三角帆蚌外套膜碱性磷酸酶与钙代谢的关系

利用切片染色确定了碱性磷酸酶在三角帆蚌外套膜中主要分布在黏膜层.在培养的细胞中分别加入碱性磷酸酶激活剂、抑制剂和放线菌酮,并用原子吸收光谱仪检测钙离子的含量和碱性磷酸酶的活力,结果表明:当加入碱性磷酸酶激活剂时,其活力升高,钙离子浓度升高;而加入抑制剂时,其活力降低,钙离子浓度相应下降;加入放线菌酮时,碱性磷酸酶和钙离子浓度开始升高,后来下降,其结果与蛋白质抑制剂的作用相一致,综合上述结果,表明三角帆蚌外套膜的碱性磷酸酶有促进钙代谢的作用.     

脂多糖对三角帆蚌酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活力的影响

对三角帆蚌注射脂多糖后,分别于6、12、24、48、72和96 h测定其血清中酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)的活力。结果显示,2种酶活力均呈先升后降的趋势,其中ACP活力在所有时间段内(6~96 h),试验组均显著高于对照组;而AKP活力在12~72 h时,试验组的AKP活力均显著高于对照组,表明脂多糖(LPS)诱导刺激对三角帆蚌血清中的ACP和AKP活力有激活增强作用。     

三角帆蚌钙调蛋白(CaM)基因的cDNA序列克隆与表达分析

[目的]研究三角帆蚌钙调蛋白(CaM)基因在育珠和非育珠蚌各组织中的表达和不同Ca2+浓度下外套膜中的表达变化。[方法]通过RACE技术,以我国重要的淡水珍珠贝——三角帆蚌为研究客体,克隆了CaM的cDNA全长,并通过Real-Time Q-PCR技术分析了该基因在育珠和非育珠蚌各组织中的表达和不同Ca2+浓度下外套膜中的表达变化。[结果]三角帆蚌CaM基因cDNA全长659bp,包括70 bp的5'UTR,299 bp的3'UTR和447 bp的ORF,编码149个氨基酸,预测其分子量为16.8 kDa,等电点为4.14。cDNA序列比对信息表明三角帆蚌与池蝶蚌、合浦珠母贝间均具有57%的相似度,而其蛋白具有高度的保守性,除斑马鱼外,各生物CaM相似率达97%。定量数据表明,CaM基因广泛表达于三角帆蚌各组织,外套膜内膜与腮中表达量显著升高(P0.05),其次是外套膜外膜和内脏团组织。插核育珠能增加该基因在各组织的表达,特别是在外套膜外膜和鳃组织中,育珠蚌该基因的表达显著高于非育珠蚌(P0.05)。此外,水体Ca2+浓度的增大对CaM基因表达有显著的影响,外套膜内膜该基因的表达随Ca2+浓度升高而增加,而外套膜外膜1.25 mmol/L Ca2+浓度下该基因的表达水平显著高于0.50 mmol/L、3.00 mmol/L组(P0.05)。[结论]为进一步深入研究钙调蛋白基因的在珍珠生长过程中的功能及其调控机理奠定了分子基础。     

铵态氮、亚硝酸盐氮对三角帆蚌免疫酶活性的影响

采用浓度为0.5,1.0,2.0,4.0 mol/L NH4-N和0.2,0.4,0.8,2.0 mg/L NO2-N的水体养殖三角帆蚌20d,分析不同浓度的NH4-N,NO2-N对三角帆蚌非特异性免疫相关酶活性的影响。结果表明:三角帆蚌肝脏中的溶菌酶(Lysozyme,LSZ)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase,ACP)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性及对NH4-N、NO2-N的敏感性均高于血淋巴中的活性和敏感性;0.5 mol/L NH4-N和0.2 mol/L NO2-N组三角帆蚌血淋巴中ACP活性均高于对照组,其余各实验处理组随着NH4-N、NO2-N浓度的升高,三角帆蚌非特异性免疫相关酶的活性明显降低。说明水体中高浓度的NH4-N和NO2-N能降低三角帆蚌的非特异性免疫活力。     

三角帆蚌IGF2基因的亚细胞定位及重组蛋白促体外细胞活性分析

胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factors 2, IGF2)在多种细胞生长、分化和合成代谢的调节中发挥重要的调控作用。本研究成功构建了淡水珍珠贝三角帆蚌IGF2的重组质粒pEGFP-IGF2和pET32a-IGF2,通过pEGFP-IGF2-细胞转染,表明该蛋白定位在细胞质与细胞核中。将pET32a-IGF2转化到BL21 (DE3)中进行蛋白诱导表达,成功得到其原核表达载体,SDS-PAGE检测显示,在约25kD处有一条清晰的条带,符合目的条带大小（26.27kD）,且主要表达于上清液中。为研究重组蛋白IGF2对三角帆蚌细胞活性的作用,本研究通过CCK8细胞活性测定,进一步探讨了添加不同浓度重组目的蛋白（0 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、7.5 μg/mL、 12.5 μg/mL、17.5 μg/mL、 22.5 μg/mL）培养的三角帆蚌外套膜细胞增殖活性。结果显示,三角帆蚌IGF2重组蛋白能显著促进三角帆蚌外套膜细胞的增殖活力（P＜0.05）,且在其浓度为12.5 μg/mL时对三角帆蚌外套膜细胞的促生长效果最佳,这为促进三角帆蚌外套膜细胞传代、细胞系建立奠定了基础,也为下一步探究IGF2在贝类中的功能提供依据。     

兔饲粮钙磷比对血清碱性磷酸酶活力的影响

 用成年家兔10只进行5期试验,喂饲不同钙、磷比例饲粮,测定血清碱性磷酸酶活力变化.结果表明:试兔碱性磷酸酶活力个体差异较大.Ca:P:6=76:1,Ca:P=0.56:1与 Ca:P=2.48:1酶活力的差异极显著.酶活力变化曲线表明,家兔血清碱性磷酸酶的活力,在其自身酶活力的基础上,调节钙、磷代谢有共同的规律.成兔随饲粮钙含量的不断增加,碱性磷酸酶活力增高,但当 Ca:P 达到6.76:1时,酶活力反而强烈下降.     

三角帆蚌人工感染细菌性疾病的组织病理学观察

从自然发病的三角帆蚌病蚌中分离出4株致病菌,人工感染健康三角帆蚌.通过组织切片和HE染色,观察由细菌性疾病引起的病蚌肝脏、肠道、闭壳肌、外套膜、鳃和斧足等组织的病理学变化.解剖观察结果显示,病蚌肠黏膜上皮细胞有不同程度的变性和坏死,肠道中空泡结构变得小而稀疏;肝脏细胞排列不整齐,细胞核深染,且细胞的连接变得松散;鳃组织糜烂,细胞排列疏松;闭壳肌纤维变得膨大;外套膜细胞大面积坏死,丧失了细胞形态;直肠和斧足的变化不明显.表明肝脏、肠道和鳃组织是三角帆蚌发病时的主要典型病变器官.     

三角帆蚌瘟病组织病理学动态变化

在人工感染三角帆蚌瘟病病料组织后第3、5、7、9、11天,运用光学显微镜和电子显微镜分别观察了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)外套膜、鳃和斧足的病理变化特征.结果表明,三角帆蚌瘟病病毒对3种器官组织有不同程度的破坏作用,外套膜和鳃的病变比较严重,斧足稍轻.光镜下,前5 d内各组织结构变化不大;从第7天开始,出现上皮组织细胞肿胀、排列紊乱、部分脱落甚至完全坏死等显著的病理变化.电镜下,前5 d细胞结构无明显病理变化,只出现了少量的病毒粒子;从第7天开始,病毒粒子数量增加,线粒体、内质网、核糖体等细胞器解体,细胞空泡化,但斧足的超微结构变化不明显.     

一种三角帆蚌肌浆网Ca2+-ATP酶基因cDNA的全长克隆与表达分析

采用RACE技术,从三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)鳃组织中成功克隆得到一种肌浆网Ca²⁺-ATP酶(sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase,SERCA)基因的全长cDNA序列,共3 326 bp,包含201-bp 5’-UTR区域、3 060-bp编码框(ORF)和65-bp 3’-UTR。ORF共编码1 019个氨基酸,预测无信号肽。该基因氨基酸序列呈现出典型的Ca²⁺-ATP酶特征,由Cation_ATPase_N、E1-E2_ATPase、Hydrolase、Cation_ATPase_C四种类型结构域组成,其内含SERCAs的常见结构组成包括磷酸化区域、异硫氰酸荧光素位点、FSBA结合位点、受磷蛋白结合区以及毒胡萝卜素位点。分析显示,该基因序列高度保守且与海洋软体动物具有最高同源性。荧光定量PCR检测,该基因在三角帆蚌外套膜、斧足、鳃、肝胰腺、性腺等5个组织中均有表达,且在鳃、外套膜、肝胰腺组织中表达较高。不同Ca²⁺浓度处理试验的结果表明,随水体中Ca²⁺浓度逐渐升高,该基因在外套膜中的表达水平呈先下降后上升趋势,并在Ca²⁺浓度为60 mg·L^-1时达到最低值,80 mg·L^-1时达到最高值。同时在60 mg·L^-1 Ca²⁺浓度条件下,外套膜中SERCA基因的表达量随时间推移先上升,并于48 h时达到最高,而后逐渐下降。上述结果为进一步深入研究SERCA基因的功能及其调控机理奠定了基础。     

不同育龄三角帆蚌血细胞吞噬率和血浆抗菌活力的比较

以2～5育龄三角帆蚌Hyriopsis cumingii为对象,研究了三角帆蚌血浆对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌、嗜水气单胞菌的抗菌活力和血细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬率。结果表明：4种育龄的育珠蚌血浆对金黄色葡萄球菌的抗菌活力最强,其次为溶壁微球菌、大肠杆菌和嗜水气单胞菌,其中3龄育珠蚌对4种细菌的抗菌活力最强;4龄育珠蚌对金黄色葡萄球菌的吞噬率最高,达到36.6%,吞噬指数达到3.75,其次为5龄育珠蚌,2龄育珠蚌对金黄色葡萄球菌的吞噬率最低,仅为25.2%,吞噬指数为2.95。本研究结果证实：在2～5育龄内,3～4育龄的三角帆蚌育珠蚌的吞噬率和抗菌活力最强,抵抗外来病原菌的能力最高;但随着育珠年龄的增长,三角帆蚌免疫能力不断下降,因而养蚌育珠过程中要加强对高龄蚌抗病防病能力的管理。