梭梭糖基转移酶基因克隆及序列分析

以梭梭叶片为材料,根据其他植物糖基转移酶基因的保守序列设计引物,采用同源基因克隆及RACE-PCR方法克隆到2个同源的序列,分别命名为HaUGT1和HaUGT2。基因测序结果显示,HaUGT1基因编码区长1 485bp,编码495个氨基酸;HaUGT2基因编码区长1 185bp,编码394个氨基酸。HaUGT1和HaUGT2蛋白具有保守的PSPG基序、UDP-葡萄糖基转移酶结构域,与其他植物中的糖基转移酶蛋白同源性较高。     

桑树AKR2A伴侣蛋白基因的克隆及分析

通过RACE等生物学技术,从桑叶中克隆获得AKR2A同源基因。c DNA全长1 488 bp,ORF长为1 050 bp,编码349个氨基酸。编码蛋白预测分子量为37.31 ku,等电点4.43;富含螺旋结构,与同类蛋白同源性较高。盐胁迫后AKR2A在根组织中表达量上升,在不同桑树品种叶片中表达丰度存在差异。     

茄子花青素糖基转移酶基因SmGT的克隆与生物信息学分析

葡萄糖基转移酶(SmGT)是植物花青素合成途径中的一种关键酶,在植物果实颜色调控方面具有重要的作用。试验以紫色茄子三月茄为材料,设计一对特异性引物,克隆SmGT基因的ORF(开放阅读框),获得长度为1 413 bp的全长序列。序列分析表明,SmGT肽链含有470个氨基酸,分子量为52.75 ku,等电点为4.98,是一种参与生物体代谢途径的亲水性多肽。结构域和三级结构分析均表明,SmGT含有典型的UDP-葡萄糖基转移酶结构域,是一种糖基转移酶。蛋白质相似性分析表明,SmGT蛋白与马铃薯、野生番茄、辣椒和矮牵牛的葡萄糖基转移酶相似性分别为93%、93%、91%和87%。SmGT基因的克隆对于研究茄子花青素的生物合成途径以及分子机理具有重要意义。     

柽柳dir基因的克隆及序列分析

在柽柳cDNA文库测序中获得了dir基因的全长cDNA序列,去除PolyA后,该基因全长为724bp,其中5′非翻译区26bp,3′非翻译区143bp,开放阅读框(ORF)长555bp,编码184个氨基酸.基因编码蛋白的分子量为19·69kD,理论等电点为6·96·疏水性分析表明,蛋白的前41个氨基酸为亲水性的.dir基因编码的蛋白质参与木质素的形成,与植物体的病菌防御有关.该基因的Genbank登录号为DQ462418(基因)和ABE73781(蛋白).     

刺齿报春苣苔肌醇半乳糖苷合成酶基因的鉴定及序列分析

肌醇半乳糖苷合成酶基因与植物光合产物运输、种子耐脱水性、抵御生物与非生物胁迫和自我保护等生理生化过程密切相关。基于刺齿报春苣苔(Primulina spinulosa)转录组测序数据,获得(鉴定)1个肌醇半乳糖苷合成酶基因。序列分析结果表明,该基因全长1 347 bp(GenBank登录号为MG521418),开放阅读框(ORF)为1 008 bp,共编码335个氨基酸。进一步基于氨基酸序列的分析表明,该基因编码的蛋白质分子量为38.05 ku,理论等电点为5.09,为亲水性蛋白,含有1个与糖基转移酶家族蛋白相同的保守结构域;刺齿报春苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因与同科的旋蒴苣苔(Boea hygrometrica,FJ222452)的相似性高达90%,两者在系统进化树上聚为1支。研究结果为进一步研究刺齿报春苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因的分子结构和功能奠定了基础。     

杜仲糖基转移酶基因EuCGT1克隆及序列分析

本研究以杜仲(Eucommia ulmoides)7月雌株新生幼枝的树皮为材料,根据杜仲转录组测序数据中筛选的一个糖基转移酶基因(CGT)片段信息设计引物,采用SMART RACE技术,克隆了5’-端1432bp和3’-端535 bp cDNA片段,测序拼接后获得全长1 583 bp的杜仲CGT的cDNA序列。分析结果表明,该cDNA开放阅读框长1 464 bp,编码487个氨基酸,命名为EuGT基因。EuGT在NCBI中经blastn比对,显示序列与甜橙和草莓的UDP-葡萄糖基转移酶基因同源性分别为72%和67%;推测的氨基酸序列经blastp和CDD比对,显示序列与UDP-葡萄糖类黄酮3-O-糖基转移酶-6同源,其中含有UDP-葡萄糖基转移酶的保守域(pfam00201),初步推测EuCGT1蛋白属于糖基转移酶家族。本研究克隆的EuGT基因是首次从杜仲中克隆的糖基转移酶家族基因。以EuCGT1基因构建的植物表达载体pSH-35S-EuCGT1采用农杆菌介导法遗传转化烟草,获得了含EuCGT1基因的转基因烟株,移栽生长1个月的转基因烟草植株在表型上与野生型烟草无明显差异。     

白桦木聚糖内糖基转移酶XET基因序列及表达

从白桦(Betula platyphylla Suk.)形成层相关组织cDNA文库中获得一个木聚糖内糖基转移酶XET基因全长cDNA序列,其ORF全长882 bp,编码由293个氨基酸残基组成的多肽,编码蛋白的分子质量为33.1 ku,理论等电点为5.49。运用生物信息学方法对该蛋白进行理化性质分析及保守区预测,确定其属于糖基水解酶16超家族;进一步模拟蛋白空间结构,得到了可靠的分子生物学模型;利用sqRT-PCR分析白桦组培苗不同器官内XET基因的表达情况,结果显示XET在发育中的根茎叶内都有较高的表达水平。     

斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF56基因的序列分析及原核表达

对斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF56基因的序列特征及原核表达进行了初步研究.ORF56基因编码区全长675 bp,编码224个氨基酸,预测编码蛋白分子量25.9 ku.序列分析显示,ORF56具有典型的晚期启动子特征序列GTAAG,推导的氨基酸序列中含有13个磷酸化位点和3个N-糖基化位点.PCR扩增获得该基因,克隆到融合表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21中诱导表达.用纯化的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,为深入研究SpltMNPVⅡORF56的结构与功能提供基础.     

白背飞虱HSP90全长cDNA的克隆与特性分析

利用同源克隆及RACE的方法,从白背飞虱Sogatella furcifera中克隆获得热激蛋白HSP90基因的全长cDNA序列(Genbank登录号:JQ743628),该基因全长为2 707bp,包含421bp的3′非编码区域(UTR)和93bp的5′UTR,开放阅读框(ORF)为2 193bp,编码730个氨基酸。该基因预测的蛋白分子量为83.85kD,等电点为4.94,无信号肽、糖基化位点及跨膜结构。在N端具有HSP90基因保守的ATPase结构,含有HSP90家族的C末端的保守序列MEEVD。从进化分析结果看出,白背飞虱的HSP90与其它昆虫的HSP90蛋白的同源性较高,与褐飞虱相比较,同源性高达98%。HSP90基因的克隆和比较分析为进一步深入研究白背飞虱的抗逆机理、耐受性及进化具有重要意义。     

家蝇（Musca domestica）羧肽酶基因克隆及原核表达

从构建的家蝇幼虫cDNA 质粒文库中筛选到羧肽酶（Carboxypeptidase、CP）基因、以该基因的cDNA 文库 质粒为模板、通过PCR 扩增、获得CP 基因完整编码序列（登录号;KF939629.1）。运用生物信息学方法对该基因及其 编码蛋白的基本理化性质尧信号肽和亚细胞定位等进行预测和分析。构建PEASY-E1-CP 重组质粒、转化到大肠杆菌 OrigamiB (DE3)中进行诱导表达。研究结果表明、CP 基因ORF 全长1 284 bp、编码428 个氨基酸、理论分子量47.8 ku、等电点为6.10、具有CP 家族的蛋白保守结构域;重组原核质粒pEASY-E1-CP 经IPTG 诱导、蛋白在大肠杆菌中 获得表达。     

表皮葡萄球菌8-32-B 株aap基因domain B的原核表达

为获得表皮葡萄球菌aap基因domain B片段的原核表达产物,采用PCR方法扩增引起新疆南疆地区奶牛乳房炎的表皮葡萄球菌株aap基因domain B片段,并克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组质粒pET-32a(+)-aap,将重组质粒转化至宿主菌E.coli BL21中诱导表达。结果表明,克隆得到aap基因domain B片段为2 316bp,Aap蛋白分子质量184.5ku。在宿主菌E.coli BL21中表达的最佳诱导时间为4h,IPTG最佳诱导浓度为0.75mmol/L;纯化时洗杂缓冲液中咪唑浓度为40mmol/L,洗脱缓冲液中咪唑浓度为200mmol/L时可以获得单一Aap蛋白。     

枸杞抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆与表达分析

为探索青海枸杞抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因信息,并对枸杞APX基因进行生物信息学分析以及基因表达研究,通过RT-PCR和RACE方法克隆枸杞APX基因,利用生物信息学软件预测基因结构,采用实时荧光定量PCR方法分析基因表达的变化。结果显示:枸杞APX基因的全长cDNA序列为1 047bp(Genbank No.KX981601),命名为LcAPX基因。该基因含有1个753bp的完整开放阅读框(ORF),编码250个氨基酸,包含亚铁血红素结合位点、底物结合位点和K~+结合位点。枸杞LcAPX与茄科植物的APX蛋白聚为一类,说明两者的亲缘关系较近。LcAPX基因在枸杞的成熟叶中表达量最高,花中表达量最少。其在聚乙二醇(PEG)、氯化钠(NaCl)胁迫下诱导表达,显示LcAPX在枸杞抗干旱和抗盐逆境过程起一定作用。     

大豆生育期E1、E2、E3和E4基因的研究与应用

大豆E1～E4基因作为对大豆生育期影响最大的E系列基因,与大豆品种生态类型密切相关。为总结大豆主要生育期基因E1～E4的研究进展和应用现状,促进中国大豆生育期育种模式的形成,本研究综述E1～E4基因不同变异类型、变异类型鉴定方法和调控大豆光周期机理的研究进展及大豆群体E1～E4基因型分析在大豆品种生长适应性研究中的应用,以期为大豆生育期遗传调控机理的全面深入研究提供参考,同时为适应不同生态区域的大豆遗传育种工作提供依据。     

暗纹东方鲀sox9基因的克隆和组织表达分析

为初步探究暗纹东方鲀sox9基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,通过设计兼并引物、RACE及荧光定量PCR技术,成功克隆出暗纹东方鲀sox9基因的cDNA全长序列,并分析其相应的生物信息学特征及其在雌雄个体的组织表达水平。结果表明:sox9a基因cDNA全长为1 248 bp(NCBI登录号:MH218818),包括684 bp的ORF,编码227个氨基酸,297 bp的5′UTR和267 bp的3′UTR。sox9b基因全长为1 941 bp(NCBI登录号:MH218819),包括1 470 bp的ORF,编码489个氨基酸,306 bp的5′UTR和165 bp的3′UTR。同源性和系统发育分析结果表明暗纹东方鲀sox9基因与红鳍东方鲀同源性最高,亲缘关系最近。氨基酸多重序列比对结果显示两个Sox9氨基酸序列的HMG box结构域在哺乳动物和鱼类中均高度保守。荧光定量PCR分析显示两个sox9基因普遍存在于雌鱼和雄鱼的各个组织中,且均在雌鱼下丘脑中表达量最高,在精巢中有少量表达,卵巢中几乎不表达。总体来说,除少数组织外,两个sox9基因在雌鱼组织中的表达量普遍高于雄鱼。本研究为了解暗纹东方鲀sox9的遗传特性及相关的生理功能,探索性别分化与性腺发育的分子调控机制提供理论依据。     

枸杞苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

为研究枸杞苯丙氨酸解氨酶基因LcPAL在干旱和盐逆境中的作用,采用RT-PCR和RACE方法克隆了LcPAL基因(Genbank No.KX781247)。该基因cDNA长度为2 544bp,含有2 163bp的完整开放阅读框,编码720个氨基酸。蛋白序列分析表明,其包含典型的PAL酶活性中心序列(GTITASGDLVPLSYIA),与其他植物的PAL蛋白有很高的同源性。系统进化树表明,枸杞LcPAL与茄科植物的PAL蛋白聚为一类,说明两者的亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR方法检测发现,LcPAL基因在枸杞的叶中表达量最高,果实中表达量最少。其在聚乙二醇(PEG)、氯化钠(NaCl)胁迫下诱导表达,但表达模式不同。研究结果推测从枸杞中克隆获得苯丙氨酸解氨酶(LcPAL),是典型的PAL家族成员,在枸杞各组织发育过程中具有重要功能,且在枸杞抗干旱和抗盐逆境过程也起一定作用。     

小地老虎V-ATP酶A亚基基因的克隆与分析

V-ATP酶是一种ATP依赖型的多亚基质子泵,广泛存在于多种生物的内膜和质膜上,参与生物体内多种重要的生理生化反应,为了进一步研究V-ATP酶,克隆小地老虎V-ATP酶A亚基基因。以鳞翅目昆虫小地老虎(Agrotis ypsilon)的中肠组织为材料,利用RACE技术克隆小地老虎V-ATP酶A亚基基因全长。结果表明:克隆得到A亚基基因序列2 693bp,其中CDS区1 851bp,编码616个氨基酸,翻译的蛋白质分子质量为68.06ku,等电点为5.14,含有3个N-糖基化位点。基因同源性分析结果说明该基因与棉铃虫(Helicoverpa armigera)、烟草天蛾(Manduca sexta)、小菜蛾(Plutella xyllostella)均有较高的同源性。A亚基基因序列已提交至GenBank并获得登录号KM434187。     

瘤背石磺低频听力相关基因OrNXN克隆及表达分析

从瘤背石磺不同频率声音基因转录组中将有显著差异表达的基因与IMPC人类听觉感知和耳聋相关基因对比发掘出与听力相关的基因NXN。利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得OrNXN基因cDNA全长序列,并对其序列进行生物信息学分析;利用实时定量PCR(qPCR)技术分析OrNXN在瘤背石磺不同组织、不同声音频率及不同潮汐节点的表达水平。结果显示,OrNXN基因cDNA全长为1 593 bp,开放阅读框长度为432 bp,共编码143个氨基酸,相对分子质量为15.57 ku;结构域预测分析表明,OrNXN含有Thioredoxin家族典型的硫氧还蛋白结构;多序列比对以及进化树构建结果表明,OrNXN与其他物种的相似度较高,保守性较强;荧光定量结果表明,在瘤背石磺7个组织中OrNXN在肠、神经节、性腺和腹足中均有表达,在肠中表达量最高,其次为神经节。不同声音频率刺激下,OrNXN在200和50 Hz处有差异表达,在不同潮汐节点,OrNXN表达量均不同,表达量基本与潮汐水位变化一致。研究表明,OrNXN可能在瘤背石磺参与感知潮汐节率时对潮汐发出的低频声音产生了响应。     

梭梭NAC转录因子HaNAC1克隆及序列分析

以梭梭幼苗为材料,根据GenBank中已公布的NAC基因序列设计简并引物,采用同源基因克隆法克隆到1个NAC转录因子编码基因,命名为HaNAC1。序列分析表明,该基因编码区长1 543bp,编码298个氨基酸,预测其分子质量为33.93ku,等电点为6.33。与其他植物NAC基因序列进行多重比对并建立系统进化树,推测HaNAC1属于ATAF亚家族成员。半定量RT-PCR结果显示,HaNAC1表达量随盐胁迫浓度升高而升高,推测其在梭梭盐胁迫和干旱应答中发挥重要作用。     

易变链霉菌TRM 45540四氢嘧啶合成相关基因的克隆

为了探索嗜盐放线菌对高盐环境的适应机理,以分离于罗布泊易变链霉菌TRM 45540为材料,利用分子克隆技术,构建四氢嘧啶异源生物合成工程菌(以E.coli为宿主),对ectA、ectB、ectC与ectABC基因进行异源表达,分析异源宿主菌的耐盐能力。结果表明:TRM 45540四氢嘧啶合成相关基因ectA为474bp,预测编码蛋白为19ku;ectB为1 272bp,预测编码蛋白为44.6ku;ectC为399bp,预测编码蛋白为19ku;全长基因ectABC为2 403bp,并且携带有ectABC基因工程菌的耐盐能力显著提高。     

山葡萄类黄酮-5-O-葡萄糖基转移酶基因(5GT)的克隆表达及遗传转化分析

为探究5GT基因在山葡萄花色苷合成过程中的表达规律及作用,以山葡萄(Vitis amurensis)为材料,利用RT-PCR技术克隆山葡萄5GT基因的全长cDNA序列(GenBank登录号为GU237133),将该基因命名为Vam5GT并对该蛋白进行生物信息学分析预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测Vam5GT基因在山葡萄8个不同转色时期的表达规律,将克隆获得的Vam5GT基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli Bl2(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达产物。并构建表达载体pC5GT并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化。结果显示:克隆获得的Vam5GT cDNA全长1 497 bp,开放阅读框1 347 bp,编码448个氨基酸,该基因表达产物相对分子质量为49.84 ku,等电点为5.23,是不稳定蛋白。该基因属于UDPGT超基因家族,不包含信号肽。Vam5GT在山葡萄花后4周的果皮中表达丰度最高,其他时期表达逐渐下降;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,在含50 mg/L Kanomycin的培养基上对拟南芥T_0代种子进行筛选,先后得到2个阳性幼苗,转化率为0.05%。对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性。