低温对甘薯淀粉理化特性及代谢关键基因表达量的影响

【目的】淀粉是甘薯块根的主要组成成分,淀粉理化特性直接决定着甘薯的主要用途;同时,甘薯是较为典型的喜温作物,对储藏温度较为敏感。因此,研究低温对淀粉理化特性的影响,为甘薯安全储藏提供参考。【方法】本研究以‘烟薯25’和‘商薯19’为试验材料,设置适温（13℃,CK）和低温（4℃）储藏14 d,分析甘薯块根淀粉粒径大小与分布、热焓特性、糊化特性、吸湿性及膨胀力等特征指标的差异。【结果】不同甘薯品种的直链/支链淀粉含量存在显著差异,‘商薯19’的直链淀粉含量（31.47%）显著高于‘烟薯25’（25.86%）,支链淀粉则完全相反;‘烟薯25’和‘商薯19’的平均粒径、体积和表面积均分别分布于≤2.50 μm、2.50—5.00 μm和5.00—25.00 μm三个区间,低温胁迫使二者的淀粉颗粒平均粒径降低,体积和表面积减小,吸湿性和膨胀力降低;‘烟薯25’和‘商薯19’薯块淀粉在糊化过程中的起始温度（T₀）、峰值温度（Tp）和热晗值（△H）与CK相比均显著下降,其中,‘烟薯25’的△H变化幅度高于‘商薯19’,表明低温对‘烟薯25’淀粉热特性的影响程度高于‘商薯19’;低温储藏条件下,‘烟薯25’和‘商薯19’的最高黏度（PKV）、崩解值（BDV）和回复值（CSV）均显著下降,糊化温度（PT）受低温的影响不显著,但品种间差异显著;低温下,基因IbAGPa（ADP-葡萄糖焦磷酸化酶）、IbAGPb、IbSBEI（淀粉分支酶）和IbSBEII的表达量均显著下降,而Ibα-amylase（淀粉水解酶）和Ibβ-amylase则显著上升。【结论】温度是影响甘薯淀粉理化品质的重要因素,甘薯块根淀粉理化特性变化与甘薯储藏温度密切相关。     

西瓜果肉柠檬黄色的遗传分析和基因定位

【目的】对西瓜白色和柠檬黄色果肉的色素成分、色素含量、遗传规律进行研究,通过BSA-seq进行基因定位,并预测与柠檬黄色果肉相关的候选基因,为深入研究西瓜柠檬黄色果肉的遗传与分子机制奠定理论基础。【方法】本研究选用‘冰糖脆’（Ⅰ P₁,白色果肉）和‘喜华’（Ⅰ P₂,柠檬黄色果肉）,‘萨省奶油瓜’（Ⅱ P₁,白色果肉）和‘新金兰选’（Ⅱ P₂,柠檬黄色果肉）4份纯合自交系材料为亲本分别配置杂交组合,构建了两个六世代群体。利用高效液相色谱法（HPLC）对4个亲本材料4个不同发育时期的类胡萝卜素组分和含量进行测定。利用集群分离分析法（bulked segreant analysis,BSA）实现对两个BSA-seq群体（BSA-seq Ⅰ和BSA-seq Ⅱ）的初定位,然后根据西瓜参考基因组‘97103’V2注释信息挖掘候选基因,并通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对候选基因进行验证。【结果】在西瓜果实发育过程中,紫黄质和叶黄素在双亲中差异性积累,其中紫黄质具有更高的含量,且在柠檬黄色果肉中的含量显著高于白色果肉。成熟期西瓜白色果肉中紫黄质含量为（10.96±4）μg·g^-1DW,柠檬黄果肉中紫黄质含量为（22.84±2）μg·g^-1 DW;成熟期西瓜白色果肉中叶黄素含量为（2.23 ±1）μg·g ^-1 DW,柠檬黄果肉中叶黄素含量为（3.97±1）μg·g^-1 DW。在构建的两组六世代分离群体中,Ⅰ F₁、Ⅱ F₁、Ⅰ BC₁P₁、Ⅱ BC₁P₁群体西瓜果肉颜色均为非柠檬黄色,F₂群体中西瓜果肉非柠檬黄色与柠檬黄色的分离比符合3∶1的孟德尔分离比例,Ⅰ BC₁P₂、Ⅱ BC₁P₂回交群体果肉非柠檬黄色和柠檬黄色分离比符合1∶1,表明西瓜果肉柠檬黄色对白色为隐性性状。通过对BSA-seq Ⅰ和BSA-seq Ⅱ数据进行SNP和InDel关联分析,将控制西瓜果肉柠檬黄色的主效位点定位在6号染色体24.00—24.61 Mb的区域内,该区域内共有70个基因。结合西瓜参考基因组注释信息及qRT-PCR表达量分析,最终得到5个与西瓜果肉柠檬黄色有关的基因,其中Cla97C06G121680、Cla97C06G121700和Cla97C06G121890均与叶绿体的形成和叶绿体结构大小有关,这3个基因通过干预有色体的形成影响西瓜果肉颜色;Cla97C06G121910是一种响应乙烯合成的AP2转录因子,与果实成熟密切相关,通过影响果实成熟造成果肉中类胡萝卜素的积累;Cla97C06G122090具有跨膜转运作用,在类胡萝卜素的跨膜运输中起作用。【结论】西瓜白色和柠檬黄色果肉中主要色素为紫黄质和叶黄素,且柠檬黄色果肉中的色素积累量显著高于白色果肉。西瓜果肉柠檬黄色对白色为隐性性状。BSA-seq分析将调控西瓜果肉柠檬黄色形成的一个主效位点定位于6号染色体24.00—24.61 Mb区间内,推测Cla97C06G121680、Cla97C06G121700、Cla97C06G121890、Cla97C06G122090、Cla97C06G121910是与西瓜果肉柠檬黄色形成相关的候选基因。     

体外法优化玉米—杂粕型饲粮的非淀粉多糖酶谱及其对育肥猪肠道微生物的影响

【目的】利用体外模拟法优化玉米—杂粕型饲粮的非淀粉多糖（NSP）酶谱,并分析优化的非淀粉多糖酶谱对饲粮养分消化率和育肥猪肠道微生物组成和结构的影响,为饲粮高效利用和精准饲养提供数据支撑和理论参考。【方法】试验一在育肥猪玉米—杂粕型饲粮中分别添加不同水平的木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和果胶酶6种NSP酶,采用胃—小肠体外模拟法测定体外回肠干物质消化率（IVIDMD）;取IVIDMD达到最大值时各NSP酶的添加水平为该NSP酶0编码水平,按照六元二次回归正交旋转组合设计,进行体外消化试验,建立IVIDMD与NSP酶添加量的六元二次回归方程,筛选出玉米—杂粕型饲粮最优NSP酶谱（OEC）;利用胃—小肠—大肠体外模拟消化法分析测定添加OEC前后饲粮的体外干物质消化率（IVDMD）、体外能量消化率（IVGED）和体外消化能（IVDE）,以验证OEC的效果。试验二按照单因素完全随机设计,选用16头健康、体重相近去势公猪（117.8 ± 1.66 kg）,随机分为2个处理组,每个处理8头猪,对照组饲喂玉米—杂粕型基础饲粮,加酶组在基础饲粮中添加OEC;在试验开展第18天采用直肠擦拭法采集猪新鲜粪便,利用16S rRNA基因高通量测序对粪便微生物菌群的多样性及相对丰度进行分析,并进行功能预测。【结果】（1）在本试验条件下,玉米—杂粕型饲粮OEC为：纤维素酶1 003 U·kg^-1、木聚糖酶18 076 U·kg^-1、β-葡聚糖酶1 377 U·kg^-1、β-甘露聚糖酶14 765 U·kg^-1、α-半乳糖苷酶337 U·kg^-1和果胶酶138 U·kg^-1;（2）在玉米—杂粕型饲粮中添加OEC使IVDMD由73.44%显著提高到76.26%（P<0.01）,IVGED由74.03%显著提高到76.45%（P = 0.01）,IVDE由14.97 MJ·kg^-1显著提高到15.58 MJ·kg^-1（P<0.01）;（3）在门水平上,共筛选出了12个相对丰度大于0.1%的菌门,其中Bacteroidota（拟杆菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）和Spirochaetota（螺旋体门）为优势菌门,三者之和在组内占比达96%以上;（4）在属水平上,饲粮中添加OEC显著增加norank_f_F082,norank_f_Bacteroidales_RF16_group,Bacteroides（拟杆菌属）和Roseburia（氏菌属）的相对丰度（P<0.05）,Eubacterium_ruminantium_group（P = 0.083）有增加的趋势,而Oscillibacter（颤杆菌克）的相对丰度显著降低（P<0.05）,Clostridium_sensu_stricto_1和norank_f__norank_o__WCHB1-41（P = 0.083）有降低的趋势（P = 0.052）。【结论】饲粮中添加体外法优化的NSP酶谱,显著提高了育肥猪玉米—杂粕型饲粮干物质和能量的体外消化率以及体外消化能,增加了纤维分解菌和产丁酸菌等有益菌在育肥猪肠道微生物中的占比,在一定程度上减少了有害菌的数量,优化了肠道微生态。     

玉米籽粒淀粉积累及相关酶活性分析

【目的】分析玉米籽粒发育过程中灌浆速率、蔗糖代谢、淀粉积累及相关酶活性的变化,了解玉米籽粒淀粉积累的控制机理。【方法】以高淀粉玉米（费玉3号）和普通玉米（豫玉22）为材料,进行大田试验,采用比色法测定蔗糖含量,采用双波长法测定淀粉及其组分含量的变化动态,参照Douglas等的方法测定蔗糖合成酶（SS）活性,参照Nakamura等的方法测定腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADPGPPase）、束缚态淀粉合成酶（GBSS）、淀粉分支酶（SBE）和去分支酶（DBE）的活性。【结果】灌浆速率、蔗糖含量、淀粉积累速率及SS、GBSS、SBE活性的高低均存在明显的基因型差异,授粉后10 d后,费玉3号上述指标均高于豫玉22。相关性分析表明,灌浆中后期SS活性与淀粉积累速率和籽粒灌浆速率均呈（极）显著正相关;ADPGPPase、DBE活性与淀粉积累速率和籽粒灌浆速率的相关性未达到显著水平;GBSS活性与直链淀粉积累速率呈极显著正相关,与籽粒灌浆速率相关性不显著;SBE活性与支链淀粉积累速率和籽粒灌浆速率呈极显著正相关。【结论】ADPGPPase和DBE不是影响玉米籽粒中淀粉积累的关键酶;SS是淀粉积累的限速因子;GBSS对直链淀粉积累起重要的调节作用;SBE对支链淀粉积累起关键作用。     

不同糯性高粱胚乳淀粉形成与积累过程的酶学调控机制及显微结构变化

【目的】高粱是酿造白酒和食醋的主要原料,其淀粉组成和结构是影响高粱酿造品质的主要指标。通过研究淀粉积累过程中相关酶活性和淀粉粒超微结构的变化动态,解析高粱淀粉合成与积累的酶学调控机制,了解不同糯性高粱胚乳淀粉的超微结构特点,以期为酿造高粱的优质育种和栽培技术研究提供理论依据。【方法】以辽粘3号、辽杂19和辽杂10号3种不同糯性的高粱品种籽粒为研究对象,利用酶学及扫描电镜技术检测淀粉积累过程中相关酶活性的变化,观测淀粉积累过程中淀粉粒的形成过程及结构特征,利用相关分析研究淀粉合成过程中相关合成酶类的调控作用。【结果】淀粉合成过程中,不同胚乳类型高粱的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDPG）、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADPG）、可溶性淀粉合成酶（SSS）、结合态淀粉合成酶（GBSS）、淀粉分支酶（SBE）、淀粉去分支酶（DBE）活性均呈单峰曲线变化趋势;糯高粱结合态淀粉合成酶（GBSS）活性呈单峰曲线变化趋势,粳高粱、半粳半糯高粱则表现双峰曲线变化趋势。UDPG、ADPG、SSS活性与直链淀粉、支链淀粉积累速率显著正相关,SBE、DBE活性与支链淀粉积累速率呈显著正相关,GBSS活性与粳高粱、半粳半糯高粱直链淀粉积累速率呈显著正相关,与糯高粱直链淀粉积累速率表现正相关的趋势,但相关不显著。不同胚乳类型高粱淀粉粒的充实过程表现相似变化趋势,在开花后的14—35 d充实较快。糯高粱的淀粉粒较小,直径在10 μm以内,内部有圆孔型或楔形空洞。粳高粱淀粉粒较大,呈不规则球形,内部空洞极少。半粳半糯型高粱淀粉粒粒径分布较广,多数分布楔形或星形空洞,少部分无空洞。【结论】UDPG、ADPG、SSS是调控淀粉合成的关键酶,GBSS、SBE、DBE是调控淀粉组分比例的关键酶,SBE、DBE活性高是糯高粱支链淀粉含量高的主要原因,不同淀粉组分比例可能是影响淀粉粒结构的主要因素。     

马铃薯块茎淀粉合成相关基因在脱落酸和蔗糖诱导下的表达分析

【目的】在马铃薯块茎中确定能够促进淀粉合成基因表达的脱落酸(abscisic acid,ABA)和蔗糖处理体系。【方法】利用不同的溶液和条件,对马铃薯幼嫩块茎进行ABA、蔗糖和ABA+蔗糖处理;采用实时荧光定量PCR检测处理块茎中直链淀粉合成关键酶(granule-bound starch synthaseⅠ,GBSSⅠ)基因、支链淀粉合成关键酶(starch branching enzymeⅢ,SBE3)基因和淀粉合成限速酶大亚基(ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit 3,APL3)基因的表达,确定处理体系能否诱导基因表达;确定处理体系后,进一步检测其他9个淀粉合成基因的表达。【结果】实时荧光定量PCR检测表明：当处理溶液中包含氯化钙、琥珀酸钠和氯霉素等试剂,且马铃薯块茎置于处理溶液中28℃黑暗处理36 h时,与对照相比,ABA或蔗糖处理可明显升高GBSSⅠ和APL3的表达。对其他9个淀粉合成相关基因表达的检测结果显示：大部分合成基因正向响应ABA或蔗糖处理。【结论】本研究利用马铃薯块茎确定了能够促进淀粉合成基因表达的ABA和蔗糖处理...     

不同HMW-GSs组成小麦籽粒淀粉理化特性对面团稳定时间的影响

【目的】小麦面团由面筋蛋白形成的细丝包裹淀粉构成。面团的流变学特性影响着食品的加工品质。探究淀粉理化特性对面团流变学特性的影响,为阐明淀粉在面团中的作用提供理论依据。【方法】以12个小麦品种或品系为试验材料,这12个试验材料具有3种高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GSs）组合,新麦26、济麦44、西农615和藁城8901的亚基组合为1、7+8、5+10;西农221、西农979、西农633和西农059的亚基组合为1、7+8、2+12;15（85）2A、14（417）0-0-10、小偃22和周麦18的亚基组合为1、7+9、2+12。从试验材料的面粉中提取淀粉并用扫描电子显微镜观察淀粉粒形态,测定并分析淀粉理化性质（淀粉粒分布、直链淀粉含量、相对结晶度、短程有序度和热特性）和面团混揉特性（形成时间和稳定时间）。【结果】12个材料淀粉颗粒中,大淀粉粒呈不规则的椭圆形,小淀粉粒呈不规则椭圆形或多面体。新麦26、济麦44、藁城8901、西农221、西农979和西农059淀粉粒排列紧密,西农615、西农633、15（85）2A、14（417）0-0-10、小偃22和周麦18的淀粉粒排列较为分散,西农979、15（85）2A、小偃22和周麦18中含有较大直径的A型淀粉粒。A型淀粉粒含量越高,B型淀粉粒含量就会越低,B型淀粉粒与A型淀粉粒含量的比值就会越小。当材料间的直链淀粉含量接近时,那么它们的面团稳定时间也较为接近。12个材料淀粉的X射线衍射图相似,均属于A型晶体结构。淀粉的傅里叶变换红外光谱分析表明,新麦26拥有最高的1 045/1 022 cm^-1值和最低的1 022/995 cm^-1值;周麦18的1 022/995 cm^-1值最高,反而1 045/1 022 cm^-1值较低。这表明试验材料较高的1 045/1 022 cm^-1值通常对应较低的1 022/995 cm^-1值。12个试验材料的淀粉特性不同,其面团稳定时间也有显著差异。新麦26、济麦44、西农221、西农979和西农633具有较长的面团稳定时间,其中,新麦26的面团稳定时间远远长于其他材料。【结论】在12个试验材料中,直链淀粉含量（r=0.88,P<0.01）和淀粉短程有序度（r=0.83,P<0.01）与面团的稳定时间呈显著正相关,A型淀粉粒含量（r=0.61,P<0.05）、淀粉相对结晶度（r=0.84,P<0.01）和淀粉糊化焓（r=0.71,P<0.01）与面团稳定时间呈显著负相关。     

苹果转录因子MdWRKY40b抗白粉病的机理

【目的】探究苹果白粉病相关基因MdWRKY40b调控苹果抗白粉病的机理,为苹果白粉病的抗性育种提供理论依据。【方法】以苹果品种‘嘎拉’叶片为材料提取总RNA,并以cDNA为模板克隆MdWRKY40b 552 bp特异性片段,采用Gateway技术将该基因片段的正反向序列构建入RNAi表达载体pB7GWIWG2(Ⅱ)中,然后利用农杆菌介导法对苹果叶片进行转化获得转基因植株,苹果叶片选用组培苗茎尖处幼嫩叶片;利用RT-qPCR技术对转基因植株中MdWRKY40b、超氧化物歧化酶基因（SOD）、过氧化氢酶基因（CAT）、过氧化物酶基因（POD）以及β-1,3-葡聚糖酶基因（β-1,3-glucanase）的表达量进行分析;进一步以1年生植株为材料,通过白粉病菌（Podosphaera leucotricha）接种试验,分析转基因植株对白粉病的抗病性;然后以接种白粉病菌后0、5、10、15、20 d的转基因植株及其对照植株叶片为材料,进行氯化硝基四氮唑蓝液（NBT）和二氨基联苯胺法（DAB）染色来分析病菌侵染期间植物材料中超氧阴离子和过氧化氢的积累量,进一步对病菌侵染期间植株中SOD、POD、CAT和β-1,3-葡聚糖酶等酶活性进行测定。【结果】经过PCR检测,确定获得3个MdWRKY40b基因沉默株系,分别为RNAi-1、RNAi-2和RNAi-3;RT-qPCR结果显示3个转基因株系MdWRKY40b基因沉默效率分别为95.2%、92.2%、79.8%,转基因植株中SOD、CAT、β-1,3-glucanase的表达量相较野生型显著上调;人工接种白粉病菌后发现,与野生型植株相比,转基因植株叶片中的粉状病斑显著减少,超氧阴离子和过氧化氢的积累量显著降低,SOD、CAT、POD等调节植物超氧阴离子代谢的抗氧化酶以及抗病相关的β-1,3-葡聚糖酶的活性显著增强。【结论】MdWRKY40b的沉默使得苹果植株对白粉病的抗病性增强,推测转基因植株中SOD、CAT、β-1,3-glucanase的上调表达提高了苹果植株对白粉病的基础抗性,导致植物对超氧阴离子的清除能力增加,维持了植物体在响应病菌侵染过程中的低浓度超氧阴离子含量,从而减少高浓度超氧阴离子对植物的损伤。     

谷子条纹叶突变体A36-S的细胞学特性分析及基因定位

【目的】谷子是C₄模式植物,其叶色突变体是研究C₄光合途径的良好材料。通过研究谷子条纹叶突变体A36-S的细胞学特性并对突变基因进行定位,为克隆突变基因、解析谷子叶绿体合成及发育机理、进一步理解C₄光合调控机制奠定基础。【方法】谷子条纹叶突变体A36-S是由育种创制的中间材料A36自然变异而来。对比A36-S及其正常表型等基因系A36-N的表型特征,调查二者的株高、叶宽、叶长、穗重、千粒重、结实率等农艺性状指标;测定A36-S和A36-N的叶绿素含量、净光合速率、胞间CO₂浓度、气孔导度、蒸腾速率等光合指标,分析A36-S的光合特性;观察A36-S和对照品种豫谷1号的叶片半薄横截切片和超薄切片,分析A36-S叶片解剖结构特征,分别统计叶肉细胞和维管束鞘细胞中叶绿体的数量和面积,从而分析叶绿体合成及发育情况;构建A36-S×SSR41的F₂分离群体,统计群体中正常表型单株与条纹叶单株的数量,进行遗传分析;分别构建F₂分离群体正常单株与条纹叶单株的DNA混池,采用集团分离分析法（BSA法）进行突变基因的定位;筛选、开发多个SSR标记及In-Del标记,扫描F₂群体中条纹叶单株,进行进一步基因定位。【结果】谷子条纹叶突变体A36-S在全生育期表现出叶片不规则白色条纹的表型。农艺性状分析表明,相比其近等基因系A36-N,A36-S在株高、叶宽、穗重、千粒重、结实率等表型上均显著下降。光合指标测定表明A36-S叶片中叶绿素含量明显降低,尤其是叶绿素b含量下降更为严重,同时净光合速率也明显下降。叶片解剖结构观察发现,与对照豫谷1号相比,A36-S的Kranz结构变化并不明显,但叶绿体数量和大小都显著低于对照。观察叶绿体超微结构,发现A36-S的不同细胞间叶绿体发育状况差异较大,依据叶绿体发育情况可将叶片细胞可分为3类：Ⅰ类细胞具有正常发育的叶绿体;Ⅱ类细胞叶绿体基粒及片层结构减少;Ⅲ类细胞则叶绿体结构严重异常甚至不含有叶绿体。遗传分析表明A36-S表型受隐性单基因控制,利用F₂分离群体将突变基因定位在第4染色体7.66—27.90 Mb区间内。【结论】谷子A36-S条纹叶突变体表现为农艺性状及光合能力下降,叶片细胞叶绿体的数量、大小及结构均表现出显著异常。条纹叶性状受隐性单基因控制,利用分子标记将候选基因定位于第4染色体7.66—27.90 Mb区间内。     

三角鲂MHCⅠα基因全长cDNA克隆与生物信息学分析

主要组织相容复合体（major histocompatibility complex,MHC）是一类具有高度多态性的分子,在脊椎动物的先天免疫应答中起到重要作用。根据已报道鱼类的MHCⅠα基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR和RACE技术克隆三角鲂MHCⅠα基因cDNA序列全长,命名为Mete-UAA,并对其进行生物信息学分析。结果显示,Mete-UAA全长为2 102 bp,包含1 044 bp的开放阅读框,编码347个氨基酸。编码的MHCⅠα蛋白质预测分子量为38 699.18,等电点5.23,含有16个氨基酸组成的信号肽,具有亲水性,定位于细胞膜上,具有1个N-糖基化、3个O-糖基化和39个磷酸化的潜在位点。氨基酸序列同源性比对发现,Mete-UAA氨基酸序列与团头鲂同源性最高为75.79%,与草鱼同源性稍低于团头鲂,为75.25%。Mete-UAA具有MHCⅠα的典型结构特征,包含1个前导肽、3个胞外结构域、1个跨膜区和1个胞质区。二级结构分析显示,Mete-UAA蛋白质中α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲所占的比例分别为25.94%、9.22%、26.80%和38.04%。基于转录组学分析表明,感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后三角鲂MHCⅠα基因表达呈总体下降趋势。本研究从三角鲂肝中成功克隆MHCⅠα基因,分析了其生物信息学特征,为后续研究MHCⅠα参与调控三角鲂先天免疫应答的机制提供理论基础。     

基于转录组分析油菜素内酯对高温胁迫下酿酒葡萄花色苷合成及果实品质的调控机制

【目的】分析高温胁迫下参与油菜素内酯调控葡萄花色苷及果实品质合成的相关基因,探讨油菜素内酯调控果实花色苷及品质合成的机制。【方法】以酿酒葡萄‘赤霞珠’为试材,转色前一周利用红外辐射器模拟高温环境,并全树喷施0.6 mg·L^-1的2,4-表油菜素内酯(2,4-Epibrassinolide,EBR),测定花色苷、总糖及相关品质指标,选择转色中期(花后70 d)的果实进行转录组测序,从分子水平阐述EBR对高温胁迫下花色苷合成的影响。【结果】从转色开始,各处理花色苷含量逐渐升高;成熟时,高温组(HT)花色苷总量显著低于对照组(CK),高温油菜素内酯组(HTE)花色苷含量高于HT组。总糖、还原糖、蔗糖变化规律与花色苷相似,HT组含量均在成熟期时低于CK组,成熟期各种糖含量为CK组>HTE组>HT组。分析3种处理下‘赤霞珠’果实基因水平的差异,通过GO和KEGG富集发现了14个与蔗糖和淀粉代谢途经相关的差异基因,其中HT和HTE处理显著上调了10个基因,显著下调了4个基因;苯丙氨酸代谢途径有11个差异基因,其中有7个参与花色苷合成的基因在HT处理中上调,有4个参...     

中国野生毛葡萄转录因子VqWRKY6与VqbZIP1互作调控抗白粉病功能分析

目的 欧洲葡萄作为世界葡萄主栽品种,具有产量高、品质佳的优点,但对病害抵抗能力差。白粉病是严重危害葡萄栽培的一种真菌性病害,中国野生葡萄资源丰富,可为抗病育种提供充足种质资源。论文旨在筛选调控抗白粉病的葡萄转录因子基因,探究转录因子基因调控抗白粉病的作用机理,为选育葡萄抗病品种提供优质的基因资源。方法 从中国野生毛葡萄‘商-24’中克隆得到转录因子基因VqWRKY6,使用DANMAN和MEGA-X软件对序列进行分析。利用PEG介导转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析发挥转录调控作用的位置,利用酵母双杂交和双分子荧光互补试验证明VqWRKY6能够和转录因子VqbZIP1互作形成转录复合体。以感病葡萄‘赤霞珠’叶片为试材,通过农杆菌介导法瞬时转化到‘赤霞珠’葡萄叶片,叶片进行白粉菌（Uncinula necator）接种后,观察发病症状,用台盼蓝染色在显微镜下观察菌丝发育进程,使用DAB染色观察活性氧积累,比较共同过表达VqWRKY6和VqbZIP1的葡萄叶片、单独过表达VqWRKY6的葡萄叶片、单独过表达VqbZIP1的葡萄叶片和对照组叶片的差异。使用实时荧光定量PCR技术对抗病基因在白粉菌诱导下的表达水平进行分析。结果 VqWRKY6定位于葡萄2号染色体,编码342个氨基酸,属于WRKY家族的group Ⅲ亚家族。亚细胞定位和酵母转录激活试验证明,VqWRKY6在细胞核内发挥转录调控功能且在酵母中有转录激活活性。‘赤霞珠’叶片共同过表达VqWRKY6和VqbZIP1后,叶片表面白粉菌菌丝扩繁速率显著慢于单独过表达VqWRKY6和单独过表达VqbZIP1的叶片,共同过表达VqWRKY6和VqbZIP1的叶片组织中活性氧含量显著高于单独过表达VqWRKY6和单独过表达VqbZIP1的叶片;此外,VqWRKY6和VqbZIP1的协同调控能够激活茉莉酸（JA）途径的PR3、PR4,基因表达量显著上调。结论 VqWRKY6和VqbZIP1协同作用可能通过激活JA抗病途径,促进活性氧产生,增强抗病基因表达,抑制白粉菌的生长,从而提高葡萄对白粉病的抗性。因此,中国野生毛葡萄‘商-24’是重要的抗病种质资源,而VqWRKY6与VqbZIP1可作为重要的抗病基因资源。     

水稻黄绿叶突变体ygl3的鉴定与基因功能分析

【目的】 为了丰富和加深人们对植物叶色形成的分子机理认识,对水稻黄绿叶突变体ygl3（yellow green leaf 3）进行表型鉴定和基因克隆,阐明YGL3的分子功能,为解析YGL3调控水稻叶色形成的分子机理奠定基础。【方法】 从水稻中花11 CRISPR-Cas9敲除突变体库中鉴定出2份稳定遗传的等位黄绿叶突变体,命名为ygl3-1与ygl3-2,对突变体的表型进行鉴定,测定野生型和突变体苗期的叶绿素含量,运用透射电镜观察野生型和突变体ygl3的叶绿体结构。利用实时荧光定量PCR分析YGL3的组织表达模式,并使用BioXM 2.6软件对YGL3及其同源蛋白序列进行比对,采用酵母双杂交方法筛选YGL3的互作蛋白。【结果】 在苗期,与野生型相比,突变体ygl3叶片黄化,叶绿素、类胡萝卜素和总光合色素含量显著降低。透射电镜结果表明,突变体ygl3叶绿体形态异常,类囊体片层结构较少,而野生型叶绿体形态正常,类囊体片层结构排列有序。CRISPR-Cas9敲除位点鉴定结果表明,LOC_Os01g73450发生单碱基插入,导致蛋白翻译提前终止,该基因编码351个氨基酸的蛋白突变为55个氨基酸的截短蛋白。与野生型相比,LOC_Os01g73450的表达水平在突变体中显著下调。qRT-PCR结果表明YGL3在水稻根、穗、种子、叶鞘以及叶片中均有表达,且叶片中表达水平最高。YGL3编码一个质体定位的尿嘧啶核苷酸激酶。蛋白氨基酸序列比对表明YGL3蛋白在玉米、高粱、拟南芥等物种中均较为保守,与拟南芥同源蛋白氨基酸的同源性为59.4%。qRT-PCR结果表明,叶绿素合成基因（如HEMC、HEME和URO-D）在突变体ygl3中显著下调,而HEMB、HEMF和HEML等叶绿素合成基因在野生型与突变体之间无显著差异。酵母双杂交系统筛选水稻叶片酵母cDNA文库,发现YGL3与RNA编辑因子MORF8存在互作。【结论】 水稻黄绿叶突变体ygl3的表型是由LOC_Os01g73450突变导致,该基因与已报道的水稻黄绿叶基因YL2/YGL8等位。YGL3在叶片中高度表达,同时YGL3与MORF8在酵母中互作。     

外源色氨酸对低氮胁迫下高粱苗期叶片碳氮平衡和衰老特性的影响

【目的】研究外源色氨酸对低氮胁迫下高粱叶片衰老的影响,探讨低氮条件下高粱叶片碳氮平衡与衰老的关系,旨在挖掘高粱耐低氮胁迫的有效调控手段。【方法】选用耐低氮高粱自交系398B和氮敏感自交系CS3541为试验材料,采用水培试验,设置正常氮(5 mmol·L^-1)和低氮(0.5 mmol·L^-1)2个氮水平,并进行50 mg·L^-1外源色氨酸喷施处理,喷施10 d后测定叶片形态、组织结构、光合特性、叶绿素荧光参数、叶片碳氮代谢相关物质含量和酶活性、C/N及衰老相关基因表达水平,并分析低氮胁迫下高粱幼苗叶片C/N与衰老相关基因的相关性。【结果】(1)与正常氮水平相比,低氮胁迫显著降低了398B和CS3541的叶面积,而外源色氨酸处理使398B和CS3541的叶面积显著增加了36.72%和52.06%;外源色氨酸显著增加了低氮胁迫下398B和CS3541的叶干重和叶鲜重。(2)与正常氮水平相比,低氮胁迫下,398B花环结构相对完整,而外源色氨酸处理使叶片细胞排列整齐,花环结构清晰;外源色氨酸显著增加了低氮胁迫下398B叶片叶绿素含...     

玉米pTAC2影响苗期叶片叶绿素合成的转录组分析

【目的】叶绿素是参与光合途径最为重要的光合色素。叶绿体的发育及叶绿素的合成在很大程度上依赖于质体基因组与核基因组之间的双向信号传导来精确协调基因表达。通过对白化表型的CRISPR/Cas9-ZmpTAC2转基因阳性纯合突变材料进行RNA-seq研究,筛选和鉴定参与叶绿素合成的相关基因,为明确叶绿素的合成途径奠定基础。【方法】以CRISPR/Cas9-ZmpTAC2玉米转基因编辑纯合突变株系为研究材料,使用透射电镜观察叶绿体超微结构和分光光度法测定叶片叶绿素含量,确定叶绿体发育状态及叶绿素合成情况。对转基因阴性材料（CK）和CRISPR/Cas9-ZmpTAC2转基因纯合编辑材料（zmptac2）苗期叶片取样进行转录组测序。通过生物信息学分析,寻找CK与zmptac2间差异表达的基因;qRT-PCR对差异表达基因进行验证。通过酵母双杂交筛选与玉米pTAC2互作的蛋白质。【结果】共获得15株T₀转基因植株,包括绿色植株（7株）和白色植株（8株）。绿色幼苗中3株为转基因阴性材料,4株为转基因阳性（2株为未编辑,2株为杂合编辑突变）,白色植株(8株)均为转基因阳性纯合编辑。与CK相比,突变体（zmptac2）叶绿体发异常,叶绿素含量显著降低。RNA-seq的结果显示,CK与zmptac2之间共检测到1 367个基因差异表达,其中618个基因上调表达（zmptac2/CK）,749个基因下调表达（zmptac2/CK）。GO富集分析显示,下调基因显著富集到叶绿体和质体中。KEGG分析表明下调表达基因显著富集在苯丙氨酸代谢、酪氨酸代谢和异喹啉生物碱生物合成等途径。选取的15个差异基因表达模式均与测序数据相一致,表明测序结果是可靠的。与CK相比,zmptac2中依赖PEP（plastid-encoded RNA polymerase）转录的基因表达量显著降低,而依赖NEP（nuclear gene-encoded RNA polymerase）转录的基因表达量则显著上升。通过对玉米cDNA文库筛选和互作验证,鉴定出ZmpTAC3与ZmpTAC2存在互作。【结论】ZmpTAC2突变会导致叶绿体早期生物合成受阻,该基因参与叶绿体发育及叶绿素合成,且该种作用是由ZmpTAC2调控PEP相关基因表达而实现的。     

柑橘黄龙病菌侵染对甜橙叶片糖代谢的影响

【目的】研究甜橙（Citrus sinensis）在柑橘黄龙病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）侵染下不同时期糖代谢的变化,以探讨其与柑橘叶片中淀粉积累间的关系,为进一步阐明柑橘黄龙病的发病机理提供理论依据。【方法】以甜橙为供试材料,采用腹接接种病原的方法,试验组植株用感染黄龙病菌的芽条进行嫁接,对照组植株用健康芽条进行接种,每个植株均嫁接3个芽条。在检测到感病的植株中选取生长状况良好且接近的3株作为后续试验材料,每月采集1次成熟叶片,至10月份结束。采集的叶片立即抽提DNA和RNA,并进行可溶性糖及淀粉含量的测定,其余叶片用液氮速冻后保存于-80℃用于测定糖代谢过程中关键酶活性的变化,同时利用实时荧光定量PCR技术比较二者关键酶基因表达量的差异。【结果】随着病原菌胁迫时间的延长,可溶性糖和淀粉含量总体呈升高趋势,均在6月达到峰值,分别为对照的1.59和3.73倍,在感病后期开始有所下降;通过对二者的比值分析发现,感病植株的比值随时间的延长不断下降。在黄龙病菌侵染的不同阶段,各种酶的作用程度有所不同。感病植株的蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性在感病初期迅速上升至顶峰,高达58.44 μg·g^-1·min^-1,至后期已略微低于对照;酸性转化酶（AI）总体显示出较高活性,各个时期均有显著性差异（P＜0.05）,感病中期活性最高为对照的2.91倍;中性转化酶（NI）活性在感病和对照中均维持较低水平,且变化趋势基本一致;可溶性淀粉合成酶（SSs）与束缚性淀粉合成酶（GBSS）协调作用,共同参与淀粉合成的调控;淀粉酶活性在感病不同时期均有所下降,在感病中期低至0.38 U·g^-1。定量PCR分析表明,蔗糖磷酸合成酶基因SPS1表达量显著升高,与其酶活性具有显著相关性（P＜0.05）。蔗糖分解相关基因中,蔗糖合成酶基因SuSy在感病不同时期的表达差异不大,变化幅度小;细胞壁酸性转化酶基因CSCWI在不同时期均上调表达,最高上调约7.4倍,且表达量一直维持在较高水平;与CSCWI相比,液泡酸性转化酶基因CUAI1的表达水平较低。淀粉合成相关酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因最高上调3倍左右;淀粉分解相关基因BAM3、MEX1和DPE2在不同时期有所下调,达到显著性差异水平（P＜0.05）。【结论】柑橘黄龙病感染甜橙后,对植株叶片中光合产物的形成与运转产生影响,扰乱宿主糖代谢平衡,与宿主淀粉积累及后期症状的产生有密切关系。     

生理性黄化对吐鲁番地区葡萄枝、叶形态学变化的影响

【目的】研究黄化病对葡萄枝叶形态、解剖结构及叶片矿质元素的影响,为葡萄发生叶片黄化的原因提供理论参考。【方法】对吐鲁番地区主栽品种无核白和无核白鸡心葡萄叶片叶绿素含量、枝叶组织结构及叶片矿质元素进行研究,分析葡萄叶片黄化存在的问题。【结果】随着黄化程度的不断加深,无核白正常株新梢节间长、叶重、单叶厚及叶绿素含量分别是重度黄化的1.30、1.38、1.35及5.70倍;无核白鸡心黄化叶栅海比仅仅是正常叶的61.84%,且叶片组织内栅栏组织细胞和海绵组织细胞之间模糊不清;无核白正常株叶片P、K含量比黄化株叶片分别减少36.51%和51.50%。【结论】葡萄生理性黄化导致从枝叶表型特征到微观解剖结构均与正常株有明显差异,叶片质量、叶绿素含量、茎木质部厚度、叶栅海比、叶灰分中P、K含量等指标的变化对于判断葡萄生理性黄化程度具有重要的参考价值。     

薇甘菊光能利用及叶绿素合成在不同光照强度下的响应

【目的】 光是植物进行光合作用的重要生态因素之一,光合色素对光的捕获和利用影响植物的生长发育进程,进而影响其在自然生态系统中的生存和适合度。明确薇甘菊（Mikania micrantha）光合生理特征与叶绿素生物合成途径的基因表达对不同光照强度的响应,以及薇甘菊光合能量与叶绿素转化的相互关系,为解析薇甘菊“快速生长”提供生理生态学证据。【方法】 以薇甘菊为研究对象,采用乙醇浸提法测定不同光照强度（0、20%、40%、100%）下各光合色素含量,分析其叶绿素a和b比值（Chl a/b）的变化规律,比较不同光合途径代表植物（C3、C4和CAM）光合特性;利用微量法和蒽酮比色法分别测定上述光照强度下薇甘菊叶片组织中ATP和淀粉含量;构建不同光照强度下薇甘菊cDNA文库并开展转录组测序;利用OrthoFinder、Blastp、HISAT2、StringTie和R包等生物信息学软件分析不同光照强度变化下薇甘菊叶绿素合成和捕光复合体（LHC）基因表达模式,阐述叶绿素合成途径相关基因表达变化规律。【结果】 在100%的光照强度下,薇甘菊叶绿素b和类胡萝卜素含量以及Chl a/b与C4植物玉米相近,并且薇甘菊和玉米叶片中Chl a/b显著高于C3（水稻和番茄）和CAM（芦荟）植物。不同光照强度下的薇甘菊叶片中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量变化不显著,但Chl a/b呈现出随光照强度增加而显著增加的趋势;40%和100%光照强度下,薇甘菊叶片中ATP含量变化幅度较小,而淀粉含量随光照强度上升显著升高;当光照强度为0时淀粉含量急剧下降,此时ATP含量呈现升高趋势;薇甘菊叶绿素生物合成中HEMA、CHLH、CRD1和CAO基因家族的基因表达量受光诱导调控,高光照强度下捕光复合体（LHC）基因的表达量较高。【结论】 不同光照强度下薇甘菊叶片可能通过调节叶绿素a和b的合成,调控淀粉和ATP的相互转化,奠定了薇甘菊较高光合速率和较强光适应能力的基础。     

高温胁迫对葡萄幼树生理指标和超显微结构的影响

【目的】 研究高温胁迫对葡萄生理指标和超显微结构的影响,探讨葡萄在高温胁迫下的生理响应机制。 【方法】 以一年生欧亚种‘赤霞珠’和刺葡萄‘君子1号’扦插苗为试验材料,在35℃、40℃和45℃植物培养箱中连续处理48 h,以25℃培养的植株作为对照,检测葡萄叶片的相对电导率、相对含水量、叶绿素总量、抗氧化酶活性、丙二醛（MDA）/超氧阴离子/过氧化氢含量、叶绿素荧光参数和光合参数,并通过扫描电镜和透射电镜对气孔形态和叶绿体结构进行观察。 【结果】 在35℃和40℃高温处理后,‘赤霞珠’和‘君子1号’的植株形态、相对电导率、相对含水量、叶绿素总量、叶绿素荧光参数均无显著变化,但净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）和气孔导度（Gs）显著降低;在45℃高温处理后,‘赤霞珠’和‘君子1号’号均出现胁迫症状,相对电导率显著增加,相对含水量、叶绿素总量、Fv/Fm、ΦPSII、Pn、Tr和Gs显著降低,且‘君子1号’各参数的变化幅度大于‘赤霞珠’。随着处理温度的升高,葡萄叶片中丙二醛/超氧阴离子/过氧化氢含量、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性不断增加,而过氧化氢酶（CAT）在中度高温胁迫下活性最高,且‘赤霞珠’SOD和CAT活性的增加幅度大于‘君子1号’。扫描电镜观察发现,常温下‘赤霞珠’的气孔密度大于‘君子1号’,在高温处理后葡萄叶片的气孔开张度减小,但气孔大小无显著变化。用透射电镜观察发现,高温处理使叶绿体的体积变大、形状变圆,叶绿体膜解体,出现大量巨型淀粉粒,并在‘君子1号’叶绿体上观察到大量嗜锇颗粒。 【结论】 ‘赤霞珠’的气孔密度大,叶绿体结构稳定,高温处理后SOD和CAT活性大幅增加是其耐热性高的重要原因。     

土霉素处理对柑橘黄龙病的防治效果及PP2基因表达的影响

【目的】评价土霉素(oxytetracycline,OTC)药剂对不同发病程度柑橘黄龙病（Huanglongbing,HLB）的防治效果,并检测OTC处理后韧皮部关键基因——韧皮部蛋白2（PP2）的表达量变化,为HLB的有效防控提供科学依据,也为OTC作用机理研究提供参考。【方法】应用可有效抑制、杀死病原菌的OTC,树干定量注射0.1 g/树于不同发病程度HLB（初感染、轻度发病和重度发病3组）的4年生Valencia夏橙,注射后7、30、60、90 d定期采集Valencia叶片样品监测HLB致病菌Cadidatus Liberibacter asiaticus(Las)含量、淀粉含量及PP2基因表达量变化。树干注射OTC后90 d采集不同处理Valencia的嫩叶、成熟叶片及茎,进行淀粉染色光学显微观察（LM）,直观反映植株累积淀粉的变化。树干注射OTC后80 d调查柑橘嫩叶抽发的情况,综合一系列指标评价OTC对HLB的防治效果。【结果】注射OTC 0.1 g/树对初感染HLB的4年生Valencia植株治疗作用最明显,7 d后检测即为阴性,并可保持90 d,其成熟叶片的淀粉含量明显减少,但茎内仍有淀粉粒富集;轻度发病夏橙注射90 d后叶片内的Las含量从（1.68×10 ⁶±858884）cells/g叶片减至（7.21×10 ⁴±30981）cells/g叶片,下降幅度极为明显,其成熟叶片内的淀粉含量在90 d内一直呈下降趋势;重度发病植株注射后叶片内的Las含量从（4.10×10 ⁸±3.04×10 ⁸）cells/g叶片减至（2.80×10 ⁷±2.70×10 ⁷）cells/g叶片,但从数量而言仍然有较多分布,除了新长出的秋梢,其成熟叶及茎内的淀粉粒含量仍旧很大,说明0.1 g/株OTC不足以治愈4年生重度发病Valencia夏橙。对PP2基因表达分析结果显示,注射OTC后30 d,Valencia夏橙体内的PP2基因表达量大幅度下降,随后90 d内表达量稳定,与注射后30 d的表达量较为一致。 【结论】OTC可以用于HLB的防控,对初感染（Las含量为<9.00×10 ⁵cells/g叶片）及轻度发病（Las含量为9.00×10 ⁵—9.00×10 ⁷ cells/g叶片）的柑橘植株治疗作用较好,不适用于重度发病植株（Las含量为>9.00×10 ⁷ cells/g叶片）的治疗。注射OTC后,PP2基因表达量下降明显,说明OTC可有效减少韧皮部病菌等的胁迫压力。