长链非编码RNA调控植物生长发育与逆境胁迫响应研究进展

长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类转录本长度大于200 nt的非编码RNA,其表达和保守性比编码蛋白的mRNA低,在动植物各个生物学过程中发挥重要作用。近年来,植物lncRNAs的作用和功能受到广泛关注。本文总结了lncRNAs调控植物生长发育和生殖,应对低温、干旱等非生物胁迫和病虫害等生物胁迫方面的功能,同时根据lncRNAs在基因组上的来源,分类讨论了不同来源lncRNAs的作用机制,为深入挖掘植物新的lncRNAs、功能验证与作用机制探究提供参考。     

泡桐丛枝病相关lncRNAs的表达和调控

为揭示与泡桐丛枝病相关的长链非编码RNA(lncRNA),探讨其调控模式,利用高通量测序平台Illumina HiseqTM2000对泡桐的健康苗、丛枝病苗和利福平处理的丛枝病苗进行测序,筛选出差异表达的lncRNAs和靶基因,并对靶基因进行基因本体论(GO)功能及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集性分析。结果表明:共鉴定出的3 237个候选lncRNAs,其中PT/PTI、PT/PTIL-100和PTI/PTIL-100中差异表达并且相同的lncRNAs有147个,靶基因富集于40个GO和119条代谢通路。通过比较分析,发现72个lncRNAs可能与泡桐丛枝病发生相关,其靶基因主要参与的KEGG代谢途径有磷脂酶D信号通路、Wnt信号通路、ABC转运、糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定生物合成途径、次生代谢产物的生物合成、泛素介导的蛋白水解、玉米素生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等。预测lncRNAs(TCONS_00009507、TCONS_00019521、TCONS_00012917、TCONS_00030963和TCONS_0002705)调控靶基因参与泡桐丛枝植原体与泡桐互作和影响细胞周期改变泡桐形态建成,为泡桐丛枝病发生机理的研究奠定基础。     

利福平对毛泡桐长链非编码RNA表达谱变化的影响

为阐明lncRNAs对泡桐生长发育的调控作用,以利福平处理前后毛泡桐健康苗为试验材料,利用高通量测序技术研究利福平处理前后毛泡桐长链非编码RNA及其靶基因的表达变化情况。共鉴定出129个差异表达的lncRNAs,其中有83个差异lncRNAs对应289个靶基因,对这些靶基因进行GO功能分类,发现这些差异的靶基因共参与9个GO分类,其中细胞过程、代谢过程及涉及单有机体的靶基因数量最多。KEGG代谢通路分析发现,这些差异靶基因参与了植物激素信号转导、次生代谢生物合成等代谢通路。并采用qRT-PCR技术验证了随机挑选的6个差异表达长链非编码RNA及靶基因,结果与高通量测序数据一致。     

长链非编码RNA及其在斑马鱼中的研究进展

随着测序技术的不断发展和完善,在人类和其他模式生物中,发现了一类具有重要调控功能的RNA,即长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。长链非编码RNA是一类在生物体内大量存在且无编码功能的RNA,主要参与基础转录、特异基因的转录调控、转录后调控、翻译调控和表观遗传学调控等。本文中综述了长链非编码RNA及其在水生动物斑马鱼中的研究进展,可为水产养殖动物的遗传育种和健康养殖提供参考。     

长链非编码RNA在家畜方面的研究进展

长链非编码RNA（Longnon-codingRNAS,lncRNAs）是一组长度大于200个核苷酸、缺少特异完整的开放阅读框、无蛋白质编码功能的RNA。lncRNA种类繁多,数量庞大,占哺乳动物基因组转录物的绝大部分。相对于研究较多的非编码小RNA,lncRNA的功能目前尚不完全清楚。但越来越多的研究发现,lncRNA在多个水平调控基因的表达,在胚胎发育、物种进化、细胞分化和某些疾病如神经退行性疾病的发生过程中起着重要作用。本文在简要介绍lncRNA基本概念的基础上,结合当前在家畜方面研究成果,就lncRNA在转录水平、转录后水平和表观遗传水平调控基因表达的机制做一综述。     

南阳黑猪肌内脂质沉积相关lncRNA鉴定和功能预测

为了探讨长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)在南阳黑猪肌内脂肪沉积中的重要作用，通过分析已发表的南阳黑猪高脂组和低脂组背最长肌转录组数据，通过编码潜能预测获得可能的lncRNA,结合DESeq2软件筛选出在南阳黑猪高脂组和低脂组背最长肌差异表达基因和lncRNA,并通过GO和KEGG通路富集分析，找出与南阳黑猪肌内脂肪沉积相关的差异表达lncRNA。结果表明，通过编码潜能预测获得61个新的lncRNAs,新鉴定lncRNAs和已知lncRNAs与编码基因相比较表现出一些典型特征，如转录本长度较短、外显子数较少。差异表达分析发现，814个编码基因和98个lncRNA在低脂和高脂组背最长肌间差异表达。差异表达的基因参与了多种与脂质代谢相关的信号通路，如甘油三脂代谢、PPAR信号通路、脂肪酸生物合成、脂肪酸降解等。联合差异表达lncRNAs的靶基因预测和差异表达基因结果分析表明，一些lncRNA可能作用于潜在的靶基因，参与脂质代谢过程，调控背最长肌脂质沉积。研究结果为进一步深入研究与猪脂质沉积相关的lncRNA生物学功能及调控机制奠定了基础，在未来育种中改...     

利福平和甲基磺酸甲酯对感染植原体毛泡桐中长链非编码RNA变化的影响

为研究与泡桐丛枝病相关的长链非编码RNAs(lncRNAs),以毛泡桐(Paulownia tomentosa)的健康苗、患丛枝病的病苗及分别用100 mg·L~(-1)的利福平和60 mg·L~(-1)甲基磺酸甲酯处理病苗得到的处理苗为试验材料,利用高通量测序技术研究病健苗及试剂处理苗中的lncRNAs及相应靶基因的表达情况。共鉴定出3 700个lncRNAs,2 219个靶基因,从中得到389个差异表达的lncRNAs和对应的203个靶基因,并对其靶基因进行了GO功能分类。通过方案设计鉴定得到3个与泡桐丛枝病相关的lncRNAs,预测其对应的靶基因分别为磷脂酶D、蛋白磷酸酶以及WNK赖氨酸缺乏蛋白激酶。采用实时定量PCR技术验证随机挑选的5个lncRNAs及其靶基因,验证结果与高通量测序结果一致。     

前沿动态

<正>RNA测序取得重大突破转录组是特定细胞或组织在特定时间或状态下转录出来的所有RNA的集合。通过对转录组的研究可以揭示生物体的基因表达,研究结构变异及发现新基因。广泛使用的RNA-seq适用于诸如mRNA、长链非编码RNA、miRNA或来自rRNA的片段、小核RNA及小核仁RNA等大多数的细胞RNAs。     

相对定量法分析小鼠CRBN基因表达

[目的]研究CRBN基因与常染色体隐性遗传非综合征轻型精神发育迟滞（ARNSMR）的关系,探讨小鼠CRBN基因mRNA在不同组织中的表达情况。[方法]应用RT-PCR和Real-time PCR技术,研究了小鼠CRBN基因在肺、肝、心脏、肾和大脑中的表达情况。[结果]小鼠CRBN基因mRNA在肺、大脑中表达量较高,在心脏中表达量最低。[结论]小鼠CRBN基因广泛表达于不同组织,除了与学习、记忆功能相关外,可能还有其他功能。     

植物表观遗传中的RNA介导的DNA甲基化

植物基因组对基因的表达调控不仅表现在转录水平上,也表现在染色质结构的变化上。在植物中存在着特有的RNA 聚合酶Ⅳ (RNA Pol Ⅳ) 和 RNA聚合酶Ⅴ (RNA Pol Ⅴ),它们与RNA 聚合酶Ⅱ(RNA Pol Ⅱ)相似。RNA Pol Ⅳ和RNA Pol Ⅴ的转录产物包括参与表观遗传调控的长链非编码RNA (lncRNAs)和干扰小RNA (siRNAs)。这类非编码RNA广泛地参与了基因组上发生的胞嘧啶甲基化,去甲基化以及甲基化扩散。近年来,研究已经发现RNA介导的染色质水平的基因沉默涉及植物的生长发育、胁迫应答、表观遗传多态性,并对植物的表型多样化、生理适应性以及植物进化具有显著影响。     

GTPase RABE1b参与拟南芥胚胎发育的研究

[目的]研究影响拟南芥早期胚胎发育分裂模式的基因。[方法]从拟南芥T-DNA插入的突变体库中分离到2个T-DNA插入突变体,通过表型观察胚胎发育情况。[结果]PCR-WALKING表明T-DNA插入位点分别位于基因At4g20360的5＇非编码区和启动子区,基因编码的GTPase RABE1b蛋白为Rab蛋白家族的成员,将这2个突变体分别命名为Atrabe1 b-1和Atrabe1b-2。透明分析发现此突变体在胚胎发育早期球形胚时期分裂模式出现异常,RT-PCR分析发现此基因在拟南芥中以组成型表达。[结论]基因At4g20360影响拟南芥早期胚胎发育的分裂模式,推测其编码的蛋白GTPaseRABE1b可能对控制拟南芥胚胎发育过程中的细胞分裂起重要作用。     

非编码RNA对哺乳动物精子发生过程的调控

精子发生始于精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs),SSCs一部分自我更新,另一部分首先分裂形成Asingle(As)型精原细胞,进而形成Aparied(Apr)型精原细胞和Aaligned(Aal)型精原细胞;随后,Aal型精原细胞再发育为A1-A4型精原细胞、中间型精原细胞以及B型精原细胞;B型精原细胞有丝分裂可形成初级精母细胞,经历前细线期、细线期、偶线期、粗线期,再经减数分裂形成次级精母细胞;当圆形精子细胞形成之后,则经细胞核浓缩等过程形成晚期的细长型成熟精子,随之最终变形成为精子。这一复杂的生理过程需要相关基因的适时表达,并受到转录和转录后水平的调控。研究表明,多种类型的非编码RNA(nc RNAs)在精子发生过程中发挥着重要作用。nc RNAs包括微小RNAs(mi RNAs)、与Piwi蛋白相互作用的RNAs(pi RNAs)、长链非编码RNAs(lnc RNAs)、环状RNAs(circ RNAs)以及内源性小干扰RNAs(endo-si RNAs)等。这些nc RNAs的表达具有细胞组织特异性和发育阶段特异性,可从时间和空间上精确调控精子发生的整个过程。mi RNAs是一类长约21—25 nt的内源性非编码单链RNA分子,广泛存在于各种生物中,其形成至少需要Drosha和Dicer等两种RNA酶的参与,可降解靶m RNA或抑制靶m RNA翻译,对SSCs干性的维持、自我更新和分化的调控以及生殖细胞减数分裂和精子发生过程具有重要的调控作用。此外,精子发生过程中,在生殖细胞不同阶段所表达的基因也可调控mi RNAs的生成加工过程。pi RNAs是2006年发现的一种新的小RNA,长度约24—32nt,其作用与Dicer酶无关,能够与生殖细胞特异性蛋白Piwi蛋白家族成员结合,进而行使生物学功能,其主要表现为:在表观遗传水平和转录后水平沉默转座子、反转座子等基因组移动遗传元件,维持生殖细胞自身基因组稳定性和完整性,调控生殖细胞增殖、减数分裂及精子发生过程。Lnc RNAs是一类长度大于200 nt的nc RNAs,其生成加工过程与m RNA类似,并且与m RNA有着相似的结构。不同来源的lnc RNAs可通过转录前与转录后多种机制进而调控SSCs的干性及分化,并且调控生殖细胞凋亡。有些lnc RNAs还可调控mi RNAs的表达,进而调控精子发生过程。circ RNAs是区别于传统线性RNA的一类新型RNA,在不同物种中具有保守性,在组织及不同发育阶段呈特异性表达。其生成加工方式与其序列相关,同一基因位点可通过选择性环化产生多种circ RNAs进而发挥功能。研究表明,circ RNAs可结合mi RNAs从而调控生精过程。相对于其他nc RNAs,endo-si RNAs的生成加工方式更为简单,并有着与mi RNAs相同的作用方式,在精子发生和雄性生殖中扮演着重要角色。文中结合最新的研究进展,综述了几种nc RNAs的生成及其在精子发生过程中的调控作用,旨在为精子发生过程中nc RNAs的进一步研究提供参考。     

GTPase RABE1b参与拟南芥胚胎发育的研究

[目的]研究影响拟南芥早期胚胎发育分裂模式的基因。[方法]从拟南芥T-DNA插入的突变体库中分离到2个T-DNA插入突变体,通过表型观察胚胎发育情况。[结果]PCR-WALKING表明,T-DNA插入位点分别位于基因At4g20360的5′非编码区和启动子区,基因编码的GTPase RABE1b蛋白为Rab蛋白家族的成员,将这2个突变体分别命名为Atrabe1b-1和Atrabe1b-2。透明分析发现此突变体在胚胎发育早期球形胚时期分裂模式出现异常,RT-PCR分析发现此基因在拟南芥中以组成型表达。[结论]基因At4g20360影响拟南芥早期胚胎发育的分裂模式,推测其编码的蛋白GTPase RABE1b可能对控制拟南芥胚胎发育过程中的细胞分裂起重要作用。     

盐碱胁迫下青稞全转录组分析

【目的】长链非编码RNA(lncRNAs)在动植物的各种生物过程中起着重要作用。青稞是青藏高原的主要粮食作物,对其胁迫诱导基因的研究不仅有助于了解胁迫耐受的分子机制,而且有助于利用基因工程培育胁迫耐受性品种。【方法】本文对2个青稞品种(0119盐碱高抗,0226盐碱敏感)幼苗分别进行盐碱胁迫和对照处理2、8、24、48和72 h后,提取植株叶片RNA进行全转录组测序(设置3个生物学重复),共获得60组RNA-seq数据。【结果】青稞基因组中含有大量的lncRNAs;总共鉴定出6704个lncRNAs,包括2741个基因间长链非编码RNA和1378个反义长链非编码转录本。比较盐碱处理组和对照组的基因表达水平,获得5个时间点的mRNAs和lncRNAs的差异表达基因集,但5个差异表达基因集合之间重叠较少,说明在盐碱胁迫的不同阶段,不同的mRNAs和lncRNAs参与了盐碱响应。研究发现,在24 h时0119和0226中差异表达基因的数目均降低,这可能与作物对刺激反应的两个阶段相关。根据基因的相对位置和表达相关性,预测了lncRNAs的顺式和反式靶基因;功能富集分析发现在0119品种中特异性差异表达的3118个(1303个上调和1815个下调)mRNAs和798个(346个上调和452个下调)lncRNAs可能与耐盐碱性有关,它们直接或间接参与"胁迫应答/刺激反应"、"离子运输"、"膜"和"植物激素信号转导"。为了验证利用RNA-Seq数据计算基因表达量的可靠性,挑选部分mRNA和lncRNA在8, 24和48 h盐碱胁迫的0119品种中进行RT-qPCR验证,结果表明RT-qPCR与RNA-seq的基因表达水平一致。【结论】本研究有助于进一步了解青稞盐碱耐受性的机制,提高青稞对盐碱胁迫的耐受性。     

Kin17基因在斑马鱼胚胎发育过程中的表达特性分析

Kin17是一种在物种进化中较保守的、在各种组织中普遍表达的蛋白。为明确Kin17基因在斑马鱼发育中的表达特性及在斑马鱼胚胎发育过程中的功能,利用RT-PCR和Q-PCR方法检测Kin17 mRNA在斑马鱼中的表达情况,运用免疫组织化学技术检测Kin17蛋白在成鱼各组织中的表达特性。采用胚胎整体原位杂交(WISH)方法观察Kin17 mRNA在斑马鱼胚胎内的表达分布情况。利用吗啉反义寡核苷酸介导的基因敲降技术降低Kin17的表达水平,并观测斑马鱼胚胎发育情况。结果表明:Kin17转录本母源存在,Kin17 mRNA的表达水平在原肠期前表达较低,到体节期迅速上升且稳定在较高水平。Kin17基因在斑马鱼成鱼多个组织中均有表达,高表达于卵巢、精巢、肠道组织。原位杂交结果显示,Kin17基因在斑马鱼胚胎的原始生殖细胞、脑部、眼部中的表达量较高。注射Kin17吗啉反义寡核苷酸使Kin17基因表达受到抑制,导致斑马鱼胚胎发育迟缓,出现眼部缺失、腹腔肿大、尾部缺失等不同程度的畸形。上述结果提示,Kin17在斑马鱼胚胎发育过程中发挥重要作用。     

黄颡鱼DMRT1基因cDNA全长克隆及其表达分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了黄颡鱼DMRT1基因cDNA全长序列,并利用实时荧光定量RT-PCR技术对该基因在黄颡鱼成体不同组织及不同发育阶段的表达情况进行研究。结果表明,黄颡鱼DMRT1基因cDNA序列全长1 381bp,其中5′端非翻译区30bp,3′端非翻译区454bp[不包括poly(A)],开放阅读框885bp,编码295个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,黄颡鱼DMRT1基因与革胡子鲶同源性最高(为81%),与黑鲷、虹鳟、斑马鱼、青鳉的同源性分别为60%、59%、64%和52%,与小鼠、人的同源性较低,分别为42%和44%。实时荧光定量RT-PCR分析表明:DMRT1基因在黄颡鱼胚胎发育阶段及胚后发育的1～51d仔鱼均有表达,且在胚后发育的第31天表达量最高;在成体,只在雄性精巢中特异性表达,其他组织均无表达,且性腺发育阶段的Ⅳ期精巢表达量最高,表明该基因可能在黄颡鱼雄性性腺的形成或功能维持上具有重要作用。     

长非编码RNA研究进展及其在油棕环境适应中的调控作用

综述了长非编码RNAs(lncRNAs)的研究进展,并介绍其在油棕非生物环境胁迫适应性的调控作用,以期为lncRNAs作为调控因子在油棕环境适应中的应用提供参考。     

重组斑马鱼IL-10蛋白的真核表达

[目的]在昆虫S2细胞中重组表达斑马鱼IL-10蛋白。[方法]PCR扩增斑马鱼IL-10蛋白编码基因,连接到分泌表达载体pMT/Bip/V5-His A中与辅助质粒pCoBlast共转染S2昆虫胚胎细胞,通过Blasticidin加压筛选,获得稳定表达斑马鱼IL-10的细胞系。用硫酸铜诱导IL-10蛋白表达,收集无血清的细胞表达上清,采用SDS-PAGE及Western鉴定目的蛋白。[结果]目的蛋白在昆虫细胞中获得表达,SDS-PAGE结果表明相对分子质量为23 kD,与预期结果相一致。[结论]获得了重组斑马鱼IL-10蛋白,为进一步在蛋白水平上研究其功能和调控机制奠定了基础。     

反义抑制miR-202引起斑马鱼早期胚胎发育异常研究

为了探讨miR-202在鱼类胚胎发育中的功能,采用实时定量反转录PCR技术和整体原位杂交技术检测了miR-202在斑马鱼胚胎发育阶段的表达。结果发现miR-202是母源性分子并在斑马鱼胚胎发育过程中持续表达,尤其在早期胚胎发育阶段表达水平较高。在此基础上,采用基因沉默技术在斑马鱼受精卵中显微注射miR-202的反义锁核苷酸,实时荧光定量反转录PCR技术和整体原位杂交技术结果显示miR-202反义锁核苷酸可以显著下调斑马鱼胚胎中miR-202表达水平,同时发现反义抑制miR-202后胚胎发育停滞在4 hpf时左右。共同注射miR-202前体可以部分挽救反义抑制miR-202后导致的胚胎发育停滞。本研究证明miR-202在斑马鱼胚胎发育过程中起着重要的调控作用,其功能是斑马鱼胚胎早期发育所必需的。为进一步探索miR-202在鱼类胚胎发育过程的功能奠定了基础。