高产纤溶酶蛹虫草菌株的诱变育种

蛹虫草中含有多种生理活性物质,是中国名贵中药材之一。前期试验发现其发酵液中含有纤溶酶,具有开发成一种新型溶栓药物的价值。以试验室保存的8株蛹虫草为试验菌株,以纤溶酶酶活为指标,进行液体深层培养,确定以C-5作为诱变出发菌株,对其进行原生质体紫外诱变处理,筛选得到31株抗制霉素突变株,抗性菌株以纤溶酶酶活为指标进行液体深层发酵,得到8株纤溶酶产量高于出发菌株15.00%以上的突变株,并从中筛选出3株遗传稳定性良好的正突变株CY-8,CY-18,CY-25,其纤溶酶产量分别比出发菌株提高了28.58%,28.22%,21.78%。     

产胞外淀粉酶枯草芽孢杆菌的分离筛选及其紫外诱变育种

为提高枯草芽孢杆菌产生淀粉酶能力,从养虾池、混养池及污染河流的底质活性污泥中分离到12株枯草芽孢杆菌,通过淀粉降解试验筛选到产酶能力较高的菌株H4和H5,菌株淀粉酶活性分别为38.66,37.10 U/mL.以筛选到H4和H5为原始菌株,采用紫外诱变的方法对H4和H5进行连续诱变筛选产淀粉酶高的突变株.结果发现,第一次诱变后突变株的酶活分别为原始菌株的107%和111%;经过第二次诱变后,H4的突变株H4 Ⅱa,H5的突变株H5Ⅱa和H5Ⅱb的产酶能力有很大程度的提高,分别为原始菌株的147%,136%和135%,酶活达56.95,50.47和50.02 U/mL,说明紫外连续诱变有利于突变株产酶能力的提高.     

原生质体诱变选育高纤维素酶活性枯草芽孢杆菌的研究

采用紫外诱变、化学诱变(DES诱变)及复合诱变的方法对产纤维素酶枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B6的原生质体进行诱变,选育出10个高纤维酶活突变株.摇瓶发酵试验结果表明,所选突变株酶活都显著高于B6,其中,紫外诱变处理的突变株Z12,化学诱变得到的突变株H1以及复合诱变处理的突变株F12的产酶能力相对较强,且产酶能力稳定,酶活值分别为448.3,450.9,491.8 U/mL,分别为对照的176%,178%,194%.试验结果说明,对枯草芽孢杆菌的原生质进行诱变可以提高菌株产纤维素酶的能力,而原生质体的复合诱变可提高诱变效应.     

紫外线诱变选育高产纳豆激酶菌株的研究

为了获得一株产纳豆激酶(NK)活力较强的菌株。以纳豆激酶活力为评价指标,采用紫外线诱变育种的方法和单因素实验方法,确定紫外线诱变剂量,对原始菌株进行诱变育种,并采用纤维蛋白平板法,测定菌株发酵的纳豆激酶活力。试验结果表明,20W紫外灯距离30cm照射240s的诱变,效果较佳。经过诱变及菌种筛选所获得的高产菌株U-5发酵生产的纳豆激酶活力比原始菌株T-3提高了8.81%。经15代传代试验,U-5高效突变株生产的纳豆激酶活力均稳定在5440.37IU/mL以上。     

产碱性蛋白酶菌株的筛选与诱变育种

为获得性状稳定、高产的碱性蛋白酶菌株,采用平板诱变法对产碱性蛋白酶菌株进行诱变处理。结果表明,采用牛奶平板法及Folin测酶活法从鸡粪土样获得产碱性蛋白酶出发菌株。该菌株经亚硝基胍(NTG)诱变并利用利福平抗性株筛选获得蛋白酶活力为出发菌株34,65倍的2个变异株。因此,利用亚硝基胍作为诱变剂可产生高产酶菌株。     

高产纤维素酶菌株筛选及诱变选育

为了得到高产纤维素酶的菌株,达到缓解纤维素酶活不高、纤维素酶供不应求现状的目的。从自然界中筛选出较优良的产纤维素酶菌株并对其进行紫外、60Co-γ射线诱变选育获得高产纤维素酶活的突变株。从自然界筛选出来的菌株通过菌落、菌丝体以及孢子丝的形态初步鉴定为放线菌并命名为XZ-33。对XZ-33进行复合诱变选育并根据致死率和诱变剂量以及正突变率的相互关系,得出合适的诱变剂量即：紫外照射7 min,辐照剂量为0.6 KGy的γ射线对产纤维素酶的出发菌进行诱变,得到高产纤维素酶的突变株UV-Co16,其CMCase酶活达到66.15 IU/mL,以及PFAase酶活2.91 IU/mL,分别是出发菌的3.17倍和2.42倍。该突变株的获得为微生物发酵生产乙醇奠定了基础。     

高产核酸酶菌株的分离、筛选与诱变育种

为获得具有自主知识产权,满足生产需求的高产核酸酶P1的菌株。以2%RNA作为唯一碳、氮源的筛选培养基,从桔园土壤中初步筛选出65株具有产生核酸酶P1的菌株。结果表明：以其中酶活较高的YC34号菌株为出发菌株,该菌株的初始酶活性为127.3 U/mL,通过紫外诱变、微波诱变、LiCl诱变3种方式依次进行复合诱变处理后,获得酶活最高的突变株YC34-1,其粗发酵液的酶活达到360.7 U/mL,较原始出发菌株酶活增长了183.3%,具有良好的应用开发潜力。经初步形态学鉴定该菌株可归属为青霉属柑桔青霉(Penicillium citrinum)。     

发酵木糖高产乙醇酵母菌株的选育

筛选获得的季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)为出发菌株,采用紫外线和亚硝基胍(NTG)复合诱变,筛选高产乙醇突变株。结果表明,紫外诱变菌最佳稀释度为1×10-5,最佳照射时间为25 s;NTG诱变菌最佳稀释度为1×10-6,最佳诱变时间为40 min,经3轮紫外和亚硝基胍(NTG)交替诱变,获得高产乙醇突变株C3-10,其乙醇产量最高为13.2%,比原菌乙醇产量增加了8.05%,5次传代表现出较好的遗传稳定性。     

高产蛋白酶的纳豆杆菌菌种选育

以纳豆杆菌为出发菌株,进行紫外诱变,采用玉米蛋白粉为底物的平板分离法初筛及摇瓶发酵玉米蛋白粉复筛的筛选策略,以复筛发酵物中可溶性蛋白含量和抗氧化活力为指标进行筛选。结果表明,菌悬液在照射时间180 s,菌浓度为1×105个/mL下,突变株的浓醪玉米蛋白粉发酵液的可溶性蛋白质量浓度为(12.74±0.12)mg/mL,抗氧化活力达到(725.70±13.23)U/mL,突变株遗传性能稳定。     

一株对番茄枯萎病有拮抗作用的枯草芽孢杆菌的ARTP诱变与筛选

旨在利用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术获得番茄枯萎病高效拮抗突变株。以一株对番茄枯萎病有拮抗作用的枯草芽孢杆菌N为初始菌株进行诱变处理,通过检测抑菌圈进行突变株筛选,并通过盆栽实验初步研究防效。通过拮抗带筛选以及抑菌圈复筛选出5株正突变菌株,其中正突变幅度最高的菌株为62,较初始菌株的抑菌圈直径提高了31.43%。经过6次传代,证实该突变株具有良好的遗传稳定性。盆栽实验表明,突变株62对于番茄枯萎病的防效达到75.76%。通过ARTP诱变获得的突变株稳定性好、拮抗效果提高明显,在防治番茄枯萎病方面有很好的应用前景。     

紫外诱变香菇条件的初步筛选

本研究的目的是通过利用紫外线照射香菇菌株808的孢子悬浮液,分析诱变处理的致死率、菌株的菌丝生长速率、诱变菌株与原菌株的拮抗反应初步筛选出突变香菇菌株,并筛选出适合香菇孢子的紫外诱变条件。结果表明,诱变时间在20 s的致死率为14.28%,40 s的致死率为28.57%,60 s致死率为64.29%,80 s的致死率为85.71%。在紫外诱变处理60 s和80 s的菌株与对照组有明显的拮抗现象,总共得到了5个有拮抗现象的突变菌株。诱变时间为60 s时菌株生长速度(2.37 cm/d)及拮抗强度均高于诱变时间为80 s (2.23 cm/d)的处理组。试验初步证明使用紫外诱变香菇孢子时的最佳时长为60 s。这为香菇诱变育种提供一定的技术依据。     

脉孢霉纤溶酶体外抗凝与溶栓作用初步研究

使用实验室制备的脉孢霉纤溶酶组分Ⅱ和组分Ⅲ冻干粉(均达到电泳纯),进行体外血凝块溶解试验、抗凝血实验和对小鼠一般行为的影响和毒理性试验,对不同组分的溶栓、抗凝及毒理效果进行初步研究。体外抗凝试验表明,脉孢霉纤溶酶粗酶液、组分Ⅱ、组分Ⅱ+Ⅲ具有明显的抗凝血作用,其抗凝血效果明显优于尿激酶。体外溶栓试验表明,脉孢霉粗酶液和各组分对血栓的溶解率均高于80%,明显优于对照组;脉孢霉纤溶酶粗酶液、组分Ⅱ、组分Ⅲ和组分Ⅱ+Ⅲ组溶解血栓后的液体中的红细胞分散程度较好,形态完整,尿激酶组血细胞凝集成块状,说明脉孢霉纤溶酶对细胞的损伤小,可以维持细胞的完整形态和功能,其血栓溶解效果要优于尿激酶。小鼠皮下注射试验显示脉孢霉纤溶酶无出血活性。急性毒理试验显示脉孢霉纤溶酶无明显的急性毒性,对小鼠的一般行为和协调运动无影响。     

禽流感病毒H9亚型HN31株NS基因

为克隆和分析禽流感病毒（H9亚型）HN31株的NS基因的分子特征,通过RT-PCR方法扩增其NS基因,PCR产物与载体pMD19-T Vector连接,转化大肠杆菌DH5α,经蓝白斑筛选,调取阳性菌落,摇菌过夜,提取质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定,送阳性重组质粒测序。结果显示RT-PCR产物大小为919 bp,HN31株的NS基因长度为890 bp;其与H6、H9亚型的A型流感病毒的亲缘关系比H5、H7、H3、H1亚型流感病毒更近。     

外源添加乙偶姻对酿酒酵母产2,3-丁二醇及其菌株的影响

通过对菌株发酵特性的研究,旨在获得一株性能良好的2,3-丁二醇(2,3-BD)生产菌株。本研究以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W5/W5-$\Delta$pdc1/W5-$\Delta$pdc5/W141四株菌株为试材,利用高效液相色谱法(HPLC)对乙偶姻产量和BDH酶活进行检测,从而挑选出最适合作为产2,3-BD出发菌株,并外源添加不同浓度的乙偶姻,测定乙偶姻、葡萄糖和2,3-BD产量随发酵时间的变化情况。结果表明：S. cerevisiae W5与S. cerevisiae W141最适合作为产2,3-BD出发菌株,且S. cerevisiae W5最适添加量为12 g/L乙偶姻,且72 h时,2,3-BD的产量最大达到2.49 ± 0.02 g/L;S. cerevisiae W141最适添加量为8 g/L乙偶姻,且72 h时,2,3-BD的产量最大达到1.56 ± 0.04 g/L,外源添加乙偶姻后菌株生长状况良好,并且二者产生的乙偶姻在发酵结束前消耗完全,同时在24 h左右,二者产生的葡萄糖也均基本耗尽。这为研究和利用2,3-BD等可再生资源提供了思路,也为利用S. cerevisiae生产2,3-BD奠定了理论基础。     

新城疫病毒La Sota株HN基因的克隆与序列分析

旨在从分子生物学角度进一步研究新城疫病毒La Sota株HN基因,探究NDV La Sota HN基因的遗传变异情况。研究以试验室冻存的p NDV-HN为模版,根据Gen Bank中登录的NDV La Sota株序列设计引物扩增HN基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行鉴定,对鉴定正确的重组质粒p MD-NDV-HN进行测序分析。应用生物信息学软件对新城疫病毒Lasota株HN基因进行系统进化树分析、氨基酸序列同源性分析、糖基化位点、蛋白结构跨膜区分析及磷酸化位点预测分析。核苷酸序列测定结果表明:HN基因的序列长度为1743bp,该基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)总长为1716 bp,编码571个氨基酸。生物信息学表明:试验获得的HN基因具有6个潜在糖基化位点及12个半胱氨酸残基,第5个潜在糖基化位点(508-510 aa)发生缺失及第123位半胱氨酸残基被色氨酸残基取代。La Sota株HN基因编码的蛋白质中有29个丝氨酸、10个酪氨酸和16个苏氨酸可能成为蛋白激酶磷酸化位点。将试验获得的La Sota株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫毒株的HN基因相应序列比较后发现,它们的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高均可达到99%,表明HN基因在种属间具有较高的保守性。研究为新城疫病毒的分子病毒学研究奠定了基础。     

水稻窄叶突变体nal7(t)的遗传分析与基因定位

本研究以恢复系缙恢10号为试验材料,经过EMS诱变,对水稻叶突变进行了研究。结果表明,群体中发现一个窄叶突变体,表现为叶片变窄、节间变细、结实率降低等一系列突变表型。成熟期的功能叶片宽度为野生型的74.69%,倒一、二、三节的宽度分别为野生型的45.10%、57.38%、74.63%,总叶脉数为野生型的67.36%。遗传分析表明该突变性状受一对隐性核基因控制,利用SSR标记将其定位在第3染色体长臂RM14379和RM14427之间,遗传距离分别为2.1cM和3.0cM。因与nal7位于相同的染色体区段,暂命名为nal7(t)。     

细菌发酵产L-乳酸优良菌株的选育

对干酪乳杆菌CICC6002进行紫外诱变和硫酸二乙酯—超声波复合诱变处理,将诱变所得菌株进行耐酸和耐高糖驯化和选育,筛选得到一株高产L-乳酸的正向突变NT-7,在以菜籽饼粕水解液为氮源的培养基中发酵72h,L-乳酸产量88g/L,较出发菌株提高了41.94%。