion, (1) the whole methylation status between parental lines and hybrids was not different, but specific sites were differentially methylated; (2) specific sites were differentially methylated between reciprocal crosses; (3) demethylation and hypermethylation of many sites accounted for mostly (more than 50%) methylated sites in the hybrids compared to parental lines.     

DNA methylation patterns of banana leaves in response to Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4

Fusarium wilt of banana, which is caused by Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4(Foc TR4), is a serious soil-borne fungal disease. Now, the epigenetic molecular pathogenic basis is elusive. In this study, with methylation-sensitive amplification polymorphism(MSAP) technique, DNA methylation was compared between the leaves inoculated with Foc TR4 and the mock-inoculated leaves at different pathogenic stages. With 25 pairs of primers, 1 144 and 1 255 fragments were amplified from the infected and mock-inoculated leaves, respectively. DNA methylation was both changed and the average methylated CCGG sequences were 34.81 and 29.26% for the infected and the mock-inoculated leaves. And DNA hypermethylation and hypomethylation were induced by pathogen infection during all pathogenic stages. Further, 69 polymorphic fragments were sequenced and 29 of them showed sequence similarity to genes with known functions. And RT-PCR results of four genes indicated that their expression patterns were consistent with their methylation patterns. Our results suggest that DNA methylation plays important roles in pathogenic response to Foc TR4 for banana.     

Study on DNA Cytosine Methylation of Cotton （Gossypium hirsutum L.） Genome and Its Implication for Salt Tolerance

To study the relations between DNA methylation and abiotic stress responses in cotton （Gossypium hirsutum L.）,the methylation-sensitive amplified polymorphism （MSAP） method was used to investigate the differences in methylation level and the change of cytosine methylation patterns under salt （NaCl） stress in two different salt-tolerant cotton lines.The results showed that the number of the cytosine methylation of CCGG sites in high salt-tolerant cotton line was less than that in low salt-tolerant line.Under salt stress,extensive cytosine methylation alterations including hypermethylation and demethylation as well as the potential conversion of methylation types occurred in the salt-treated cotton line compared with the corresponding control.Interestingly,salt stress-induced demethylation loci that occurred in high salt- tolerant cotton line were greater than those in low salt-tolerant cotton line,however,salt stress-induced hypermethylation loci in the high salt-tolerant cotton line were less than those in low salttolerant cotton line.It suggested that the demethylation positively contributed to salt tolerance and the hypermethylation had negative effect on salt tolerance in cotton.     

纽荷尔脐橙及其芽变系的RAPD分析

采用RAPD分析,从60个引物中筛选出能稳定扩增的12个引物,对2个纽荷尔脐橙品种(系)进行了扩增,共扩增出91条带,1条具有多态性,多态性比例占1.10%.利用NTSYSpc 2.1软件进行统计分析,得到品种(系)间的遗传距离极小,为0.0055.     

含B染色体的黑麦基因组DNA甲基化变异研究

运用RAPD法检测黑麦JNK居群中含有和不含B染色体的基因组DNA的序列差异,并从100个10碱基随机引物中筛选出5个,采用CRED-RA法,检测含有和不含B染色体基因组DNA的甲基化变异。结果表明,含有和不含B染色体的黑麦基因组中均可以发生CmCGG甲基化修饰,但与不含B染色体的基因组相比,含有B染色体的黑麦基因组中发生了更广泛的CmCGG甲基化变异,这可能是B染色体产生表型抑制或基因沉默的一个重要原因。     

瓜实蝇DNA甲基化的MSAP体系建立与优化

瓜实蝇[Bactrocera cucurbitae(Coquillett)]是中国重要的蔬菜害虫,但其DNA甲基化研究尚未见报道。甲基化敏感扩增多态性是研究DNA甲基化的重要技术之一。通过对酶切反应、连接、PCR扩增和引物筛选等条件优化,建立瓜实蝇MSAP反应体系,即:120μL酶切体系中加入10 U的限制性内切酶与600 ng基因组DNA,于37℃酶切反应过夜;220μL连接体系中加入T4连接酶1 U,HpaⅡ-MspⅠ-adapter接头50 pmol,Eco R I-adapter接头5 pmol,并于16℃反应12 h;3连接产物稀释后进行PCR预扩增和选择性扩增,再经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测结果。通过该体系筛选出适用于瓜实蝇基因组DNA甲基化多态性研究的6对引物;瓜实蝇MSAP体系为瓜实蝇的表观遗传学研究提供了技术支持。