微小RNA及其介导的竞争性内源RNA调控网络在意大利蜜蜂工蜂中肠发育过程中的潜在作用

【目的】微小RNA（microRNA,miRNA）能够通过靶向结合导致mRNA的抑制或降解,从而对基因表达进行负调控。MiRNA在昆虫的生长、发育、免疫和细胞生命活动调控方面扮演关键角色。本研究旨在对意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,简称意蜂）工蜂中肠的差异表达miRNA（differentially expressed miRNA,DEmiRNA)及其调控网络进行深入分析,并结合前期在mRNA、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和环状RNA(circular RNA,circRNA)组学层面的相关研究结果,系统解析中肠发育过程的miRNA差异表达谱及竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）调控网络介导的中肠发育机理。【方法】利用small RNA-seq技术对正常的意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠（Am7和Am10）进行测序。将质控后的测序数据比对西方蜜蜂基因组,再将比对上的序列标签（tags）比对到miRBase数据库以鉴定已知miRNA。利用每百万标签序列（tags per million,TPM）算法对miRNA表达量进行计算和归一化处理。根据|log₂fold change|≥1且P≤0.05的标准筛选得到显著性DEmiRNA;利用相关软件进行靶mRNA的预测及GO和KEGG数据库注释。根据靶向结合关系及前期研究结果,利用Cytoscape软件对AMPK、PI3K-Akt、Wnt、cAMP、Hippo、mTOR、Toll/Imd、TGF-beta和MAPK 9条信号通路相关的DElncRNA/DEcircRNA-DEmiRNA-DEmRNA网络进行可视化;构建以miR-342-y为核心的ceRNA调控网络,进一步对网络中的靶mRNA进行代谢通路注释。利用茎环实时荧光定量PCR（Stem-loop RT-qPCR）验证测序数据及miRNA差异表达的可靠性。【结果】Am7 vs Am10比较组中共有112个显著性DEmiRNA,包括38个显著上调miRNA和74个显著下调miRNA,分别靶向结合7 434和9 559个mRNA,它们可注释到生物学进程相关的21和23个功能条目,细胞组分相关的16和17个功能条目,以及分子功能相关的10和11个功能条目;此外还能注释到果糖和甘露糖代谢、嘌呤代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等物质代谢相关的83和86条通路;内吞作用、泛素蛋白水解、黑色素生成等细胞免疫相关的10和10条通路;MAPK、Jak-STAT、NF-κB等体液免疫相关的5和5条通路;以及Hippo、FoxO、Notch等涉及生长发育的13和11条信号通路。进一步构建上述9条信号通路相关的ceRNA调控网络,分析发现意蜂中肠发育过程中DEmiRNA与DElncRNA、DEcircRNA和DEmRNA之间存在复杂的调控关系;DEmiRNA位于网络中心,而DElncRNA、DEcircRNA和DEmRNA位于网络的外周。miR-342-y在意蜂工蜂中肠和幼虫肠道发育过程中均为显著性下调表达,可靶向结合3个DEcircRNA、4个DElncRNA和327个mRNA。Stem-loop RT-qPCR结果显示4个DEmiRNA的差异表达趋势与测序结果一致,说明本研究中测序数据及miRNA差异表达趋势真实可靠。【结论】DEmiRNA可能通过参与调控物质和能量代谢通路、Hippo和Wnt等信号通路以及细胞和体液免疫通路相关基因的表达影响意蜂中肠的生长和发育;miR-182-x、miR-291-y、miR-342-y、ame-miR-6001-3p等关键DEmiRNA介导的ceRNA调控网络可能在意蜂中肠发育过程发挥重要的调控作用。     

意大利蜜蜂工蜂中肠发育过程中的差异表达环状RNA及其调控网络分析

【目的】环状RNA(circular RNA,circRNA)在可变剪接、转录调控和来源基因的表达调控等方面具有重要功能。本研究旨在探究意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂中肠发育过程中circRNA的表达谱及其发育过程中的差异表达circRNA(differentially expressed circRNA,DEcircRNA),进而在转录组水平探究DEcircRNA在中肠发育中的作用。【方法】基于前期获得的意蜂7和10日龄工蜂中肠样品(Am7和Am10)的全转录组数据,利用find_circ软件从质控后的数据中预测circRNA。采用RPM算法归一化处理得到circ RNA的表达量。利用DEGseq软件对circ RNA进行差异分析,按照差异倍数(fold change)≥2、P0.05及错误发现率(false discovery rate,FDR)0.05条件筛选DEcircRNA。通过BLAST比对GO和KEGG数据库,对DEcircRNA的来源基因进行功能和代谢通路注释。利用TargetFinder软件预测DEcircRNA-miRNA及DEcircRNA-miRNA-mRNA调控网络,通过Cytoscape v.3.2.1软件对调控网络进行可视化。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证测序数据的可靠性。【结果】意蜂中肠各样品比对上参考基因组的短序列读段数平均为19 616 356条。Am7与Am10的组内Pearson相关系数均≥0.950。共预测出256个DEcircRNA,包括105个上调circRNA和151个下调circRNA。Novel_circ_009675和novel_circ_013879分别在Am7和Am10中高量表达。DEcircRNA的来源基因可注释到包括结合、单组织进程及细胞进程在内的32个GO条目,其中分别有35、35和7个来源基因注释到催化活性、代谢进程和应激反应。上述来源基因还可注释到35条KEGG代谢通路,其中分别有5、5和4个来源基因注释到Hippo信号通路、内吞作用和吞噬体;进一步分析发现分别有1、2和2个来源基因注释到磷酸肌醇代谢、淀粉和蔗糖代谢和半乳糖代谢等物质代谢通路,5、4、3、1和1个来源基因注释到内吞作用、吞噬体、溶酶体、泛素介导的蛋白水解和MAPK信号通路等免疫通路。上述结果表明相应的DEcircRNA广泛参与意蜂工蜂中肠的生长发育、新陈代谢和免疫防御。DEcircRNA-miRNA调控网络分析结果显示,141个DEcirc RNA可靶向结合107个mi RNA,其中多数仅能结合1—2个mi RNA,但novel_circ_011577和novel_circ_010719结合的靶miRNA数可达32和28个;此外,mir-136-y、ame-miR-6001-3p及mir-136-y结合的circRNA数最多,分别为15、14和14个,表明相应的DEcircRNA可作为竞争性内源RNA在意蜂中肠发育过程发挥作用。进一步构建DEcircRNAs-ame-miR-6001-3p-mRNA调控网络,分析结果显示14个DEcircRNA可共同靶向结合ame-miR-6001-3p,表明它们可能通过调控ame-miR-6001-3p对意蜂中肠干细胞的分裂和分化进行间接调控。随机选取6个DEcircRNA进行RT-qPCR验证,结果显示5个DEcircRNA的表达量变化趋势与测序结果一致,证实了本研究测序结果的可靠性。【结论】通过对意蜂工蜂中肠发育过程中的DEcircRNA深入分析,提供了circRNA在意蜂工蜂中肠发育过程中的表达谱和差异表达信息,揭示了DEcircRNA在中肠发育过程中的作用,为中肠发育相关的关键circRNA的筛选和功能研究打下了基础。     

蜜蜂球囊菌菌丝和孢子中长链非编码RNA的比较及潜在功能分析

【背景】蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis,简称球囊菌）是一种专性侵染蜜蜂幼虫的真菌病原,可引起成年蜜蜂数量和蜂群群势的急剧下降。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类新近发现的非编码RNA,在表观遗传、细胞周期、剂量补偿等众多生命活动中发挥重要生物学功能。【目的】明确球囊菌菌丝和孢子中lncRNA的数量、种类和表达谱差异,并探究共有lncRNA、特有lncRNA和差异表达lncRNA（differentially expressed lncRNA,DElncRNA）在菌丝与孢子中的潜在功能。【方法】利用基于链特异性建库的lncRNA-seq技术对球囊菌的纯化菌丝（AaM）和纯化孢子（AaS）分别进行测序。根据FPKM（Fragment Per Kilobase of per Million mapped reads）法计算lncRNA在AaM和AaS中的表达水平。通过Venn分析筛选AaM与AaS的共有lncRNA和特有lncRNA。按照P≤0.05且|log₂ fold change|≥1的标准筛选AaM vs AaS比较组中的DElncRNA。通过Blast工具将共有lncRNA、特有lncRNA和DElncRNA的上下游基因比对GO和KEGG数据库,以进行功能及通路注释。根据靶向结合关系构建共有lncRNA、特有lncRNA和DElncRNA的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）调控网络并利用Cytoscape软件进行可视化。利用RT-qPCR验证测序数据的可靠性。【结果】AaM和AaS分别测得108 614 646和105 675 408条原始读段（raw reads）,经严格过滤得到107 780 032和104 621 402条有效读段（clean reads）,Q20分别为98.76%和98.72%,Q30分别达到95.84%和95.78%。共鉴定到850个lncRNA。AaM和AaS的共有lncRNA为701个,二者的特有lncRNA分别为39和110个。上述共有lncRNA通过顺式作用调控3 992个上下游基因,它们涉及细胞进程、代谢进程和催化活性等42个功能条目,以及代谢途径、次生代谢物的生物合成和抗生素的生物合成等117条通路;AaM的特有lncRNA和AaS的特有lncRNA通过顺式作用分别调控243和672个上下游基因。AaM vs AaS比较组包含的255个DElncRNA通过顺式作用调控1 479个上下游基因,它们涉及代谢进程、细胞进程和催化活性等41个功能条目,以及代谢途径、次生代谢产物的生物合成和抗生素的生物合成等107条通路。从共有lncRNA、孢子特有lncRNA和DElncRNA中分别预测到41、5和13个微小RNA（microRNA,miRNA）的前体序列。调控网络分析结果显示,菌丝lncRNA、孢子lncRNA形成较为复杂的ceRNA调控网络;菌丝lncRNA可靶向结合8个miRNA,进而调控77个mRNA;孢子lncRNA可靶向结合7个miRNA,进而调控87个mRNA;2个DElncRNA（TCONS_00008630与TCONS_00009302）可靶向结合miR-4968-y,进而调控10个mRNA。RT-qPCR验证结果显示4个DElncRNA的差异表达趋势与测序结果一致,表明测序数据真实可靠。【结论】共有lncRNA、特有lncRNA和DElncRNA可能通过调控上下游基因的表达,作为miRNA的前体,以及充当ceRNA影响菌丝和孢子的物质和能量代谢、自噬、转录、MAPK信号通路、泛素介导的蛋白水解、蛋白酶体以及次生代谢产物的生物合成等生物学过程,从而调节球囊菌的生长、发育、生殖和致病性。     

微小RNA及其介导的竞争性内源RNA调控网络在意大利蜜蜂工蜂中肠发育过程中的潜在作用

【目的】微小RNA(micro RNA,miRNA)能够通过靶向结合导致m RNA的抑制或降解,从而对基因表达进行负调控。Mi RNA在昆虫的生长、发育、免疫和细胞生命活动调控方面扮演关键角色。本研究旨在对意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂中肠的差异表达miRNA(differentially expressed miRNA,DEmiRNA)及其调控网络进行深入分析,并结合前期在m RNA、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和环状RNA(circular RNA,circ RNA)组学层面的相关研究结果,系统解析中肠发育过程的miRNA差异表达谱及竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)调控网络介导的中肠发育机理。【方法】利用small RNA-seq技术对正常的意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠(Am7和Am10)进行测序。将质控后的测序数据比对西方蜜蜂基因组,再将比对上的序列标签(tags)比对到miRBase数据库以鉴定已知miRNA。利用每百万标签序列(tags per million,TPM)算法对miRNA表达量进行计算和归一化处理。根据|log2 fold change|≥1且P≤0.05的标准筛选得到显著性DEmiRNA;利用相关软件进行靶m RNA的预测及GO和KEGG数据库注释。根据靶向结合关系及前期研究结果,利用Cytoscape软件对AMPK、PI3K-Akt、Wnt、c AMP、Hippo、m TOR、Toll/Imd、TGF-beta和MAPK 9条信号通路相关的DElnc RNA/DEcirc RNA-DEmiRNA-DEm RNA网络进行可视化;构建以miR-342-y为核心的ce RNA调控网络,进一步对网络中的靶m RNA进行代谢通路注释。利用茎环实时荧光定量PCR(Stem-loop RT-qPCR)验证测序数据及miRNA差异表达的可靠性。【结果】Am7 vs Am10比较组中共有112个显著性DEmiRNA,包括38个显著上调miRNA和74个显著下调miRNA,分别靶向结合7 434和9 559个m RNA,它们可注释到生物学进程相关的21和23个功能条目,细胞组分相关的16和17个功能条目,以及分子功能相关的10和11个功能条目;此外还能注释到果糖和甘露糖代谢、嘌呤代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等物质代谢相关的83和86条通路;内吞作用、泛素蛋白水解、黑色素生成等细胞免疫相关的10和10条通路;MAPK、Jak-STAT、NF-κB等体液免疫相关的5和5条通路;以及Hippo、Fox O、Notch等涉及生长发育的13和11条信号通路。进一步构建上述9条信号通路相关的ce RNA调控网络,分析发现意蜂中肠发育过程中DEmiRNA与DElnc RNA、DEcirc RNA和DEm RNA之间存在复杂的调控关系;DEmiRNA位于网络中心,而DElnc RNA、DEcirc RNA和DEm RNA位于网络的外周。miR-342-y在意蜂工蜂中肠和幼虫肠道发育过程中均为显著性下调表达,可靶向结合3个DEcirc RNA、4个DElnc RNA和327个m RNA。Stem-loop RT-qPCR结果显示4个DEmiRNA的差异表达趋势与测序结果一致,说明本研究中测序数据及miRNA差异表达趋势真实可靠。【结论】DEmiRNA可能通过参与调控物质和能量代谢通路、Hippo和Wnt等信号通路以及细胞和体液免疫通路相关基因的表达影响意蜂中肠的生长和发育;miR-182-x、miR-291-y、miR-342-y、ame-miR-6001-3p等关键DEmiRNA介导的ce RNA调控网络可能在意蜂中肠发育过程发挥重要的调控作用。     

东方蜜蜂微孢子虫孢子中长链非编码RNA的竞争性内源RNA调控网络及潜在功能

【背景】长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度200 nt且不具有编码能力的转录本,能够在真核生物的转录水平和转录后水平通过顺式(cis)、反式(trans)或竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)机制调控基因的表达,已被证明在生物体的生长和发育等生物学过程中发挥重要的调控作用。【目的】结合测序得到的东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)纯化孢子的small RNA(sRNA)组学数据和前期获得的lncRNA组学数据对lncRNA的调控方式进行深入细致的分析和探讨,揭示lncRNA在东方蜜蜂微孢子虫孢子中的潜在功能。【方法】利用small RNA-seq(sRNA-seq)技术对东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子进行测序,通过相关的生物信息学软件对测序数据进行质控。根据lncRNA与mRNA的位置关系预测lncRNA的上下游基因;使用Blast软件比对GO和KEGG数据库,对上下游基因进行功能和代谢通路注释;利用Target Finder软件预测lncRNA-miRNA及lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,进而通过Cytoscape v3.7.2软件对调控网络进行可视化;利用RT-PCR对调控网络中的部分lncRNA、miRNA和mRNA的表达进行验证。【结果】东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子样品的sRNA-seq分别得到16 597 883、15 451 791和12 248 316条raw reads,经质控分别得到15 608 370、14 249 255和11 440 684条clean reads,各样品的Q30≥98.58%。共预测出lncRNA的上下游基因310个,它们可注释到代谢进程、细胞进程、催化活性、结合和细胞等相关的35个功能条目;此外还可注释到56条代谢通路,涉及嘌呤代谢、碳代谢和丙酮酸代谢等物质代谢通路,以及甲烷代谢、氧化磷酸化和糖酵解/糖异生等能量代谢通路。上述结果表明相应的lncRNA可能通过cis作用调节上下游基因的表达,从而参与调控东方蜜蜂微孢子虫孢子中的物质和能量代谢以及细胞生命活动。进一步构建lncRNA-miRNA调控网络,分析结果显示MSTRG.3636.1、MSTRG.4498.1和MSTRG.4883.1可靶向结合4个miRNA(nce-miR-7729、nce-miR-7502、nce-miR-8639和nce-miR-8565),说明此3个lncRNA可作为ceRNA在东方蜜蜂微孢子虫孢子中发挥潜在作用。LncRNA-miRNA-mRNA调控网络分析结果显示,三者之间形成较为复杂的调控网络关系,miRNA处于调控网络的中心并联系lncRNA和mRNA,nce-miR-7502和nce-miR-8639结合的mRNA最多,达到28个;与MSTRG.3636.1、MSTRG.4498.1和MSTRG.4883.1存在靶向关系的miRNA结合多个mRNA,表明上述3个lncRNA可能通过ceRNA机制发挥作用,从而影响东方蜜蜂微孢子虫孢子中的新陈代谢和生命活动。【结论】lncRNA可能通过cis作用调控上下游基因的表达,以及作为ceRNA通过吸附miRNA间接影响靶基因的表达,从而参与调节东方蜜蜂微孢子虫孢子中的物质和能量代谢等基本生命活动。     

蜜蜂球囊菌中长链非编码RNA的调控作用

【目的】长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类二、三级结构高度保守,长度>200 nt且不具蛋白编码能力的RNA,在转录和转录后水平广泛参与调控剂量补偿、细胞分化和生长发育等生命活动。本研究基于前期获得的蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis,简称球囊菌）菌丝和孢子混合样品的高质量lncRNA组学数据进行球囊菌lncRNA的顺式（cis）作用、反义lncRNA（antisense lncRNA）作用和竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）作用的分析和探讨,以期揭示lncRNA在球囊菌中的潜在功能。【方法】基于lncRNA基因在染色体上的位置,预测lncRNA上下游100 kb以内的蛋白编码基因;使用Blast软件将上下游基因比对到GO和KEGG数据库,以获得功能和通路注释。利用LncTar软件对反义lncRNA的靶mRNA进行预测,并使用Blast软件将上述靶mRNA比对到KEGG和eggNOG数据库。利用TargetFinder软件预测lncRNA靶向结合的miRNA及miRNA靶向结合的mRNA,根据靶向结合关系建立lncRNA-miRNA和lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,进而通过Cytoscape v3.7.1软件进行调控网络的可视化。利用RT-PCR对调控网络中的lncRNA、靶miRNA和靶mRNA进行表达验证。【结果】共预测出371个lncRNA的5 852个上下游基因,可注释到细胞进程、代谢进程和应激反应等48个功能条目,以及新陈代谢途径、次生代谢产物的生物合成和抗生素的生物合成等121条通路,表明部分lncRNA可通过顺式作用调节上下游基因的表达,从而参与调控球囊菌的生长发育及物质能量代谢等基础生命活动。球囊菌的7个lncRNA与7个靶mRNA存在序列互补关系,其中5个mRNA在eggNOG数据库中仅注释为假定蛋白,仅gene3444在KEGG数据库注释为核孔复合体蛋白An-Nup120和假定蛋白,表明上述1个反义lncRNA可能参与调控核孔复合体蛋白的生物合成等生物学过程。此外,共预测出227个lncRNA与73个miRNA之间存在靶向结合关系,其中多数lncRNA(79.02%)仅能结合1—2个miRNA,部分miRNA可被多个lncRNA靶向结合;进一步构建氧化磷酸化通路和MAPK信号通路相关的lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,分析结果显示氧化磷酸化通路相关的222个lncRNA靶向78个miRNA及50个mRNA,MAPK信号通路相关的222个lncRNA靶向76个miRNA及46个mRNA,表明部分lncRNA通过ceRNA作用调控此两条通路,从而影响球囊菌的能量合成、环境适应以及生长发育等过程。【结论】部分lncRNA可能通过顺式作用和ceRNA作用调节球囊菌的生长发育、物质能量代谢以及环境适应等生物学过程;MSTRG.5393.1可能作为反义lncRNA调控球囊菌的核孔复合体的蛋白合成。     

东方蜜蜂微孢子虫孢子中长链非编码RNA的竞争性内源RNA调控网络及潜在功能

【背景】 长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度>200 nt且不具有编码能力的转录本,能够在真核生物的转录水平和转录后水平通过顺式（cis）、反式（trans）或竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）机制调控基因的表达,已被证明在生物体的生长和发育等生物学过程中发挥重要的调控作用。【目的】 结合测序得到的东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）纯化孢子的small RNA（sRNA）组学数据和前期获得的lncRNA组学数据对lncRNA的调控方式进行深入细致的分析和探讨,揭示lncRNA在东方蜜蜂微孢子虫孢子中的潜在功能。【方法】 利用small RNA-seq（sRNA-seq）技术对东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子进行测序,通过相关的生物信息学软件对测序数据进行质控。根据lncRNA与mRNA的位置关系预测lncRNA的上下游基因;使用Blast软件比对GO和KEGG数据库,对上下游基因进行功能和代谢通路注释;利用Target Finder软件预测lncRNA-miRNA及lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,进而通过Cytoscape v3.7.2软件对调控网络进行可视化;利用RT-PCR对调控网络中的部分lncRNA、miRNA和mRNA的表达进行验证。【结果】 东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子样品的sRNA-seq分别得到16 597 883、15 451 791和12 248 316条raw reads,经质控分别得到15 608 370、14 249 255和11 440 684条clean reads,各样品的Q30≥98.58%。共预测出lncRNA的上下游基因310个,它们可注释到代谢进程、细胞进程、催化活性、结合和细胞等相关的35个功能条目;此外还可注释到56条代谢通路,涉及嘌呤代谢、碳代谢和丙酮酸代谢等物质代谢通路,以及甲烷代谢、氧化磷酸化和糖酵解/糖异生等能量代谢通路。上述结果表明相应的lncRNA可能通过cis作用调节上下游基因的表达,从而参与调控东方蜜蜂微孢子虫孢子中的物质和能量代谢以及细胞生命活动。进一步构建lncRNA-miRNA调控网络,分析结果显示MSTRG.3636.1、MSTRG.4498.1和MSTRG.4883.1可靶向结合4个miRNA（nce-miR-7729、nce-miR-7502、nce-miR-8639和nce-miR-8565）,说明此3个lncRNA可作为ceRNA在东方蜜蜂微孢子虫孢子中发挥潜在作用。LncRNA-miRNA-mRNA调控网络分析结果显示,三者之间形成较为复杂的调控网络关系,miRNA处于调控网络的中心并联系lncRNA和mRNA,nce-miR-7502和nce-miR-8639结合的mRNA最多,达到28个;与MSTRG.3636.1、MSTRG.4498.1和MSTRG.4883.1存在靶向关系的miRNA结合多个mRNA,表明上述3个lncRNA可能通过ceRNA机制发挥作用,从而影响东方蜜蜂微孢子虫孢子中的新陈代谢和生命活动。【结论】 lncRNA可能通过cis作用调控上下游基因的表达,以及作为ceRNA通过吸附miRNA间接影响靶基因的表达,从而参与调节东方蜜蜂微孢子虫孢子中的物质和能量代谢等基本生命活动。     

不同温度下TMV侵染枯斑三生烟的LncRNA差异表达

【目的】筛选不同温度下烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染后枯斑三生烟(Nicotiana tabacum var. Samsun NN)差异表达的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA),研究lncRNA在枯斑三生烟抗性反应中的作用。【方法】N基因的温度敏感性使枯斑三生烟在25℃时具备对TMV的抗性、在31℃抗性丧失,在这两个温度条件下对枯斑三生烟接种TMV和磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline,PBS),48 h后提取系统叶总RNA,构建链特异性文库后进行深度测序。对测序结果进行过滤后利用HTSeq将有效数据与近缘品种TN90(N. tabacum var. TN90)基因组比对,筛选得到lncRNA后利用FPKM法估计lncRNA的表达水平。通过edgeR筛选差异表达lncRNA(differentially expressed lncRNA,DElncRNA),并利用qRT-PCR技术对这一结果进行验证。通过共定位及共表达分析预测DElncRNA的靶基因,通过参考基因组注释、GO和KEGG富集分析研究靶基因的功能。【结果】4个处理共12个样本经lncRNA-seq各测得约8 000万条clean reads,共获得4 737条已知lncRNA、40 169条新lncRNA。其中64个lncRNA在不同温度条件下TMV侵染后存在差异表达,qRT-PCR测定结果显示这些lncRNA的测序正确率在80%左右,表明本研究所得测序数据具备较高的可信度。对DElncRNA进行靶基因预测,发现一些基因同时被25℃下调和31℃上调的DElncRNA靶向。靶基因注释功能丰富,主要参与植物抗病、激素和代谢等生理过程。部分可能与激素通路相关的lncRNA,在25℃下TMV侵染时呈现下调趋势,而在31℃下TMV侵染则呈现上调趋势。GO富集分析显示靶基因主要参与构成膜、囊泡等组分,具备钙、钾离子通道抑制剂活性等分子功能,使相应离子得以转运引发随后的反应,同时也参与发病、抗原加工和呈现、细胞分裂素代谢等生理过程。KEGG分析发现靶基因显著富集在植物激素信号转导通路,25℃下调和31℃上调的DElncRNA靶基因同时富集在激素信号传导、ABC运输蛋白、苯丙烷类生物合成等通路。【结论】不同温度(25℃和31℃)条件下TMV侵染枯斑三生烟后,长链非编码RNA差异表达,DElncRNA通过作用于激素信号传导、物质转运等过程参与寄主系统获得性抗性反应。研究结果可为揭示植物系统获得性抗性中lncRNA的调控功能以及新型抗病毒技术开发提供依据。     

意大利蜜蜂响应东方蜜蜂微孢子虫胁迫的免疫应答

【目的】通过对意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,简称意蜂）工蜂中肠响应东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）胁迫的差异表达基因（differentially expressed gene,DEG）及免疫通路进行深入细致的分析,揭示宿主的细胞和体液免疫应答,为关键免疫应答基因的筛选及功能研究打下基础。【方法】基于前期获得的正常及东方蜜蜂微孢子虫胁迫的意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠（Am7CK、Am7T、Am10CK、Am10T）转录组数据,按照FDR≤1,P≤0.05和|log₂ fold change|≥1的标准筛选出各组的DEG,利用相关生物信息学软件对DEG进行Pearson相关性分析、Venn分析、GO分类和KEGG代谢通路富集分析,进而对免疫通路富集基因进行统计和分析,利用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）验证转录组数据的可靠性。【结果】 差异分析结果显示,Am7CK vs Am7T比较组包含472个上调基因和385个下调基因;Am10CK vs Am10T比较组包含611个上调基因和360个下调基因。Venn分析结果显示,两个比较组特有的DEG分别为739和853个,共有的DEG为118个。GO分类结果显示,Am7CK vs Am7T比较组中上调和下调基因分别涉及23和29个功能条目,其中富集上调基因数最多的前5位分别为结合、催化活性、代谢进程、细胞进程和单组织进程;富集下调基因数最多的前5位分别为代谢进程、单组织进程、催化活性、细胞进程和结合。Am10CK vs Am10T比较组中上调和下调基因分别涉及36和26个功能条目,其中富集上调基因数最多的前5位分别为单组织进程、结合、细胞进程、催化活性和代谢活性;富集下调基因数最多的前5位分别为结合、细胞进程、催化活性、代谢进程和单组织进程。KEGG代谢通路富集分析结果显示,Am7CK vs Am7T比较组中上调和下调基因分别富集在38和33条代谢通路,富集上调基因数最多的前5条分别为胆汁分泌、内质网蛋白加工、泛素介导的蛋白水解、PI3K-Akt信号通路和神经营养因子信号通路;富集下调基因数最多的前5条分别为胞质DNA传感通路、嘌呤代谢、嘧啶代谢、RNA聚合酶和核糖体;涉及泛素介导的蛋白水解等3条细胞免疫通路,以及PI3K-Akt信号通路等7条体液免疫通路。Am10CK vs Am10T比较组中上调和下调基因分别富集在54和43条代谢通路,富集上调基因数最多的前5条分别为Hippo信号通路、药物代谢-细胞色素P450、P450对外源物质的代谢、泛素介导的蛋白水解和鞘脂类代谢;富集下调基因数最多的前5条分别为mRNA监测、鞘脂类信号通路、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢和鞘脂类代谢;涉及泛素介导的蛋白水解等7条细胞免疫通路,以及NF-κB信号通路等2条体液免疫通路。RT-qPCR验证结果显示6个随机挑选的DEG的表达量变化趋势与测序结果一致,证实了本研究中测序数据的可靠性。进一步分析发现意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠的NF-κB信号通路均被东方蜜蜂微孢子虫激活,随即启动了3种抗菌肽apidaecin、defensin-1和hymenoptaecin的合成,体现了它们在宿主抵御东方蜜蜂微孢子虫入侵中的重要性。【结论】在转录组水平解析了意蜂工蜂中肠对东方蜜蜂微孢子虫的免疫应答,揭示宿主在胁迫前期同时作出细胞和体液免疫应答,前者可能在抵御病原入侵方面发挥主要作用;宿主的细胞免疫在胁迫后期持续增强,但体液免疫较大程度地减弱;泛素介导的蛋白水解通路及富集DEG,NF-κB信号通路及富集DEG,以及抗菌肽编码基因apidaecin、defensin-1和hymenoptaecin可能在意蜂工蜂对东方蜜蜂微孢子虫的免疫应答中起到关键作用。     

不同温度下TMV侵染枯斑三生烟的LncRNA差异表达

【目的】 筛选不同温度下烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）侵染后枯斑三生烟（Nicotiana tabacum var. Samsun NN）差异表达的长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）,研究lncRNA在枯斑三生烟抗性反应中的作用。【方法】 N基因的温度敏感性使枯斑三生烟在25℃时具备对TMV的抗性、在31℃抗性丧失,在这两个温度条件下对枯斑三生烟接种TMV和磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline,PBS）,48 h后提取系统叶总RNA,构建链特异性文库后进行深度测序。对测序结果进行过滤后利用HTSeq将有效数据与近缘品种TN90（N. tabacum var. TN90）基因组比对,筛选得到lncRNA后利用FPKM法估计lncRNA的表达水平。通过edgeR筛选差异表达lncRNA（differentially expressed lncRNA,DElncRNA）,并利用qRT-PCR技术对这一结果进行验证。通过共定位及共表达分析预测DElncRNA的靶基因,通过参考基因组注释、GO和KEGG富集分析研究靶基因的功能。【结果】 4个处理共12个样本经lncRNA-seq各测得约8 000万条clean reads,共获得4 737条已知lncRNA、40 169条新lncRNA。其中64个lncRNA在不同温度条件下TMV侵染后存在差异表达,qRT-PCR测定结果显示这些lncRNA的测序正确率在80%左右,表明本研究所得测序数据具备较高的可信度。对DElncRNA进行靶基因预测,发现一些基因同时被25℃下调和31℃上调的DElncRNA靶向。靶基因注释功能丰富,主要参与植物抗病、激素和代谢等生理过程。部分可能与激素通路相关的lncRNA,在25℃下TMV侵染时呈现下调趋势,而在31℃下TMV侵染则呈现上调趋势。GO富集分析显示靶基因主要参与构成膜、囊泡等组分,具备钙、钾离子通道抑制剂活性等分子功能,使相应离子得以转运引发随后的反应,同时也参与发病、抗原加工和呈现、细胞分裂素代谢等生理过程。KEGG分析发现靶基因显著富集在植物激素信号转导通路,25℃下调和31℃上调的DElncRNA靶基因同时富集在激素信号传导、ABC运输蛋白、苯丙烷类生物合成等通路。【结论】 不同温度（25℃和31℃）条件下TMV侵染枯斑三生烟后,长链非编码RNA差异表达,DElncRNA通过作用于激素信号传导、物质转运等过程参与寄主系统获得性抗性反应。研究结果可为揭示植物系统获得性抗性中lncRNA的调控功能以及新型抗病毒技术开发提供依据。     

中华蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌早期胁迫的转录组学

【目的】白垩病是困扰养蜂生产的顽疾。目前,尚无利用二代测序技术研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫白垩病的报道。本研究利用RNA-seq技术对健康(Ac CK)及球囊菌(Ascosphaera apis)胁迫的中蜂4日龄幼虫肠道(Ac T)进行深度测序,在转录组水平研究中蜂幼虫在球囊菌胁迫早期的胁迫应答。【方法】通过Illumina Hi Seq 2500平台对Ac CK和Ac T进行双端(PE125)测序,首先对测序数据进行质控和评估,利用edge R软件进行差异表达基因(DEG)分析,进而对DEGs进行GO富集分析及KEGG代谢通路富集分析,最后,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证测序数据的可靠性。【结果】Ac CK和Ac T的转录组测序共得到188 457 338条原始读段(raw reads),经过滤得到182 088 448条有效读段(clean reads),两端Q20与Q30均在97.96%和94.97%以上,说明测序数据质量良好;主成分分析(PCA)结果显示第一与第二主成分可分别解释基因表达总体差异的75.8%和10.7%;DEG分析结果显示上调基因与下调基因的数量分别为344和239个;GO富集分析结果显示DEGs共富集在36个GO分类(term)上,其中基因富集数最多的细胞(106 unigenes)、细胞组件(106 unigenes)和代谢进程(104 unigenes);KEGG代谢通路富集分析结果显示上调与下调基因分别富集在72个和45个代谢通路上,其中上调基因富集数最多的是核糖体(72 unigenes)、碳代谢(16 unigenes)和糖酵解(14 unigenes),而下调基因富集数最多的是碳代谢(9 unigenes)、二羧酸代谢(8 unigenes)和氨基酸生物合成(7 unigenes),进一步分析表明中蜂幼虫肠道的部分细胞免疫对球囊菌的胁迫产生应答,而体液免疫不产生应答,宿主的代谢相关基因受到球囊菌的显著抑制。【结论】揭示了中蜂幼虫在球囊菌入侵早期的胁迫应答,为深入解析中蜂幼虫的胁迫应答机制提供了重要信息,也为在分子水平研究关键应答基因打下了基础。     

意大利蜜蜂幼虫肠道在球囊菌侵染前期的 差异表达microRNA及其调控网络

【目的】 微小RNA（microRNA,miRNA）是一类重要的基因表达调控因子,可影响宿主与病原间的互作过程。蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）是一种特异性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原。本研究旨在对意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,简称意蜂）幼虫肠道在球囊菌胁迫前期的差异表达miRNA（differentially expressed miRNA,DEmiRNA）及其靶基因进行深入分析,在miRNA组学水平探究意蜂幼虫在球囊菌侵染前期的胁迫应答,并通过构建显著DEmiRNA的调控网络筛选出与宿主应答相关的关键miRNA。【方法】 利用small RNA-seq（sRNA-seq）技术对正常及球囊菌侵染的意蜂4日龄幼虫肠道（AmCK和AmT）进行高通量测序,首先对原始数据进行质控和评估,随后将过滤后的数据与西方蜜蜂（Apis mellifera）参考基因组进行比对;将比对上的序列标签（tags）注释到miRBase数据库,得出已知miRNA的表达量;通过TPM（tags per million）算法对各样本中miRNA的表达量进行归一化处理,以|log₂ fold change|≥1且P≤0.05作为标准筛选得到显著DEmiRNA;利用TargetFinder 软件预测显著DEmiRNA的靶基因,并对其进行GO和KEGG代谢通路（pathway）富集分析。利用Cytoscape软件对miRNA-mRNA调控网络进行可视化。最后,利用茎环反转录PCR（Stem-loop RT-PCR）和荧光定量PCR（qPCR）验证测序数据的可靠性。【结果】 AmCK和AmT样品的测序分别得到13 553 302和10 777 534条原始读段（raw reads）,经严格过滤后得到的有效读段（clean reads）数分别为13 186 921和10 480 913条。各样品的生物学重复间的Pearson相关性系数分别在0.9822和0.9508以上。共有10个显著DEmiRNA,包括4个上调miRNA和6个下调miRNA。显著DEmiRNA在AmT的整体表达水平低于AmCK。10个显著DEmiRNA可靶向结合3 788个靶基因,其中上调miRNA的1 240个靶基因可注释到GO数据库中的39个GO条目,主要富集在结合、细胞进程、代谢进程和应激反应等;下调miRNA的749个靶基因可注释到34个GO条目,主要富集在细胞进程、结合、代谢进程和应激反应等。KEGG数据库注释结果显示,上调miRNA和下调miRNA的靶基因分别注释到95和66条代谢通路,富集基因数最多的分别是Wnt信号通路、Hippo信号通路、光传导以及内吞作用、磷脂酰肌醇信号系统、嘌呤代谢。对于上调和下调miRNA,分别有31和52个靶基因注释到内吞作用,15和7个靶基因注释到泛素介导的蛋白水解,11和5个靶基因注释到Jak-STAT信号通路,1和3个靶基因注释到MAPK信号通路。显著DEmiRNA与靶mRNA之间形成复杂的调控网络,7个显著DEmiRNA靶向结合96个与Wnt信号通路相关的mRNA,8个显著DEmiRNA靶向结合55个与内吞作用相关的mRNA。Stem-loop RT-PCR和qPCR结果验证了测序数据的可靠性。【结论】 对意蜂幼虫肠道在球囊菌侵染前期的DEmiRNA及其靶基因进行预测和分析,并构建和分析了DEmiRNA-mRNA调控网络,研究结果提供了宿主miRNA的表达谱和差异表达信息,揭示了DEmiRNA通过调控细胞生命活动、新陈代谢以及部分细胞和体液免疫等生物学过程参与宿主的胁迫应答。miR-4331-y、miR-4968-y、miR-8440-y、novel-m0023-5p和novel-m0025-3p共同参与了宿主的Wnt信号通路和内吞作用的调控,可作为白垩病治疗的潜在分子靶标。