凡纳滨对虾微粒体谷胱甘肽硫转移酶3基因克隆及其功能分析

[目的]明确凡纳滨对虾微粒体谷胱甘肽硫转移酶3(LvMGST3)在机体抗逆境胁迫与抵御病原体侵染过程中的功能作用,为有效提高对虾的抗胁迫能力和抗病力提供理论依据.[方法]采用RACE克隆LvMGST3基因cDNA序列,以EditSeq、ExPASy、SignalP 5.0、TMHMM 2.0、Clustal X和MEGA 6.0等在线软件进行生物信息学分析,再应用半定量PCR进行组织表达量分析.凡纳滨对虾分别进行氨氮胁迫(20.00 mg/L)及脂多糖(LPS,8μg/g)刺激后,采用实时荧光定量PCR检测分析LvMGST3基因的表达响应情况.[结果]LvMGST3基因cDNA序列全长826 bp,包含85 bp的5'端非编码区(5'-UTR)、321 bp的3'端非编码区(3'-UTR)和420 bp的开放阅读框(ORF),在ploy(A)尾前端15个核苷酸处存在加尾信号AATAAA.LvMGST3基因编码139个氨基酸残基,包含MGST3亚家族共有的保守结构域FNCX1QRX2H,此序列为FNCYQRAH.LvMGST3蛋白分子量为15.53 kD,理论等电点(pI)为9.38,具有3个跨膜结构域,但不存在信号肽.LvMGST3氨基酸序列与软甲纲普通卷甲虫(Armadillidium vulgare)的MGST3氨基酸序列(RXG56258.1)相似性最高,为71.22%;基于MGST3氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,LvMGST3与节肢动物门和软体动物门的MGST3亲缘关系较近.LvMGST3基因在凡纳滨对虾肝胰腺、鳃组织和眼柄中的基础表达量较高;经氨氮胁迫后,肝胰腺中的LvMGST3基因相对表达量分别在胁迫6和24 h时极显著上调(P<0.01,下同),鳃组织中的LvMGST3基因相对表达量在胁迫12 h时显著上调(P<0.05,下同)、胁迫48 h时极显著上调;肝胰腺中的LvMGST3基因在LPS刺激前期表达受抑制,至刺激12 h时极显著上调,鳃组织中的LvMGST3基因分别在LPS刺激3和48 h时出现2个表达峰值,其相对表达量均极显著高于对照组,分别是对照组的4.39和6.45倍.[结论]LvMGST3基因具有典型的MGST3亚家族结构特征,主要在凡纳滨对虾的肝胰腺、鳃组织和眼柄中表达,且氨氮胁迫和LPS刺激可明显诱导凡纳滨对虾肝胰腺和鳃组织中LvMGST3基因的表达水平,即MGST3在对虾抗逆境胁迫及抵御病原菌感染的调控机制中发挥重要作用.     

马氏珠母贝细胞内视黄酸结合蛋白表达及其与类胡萝卜素的相关性分析

[目的]明确细胞内视黄酸结合蛋白(CRABP)对马氏珠母贝吸收代谢类胡萝卜素的影响,为培育富含类胡萝卜素的马氏珠母贝养殖新品系打下基础.[方法]采用RACE克隆马氏珠母贝CRABP基因(PmCRABP)cDNA全长序列,并以实时荧光定量PCR检测分析PmCRABP基因在各组织中的表达特征及其在黄白闭壳肌中的表达量.[结果]PmCRABP基因cDNA全长1778 bp,开放阅读框(ORF)长366 bp,编码121个氨基酸,其5'非翻译区(5'UTR)长125 bp,3'UTR长1287 bp.PmCRABP的分子量13.51 kD,理论等电点(pI)5.68,脂溶性系数62.81,不稳定指数35.38,总平均亲水性-0.517,其第5~120个氨基酸为Lipocalin家族的结构域.PmCRABP氨基酸序列与新对虾(Metapenaeus ensis)CRABP氨基酸序列的相似度最高,同属于CRABP蛋白,且二者的空间结构极其相似.PmCRABP基因在马氏珠母贝肝胰腺中的表达量最高,其后依次是外套膜、鳃和闭壳肌,各组织的表达量差异显著(P<0.05,下同).黄白闭壳肌个体的类胡萝卜素含量与PmCRABP基因相对表达量存在显著差异,且二者间呈明显的正相关.[结论]PmCRABP参与了马氏珠母贝的类胡萝卜素代谢.     

拟环纹豹蛛热休克蛋白20基因的克隆与分析

[目的]克隆拟环纹豹蛛热休克蛋白20基因(HSP20),并分析其在镉胁迫下的表达情况,为揭示蜘蛛抵御重金属胁迫机制提供参考.[方法]以拟环纹豹蛛雌蛛为试验材料,在转录组测序的基础上,通过RT-P CR克隆拟环纹豹蛛HSP20基因(PpHSP20),用生物信息学方法对其序列特征进行分析,并采用荧光定量PCR检测镉胁迫下PpHSP20基因的相对表达量.[结果]克隆获得的PpHSP20基因编码区长525 bp,编码174个氨基酸,其编码蛋白分子量20.08 kD,等电点5.97,具有小分子热休克蛋白家族典型的α-晶状体蛋白结构域,与温室拟肥腹蛛(Parasteatoda tepidario-rum)α-晶体蛋白A有较高的相似性(58%).荧光定量PCR分析结果显示,镉胁迫下PpHSP20基因的表达量显著增加(P<0.05).[结论]拟环纹豹蛛HSP20基因在抵御镉胁迫中发挥调控作用,可作为研究蜘蛛抵御镉胁迫的重要候选基因和潜在的生物标记物.     

木薯AGPase基因家族的生物信息学及其表达分析

[目的]搜索鉴定木薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)的基因家族成员,并分析其生物学信息及不同组织和非生物胁迫下的表达情况,为木薯AGPase基因的功能挖掘及淀粉性状遗传改良提供理论依据.[方法]从木薯基因组数据库(Phytozome)下载木薯全基因组序列,从中筛选含NTP_transferase(Pfam编号PF00483)保守结构域序列的AGPase基因家族成员,利用生物信息学方法对其结构特征及编码蛋白序列进行分析.基于NCBI转录组测序(RNA-seq)数据,对木薯AGPase基因家族成员在不同组织及冷害和干旱胁迫下的表达模式进行分析.[结果]从木薯全基因组序列中共鉴定出9个AGPase基因家族成员,包含6个AGPase大亚基(LS)基因和3个小亚基(SS)基因.6个LS基因在长度和编码氨基酸数目上差异明显,但3个SS基因间的差异不明显.LS基因外显子数目为8~15个,SS基因外显子数目均为9个.9个木薯AGPase基因家族成员分布于8条染色体和1个scalefold中,未在染色体上发现串联成簇分布现象.木薯AGPase基因家族启动子区域含有多个干旱响应元件、光响应元件、激素响应元件及多种除干旱外的其他非生物胁迫响应元件.9个AGPase基因家族成员在不同木薯组织间的表达模式具有组织特异性.经冷害胁迫后,除MeAGL1.3基因外,其余8个基因表达量均极显著(P<0.01,下同)或显著(P<0.05,下同)下调;经干旱胁迫后,MeAGL1.4、MeAGS1.1、MeAGS1.2和MeAGS2基因表达量极显著或显著下调,MeAGL1.3基因的表达量显著上调,其余基因与对照无显著差异(P>0.05).[结论]木薯AGPase基因家族成员具有保守的基因结构和功能结构域,其表达具有组织特异性,大多数成员表达水平受冷害和干旱胁迫调控.     

鲢IGFB-1基因全长cDNA的克隆及表达分析

【目的】克隆鲢胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)基因,分析其编码蛋白的结构与功能,并分析低氧胁迫下该基因在鲢肝脏中的表达情况。【方法】采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNAends,RACE)扩增鲢IGFBP-1基因的全长cDNA,通过半定量RT-PCR法对鲢肌肉、心脏、脑、肾脏、肝脏、腮和脾等组织器官IGFBP-1mRNA的表达水平进行检测,利用Real-time PCR法检测急性低氧胁迫0,2,4,6,8,10和12h后鲢肝脏组织中IGFBP-1表达量的变化。【结果】鲢IGFBP-1全长cDNA为1 081bp,具有73bp的5′非编码区(Un-translated Regions,UTR)、789bp的开放读码框(Open reading frame,ORF),以及219bp的3′UTR,编码含262个氨基酸的蛋白质。RT-PCR结果表明,IGFBP-1在肌肉、心脏、脑、肾脏、肝脏、腮和脾等7种组织中均有表达,其中在肝脏中的表达量最高,心脏和肌肉次之,在脑中的表达量最低;Real-time PCR结果表明,在低氧胁迫6h时,IGFBP-1cDNA在肝脏中的表达量显著增高,随后略有降低但仍显著高于未进行低氧胁迫处理组。【结论】克隆得到鲢IG-FBP-1全长cDNA,该基因在肝脏组织中大量表达;随着低氧胁迫时间的延长,鲢肝脏中IGFBP-1mRNA表达量升高,达最大值后继续低氧胁迫其表达量略有降低。     

达氏鲟自噬基因MAP1LC3B克隆及其组织表达分析

[目的]掌握达氏鲟微管相关蛋白1A/1B轻链3B基因(MAP1LC3B)的表达模式,为后续研究MAP1LC3B基因功能及揭示达氏鲟的抗病分子机制提供理论依据.[方法]采用RACE技术从达氏鲟组织中克隆MAP1LC3B基因,通过ProtParam、TMpred、Phyre2及Singal 4.1等在线软件进行生物信息学分析,同时借助实时荧光定量PCR检测MAP1LC3B基因在达氏鲟不同组织中的表达情况.[结果]达氏鲟MAP1LC3B基因cDNA序列全长2208 bp,包含378 bp的开放阅读框(ORF)、202 bp的5'端非编码区(5'-UTR)和1628 bp的3'端非编码区(3'-UTR),编码125个氨基酸.MAP1LC3B氨基酸序列含有GABARAP泛素结构域、Agt7结合位点、脂化位点和维管束蛋白结合位点.达氏鲟MAP1LC3B蛋白由18种氨基酸组成,其中谷氨酸(Glu)含量最高(占9.6%)、丙氨酸(Ala)含量最低(占1.6%);蛋白分子量为14743.01 Da,理论等电点(pI)为8.92,不稳定系数为65.12,总平均亲水性为-0.484,是一种不稳定的疏水性蛋白,且不存在跨膜结构,也无信号肽序列.MAP1LC3B基因在达氏鲟鳃、脑、皮肤、头肾、前肾、脾脏、中肾、心脏和肠道等组织中均有表达,以在鳃和肠道组织中的相对表达量较高,显著高于在其他组织中的相对表达量(P<0.05).[结论]达氏鲟MAP1LC3B基因具有较高的保守性,在鳃和肠道黏膜免疫组织中高表达,表明自噬参与达氏鲟黏膜免疫过程,调节机体免疫反应.     

建鲤极长链脂酰辅酶A脱氢酶基因cDNA克隆及相关定量表达分析

[目的]克隆建鲤(Cyprinus carpio var.Jian)极长链脂酰辅酶A脱氢酶(VLCAD)基因cDNA序列,并分析其表达情况,为揭示鲤鱼脂肪酸代谢机理提供理论依据.[方法]以建鲤为研究对象,利用RT-PCR、RACE克隆VLCAD基因的cDNA序列,并通过实时荧光定量PCR对VLCAD基因在不同组织、脂肪源及饥饿胁迫等条件下的表达情况进行分析.[结果]扩增获得的建鲤VLCAD基因cDNA序列全长2527 bp,包括296 bp的5’非翻译区、1974bp开放阅读框(OFR)及257bp的3'非翻译区,共编码659个氨基酸;建鲤VLCAD氨基酸序列包含FAD结合位点、底物结合位点、催化位点,具有ACADs家族的特征性结构;与鲤科类斑马鱼(Danio rerio)的同源性最高,达94％.建鲤VLCAD基因在性腺、肌肉、肝脏、前肠、肾脏、心脏和脑中均有表达,且以心脏的表达量最高,前肠的表达量最少.鱼油和亚麻油对建鲤VLCAD基因在肝脏和肌肉中的表达无显著影响(P＞0.05),但饥饿状态下肌肉中的VLCAD基因表达量显著高于正常状态(P＜0.05).[结论]建鲤VLCAD基因在富含线粒体且脂肪酸代谢旺盛的组织器官中高效表达,对脂肪酸β氧化起调控作用,尤其在饥饿状态下对脂肪酸氧化调控作用明显增强,能促进脂肪酸分解为机体供能.     

菜粉蝶HSP20基因的克隆及温度胁迫下表达分析

[目的]克隆分析菜粉蝶(Pieris rapae)热激蛋白20基因(HSP20),并检测其在温度胁迫下的表达情况,为探析菜粉蝶适应温度胁迫机制提供参考.[方法]以菜粉蝶为试验材料,采用RT-PCR和RACE克隆获得菜粉蝶HSP20基因cDNA全长,并通过生物学软件分析其序列,明确其基因结构特征和亲缘关系;采用实时荧光定量PCR检测菜粉蝶HSP20基因在低温(-20~0℃)和高温(5~45℃)胁迫下的表达响应.[结果]菜粉蝶HSP20基因全长725 bp,5'-端非编码区105 bp,3'-端非编码区109 bp,开放阅读框531 bp,编码176个氨基酸,预测蛋白分子量19.5 kD,理论等电点6.61;其编码氨基酸序列中含有1个典型的HSP20家族结构域(位于第60~142位氨基酸)、1个α-晶体蛋白(位于第60~157位氨基酸)和1个Allato allatostatin(位于第14~24位氨基酸);基序列相似度分析其与二化螟、家蚕和甘蓝夜蛾HSP20蛋白氨基酸相似度较高并聚为一族.该基因随环境温度的升高或降低发生变化,在-5和40℃诱发该基因高效表达.[结论]低温和高温均能诱导菜粉蝶HSP20基因高效表达.     

卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)热休克蛋白HSP30基因的克隆与组织表达

[目的]获得卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)HSP30基因并探讨其组织表达.[方法]采用RACE的方法从卵形鲳鲹脾组织克隆HSP30基因的cDNA全序列,并用荧光定量PCR分析在健康鱼及哈维氏弧菌感染后HSP30基因的组织表达.[结果]HSP30基因cDNA序列全长913 bp,包含5′非编码区(5′UTR)89 bp、3′非编码区(3′UTR)188 bp,开放阅读框(ORF)636 bp,编码211个氨基酸.预测其氨基酸序列成熟肽的蛋白分子质量为24.1 kD,理论等电点为5.62.HSP30包括N-末端序列(NTS)、α-晶状体蛋白结构域(ACD)、C-末端序列(CTS)和C-末端延伸(CTE).系统进化分析结果显示卵形鲳鲹HSP30与高体鰤(Seriola dumerili)HSP30聚为一支.卵形鲳鲹HSP30基因在各组织中均有不同程度的表达,其中肝组织中表达量最高,其次为皮肤、肌肉、脾、心、肾,其他组织的表达量较低.哈维弧菌侵染卵形鲳鲹后,肝、脾和肾组织中HSP30基因mRNA表达量均升高,肝组织中变化最显著.[结论]成功克隆了卵形鲳鲹HSP30基因,为进一步揭示卵形鲳鲹HSP30的抗菌免疫应答机制提供了理论依据.     

黄沙鳖抗菌肽cathelicidin基因克隆及表达特征分析

[目的]克隆黄沙鳖cathelicidin基因并分析其组织分布特征及在攻毒后的表达变化,为深入研究cathelicidin功能及在黄沙鳖先天免疫中的潜在作用提供基础数据.[方法]采用RT-PCR结合RACE克隆黄沙鳖cathelicidin基因cDNA全长序列,利用生物信息学分析软件对黄沙鳖cathelicidin基因及其推导氨基酸序列进行结构特征分析,并采用实时荧光定量PCR检测黄沙鳖cathelicidin基因在不同组织中的表达特征及攻毒后的表达变化.[结果]黄沙鳖catheli-cidin基因cDNA序列全长1026 bp(GenBank登录号MK250818),包括483 bp的开放阅读框(ORF)、315 bp的5'非编码区(5'UTR)和228 bp的3'非编码区(3'UTR).黄沙鳖cathelicidin基因cDNA序列编码160个氨基酸,包括氨基端的信号肽区域、含有4个保守半胱氨酸(Cys)残基的cathelin区域及羧基端的成熟肽区域.黄沙鳖cathelicidin基因推导氨基酸序列与中华鳖cathelicidin基因推导氨基酸序列(KY948708.1)的相似性最高,为97.5%;基于cathelicidin基因推导氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示黄沙鳖与中华鳖的亲缘关系最近.黄沙鳖cathelicidin基因在脾脏和肝脏中的相对表达量相对较高,其次是心脏,在脑组织、肾脏、肠道、肌肉、表皮和背甲的相对表达量较低.以温和气单胞菌攻毒后,黄沙鳖脾脏cathelicidin基因相对表达量呈升—降—升—降的波动变化趋势,出现2个峰值(攻毒后第3和36 h),对应的cathelicidin基因相对表达量分别是对照(注射等量无菌生理盐水)的23.1和3.5倍.[结论]黄沙鳖catheli-cidin基因在脾脏和肝脏中高表达量,且可被温和气单胞菌感染诱导,说明cathelicidin基因在黄沙鳖抵抗病原感染过程中发挥重要作用.