硬粒小麦Glu-B3基因家族新成员的克隆及其分子标记的开发

获得小麦低分子量谷蛋白基因家族新成员, 为深入研究该基因家族的组成及其在染色体上的分布与进化奠定基础。本研究根据已发表的小麦低分子量麦谷蛋白基因序列设计了1对简并引物, 以从硬粒小麦品种Langdon BAC文库中筛选的携带小麦低分子量谷蛋白基因的BAC为模板, 利用同源序列克隆技术克隆了1个MET类型的小麦低分子量谷蛋白基因LMWLDN-M, 该基因编码350个氨基酸。利用LMWLDN-M与本实验室克隆的Langdon品种其他类型的小麦低分子量谷蛋白基因之间的SNP, 设计了该类型基因特异的引物。以Langdon代换系和中国春小麦缺体-四体为模板进行PCR扩增, 将该基因定位到小麦B基因组上。序列分析表明, LMWLDN-M为Glu-B3基因家族的一个新成员。     

小麦品种“陕253”低分子量谷蛋白亚基基因的克隆及原核表达

利用LMW-GS特异引物,从强筋小麦品种陕253中克隆了1个1 498 bp的片段(GenBank登录号为FJ172533),该片段包含全长为912 bp的低分子量谷蛋白亚基的完整编码序列.经比较推导氨基酸序列的同源性,发现该基因属于Glu-D3位点编码低分子量谷蛋白亚基的基因,编码产物N-端具有LMW-m型低分子量谷蛋白亚基的典型特征,系统演化分析也支持这一结果.构建了该基因的表达载体pET32a-GluD3-S253,在宿主菌E. coll Rosetta-gami B(DE3)中经IPTG诱导表达融合蛋白.SDS-PAGE和Western blot检测表达产物,证实融合蛋白表达成功.     

小麦高亲和性钾转运蛋白基因HKT1启动子克隆及序列分析

根据普通小麦HKT1 cDNA序列(GenBank登录号:U16709)设计基因特异引物,通过筛选矮败中国春BAC文库,获得含有HKT1基因组序列单克隆BAC。根据HKT1 5’-端已知序列设计测序引物,以单克隆BAC质粒为模板进行测序,序列经Sequencer软件拼接,获得了HKT1基因起始密码子上游4 192 bp序列。用Neural Network PromoterPrediction(NNPP)软件分析此序列,预测存在9个转录起始点。PLACE软件分析表明,该序列具有启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box,包含多个胁迫诱导元件,如盐诱导元件GAAAAA,抗冻、缺水、脱落酸、抗寒元件CANNTG和CCGAC等,伤害诱导元件TGACY,组织特异表达元件ACTTTA和ATATT等。HKT1启动子克隆表明,设计基因特异引物筛选BAC文库,通过以单克隆BAC质粒为模板直接测序获得基因启动子序列的方法是从普通小麦基因组中克隆基因启动子的一条切实可行的途径。     

杀虫蛋白基因cry8Fa2的克隆及在Bt无晶体突变株中的表达

以本实验室分离的Bt菌株B-DLL质粒DNA为模板,利用cry8类基因特异性引物JJX5和JJX3扩增出3.5kb的片段,将该片段插入克隆载体pMD 18-T中,筛选获得一个含新基因的克隆pMD-cry8new.序列测定表明,该基因编码区为3 525 bp,编码的蛋白质由1 174个氨基酸残基组成,理论分子量为133....     

小麦抗叶锈病基因Lr35的RGA分析

根据已知植物抗病基因的NBS,LRR等保守结构域设计引物,对小麦全套抗叶锈病近等基因系材料进行RGA分析。引物对Pto-kin1IN／XLRR-INV1从近等基因系TeLr35中扩增获得一条747bp的特异性片段。序列分析表明,该片段与小麦基因片段Triticum urartu clone BAC 210J24,Triticum monococcum DV92的BAC克隆231A16等具有较高同源性,为Lr35的克隆奠定了基础。     

小麦贮藏蛋白中高分子量谷蛋白基因的5′上游调控序列克隆

以小麦品种东农7742的基因组DNA为模板,用PCR的方法克隆了小麦贮藏蛋白中高分子量谷蛋白12亚基基因(HMW-GS12)的上游调控序列。序列测定结果表明:所克隆的启动子片段大小为917 bp,该片段的498~922 bp序列与Thomspon报道的同一亚基对应区段序列比较,同源性为97.9%,有9个核苷酸发生了改变。推测的TATA box位于836~841 bp,有3个CAAT-like box,分别是693 bp处的CCAA;730 bp处的CAAAT和808 bp处的CCAT。另外,在684 bp存在E-box(TGCAAAG),还有2个E-like box,分别是608 bp处的TGCAAAC和510 bp处的TGCAAAA。认为该元件可能与转录速率和胚乳特异性的表达调控有关。     

奶牛乳房炎抗性相关基因Znf313的电子克隆与序列分析

电子克隆是基因克隆的新策略。利用一个患乳房炎奶牛外周血白细胞中差异表达的EST序列为信息探针进行电子克隆,根据电子克隆序列设计引物,以奶牛外周血白细胞cDNA为模板进行RT-PCR验证,PCR产物克隆入pGEM-T质粒载体,测序得到的序列已被GenBank收录（DQ010409）。该基因被命名为牛锌指蛋白313(Znf313)基因,开放阅读框1~693bp,推测编码230个氨基酸,预测其编码蛋白分子量为25.67kD,等电点6.90。     

小麦贮藏蛋白中高分子量谷蛋白基因的5''''上游调控序列克隆

以小麦品种东农7742的基因组DNA为模板,用PCR的方法克隆了小麦贮藏蛋白中高分子量谷蛋白12亚基基因(HMW-GS12)的上游调控序列.序列测定结果表明:所克隆的启动子片段大小为917 bp,该片段的498～922 bp序列与Thomspon报道的同一亚基对应区段序列比较,同源性为97.9%,有9个核苷酸发生了改变.推测的TATA box位于836～841bp,有3个CAAT-like box,分别是693bp处的CCAA;730bp处的CAAAT和808 bp处的CCAT.另外,在684bp存在E-box(TGCAAAG),还有2个E-like box,分别是608 bp处的TGCAAAC和510 bp处的TGCAAAA.认为该元件可能与转录速率和胚乳特异性的表达调控有关.     

小麦TaVIP1家族基因克隆、分子特性及功能分析

植物VIP1蛋白(Vir E2 interacting protein 1)与农杆菌侵染植物后T-DNA在细胞内的转运有关,影响植物转化效率,但还未见有关小麦中VIP1基因研究的报道。本研究利用in silico技术从普通小麦中克隆了TaVIP1家族基因,该家族基因全部由4个外显子构成,编码产物相似性高,与拟南芥AtVIP1蛋白质序列相似性仅为50.7%~51.4%。Southern杂交结果表明,TaVIP1基因在小麦基因组中存在3个拷贝。根据小麦3个TaVIP1基因的差异序列设计特异引物,以四倍体小麦Langdon与中国春D组染色体代换系为材料进行PCR检测,结合生物信息学分析,将小麦3个TaVIP1基因分别定位在4AL、4BS和4DS染色体上。亚细胞定位分析表明,TaVIP1蛋白分布于细胞膜、细胞质和细胞核中。农杆菌转化烟草,过表达TaVIP1基因降低了烟草转化效率。小麦TaVIP1基因编码的氨基酸序列与拟南芥AtVIP1基因及烟草NtVIP1基因编码的氨基酸序列相似性很低,这可能是小麦农杆菌转化效率低的原因之一。     

小麦硬度主效基因Pina和Pinb的克隆和序列分析

籽粒硬度是小麦品质改良的重要目标性状. 根据已报道的谷类作物中硬度主效基因Pina和Pinb的DNA序列, 设计了两对简并引物, 以我国软质小麦品种京411基因组DNA为模板, 进行PCR扩增, 分别获得了约450 bp的Pina和Pinb基因的全长特异性片段. 将其克隆到pGEM-3Zf(+)上, 重组子和酶切鉴定正确后, 进行序列测定和分析. 结果表明, 与     

低分子量谷蛋白亚基GlU-A3和GlU-B3位点对小麦面筋强度和烘焙特性影响

低分子量谷蛋白亚基是小麦谷蛋白亚基的重要组成部分,黄淮麦区小麦低分子量谷蛋白亚基组成对品质的效应尚缺乏系统的研究。本研究采用SDS-PAGE方法,鉴定了黄淮麦区42个小麦品种的Glu-A3位点和Glu-B3位点低分子量谷蛋白亚基组成,分析了低分子量谷蛋白亚基对小麦面筋强度和烘烤品质的影响。结果表明,在Glu-A3位点,对面筋强度和面包烘焙品质正向效应为:d,b>a,e;在Glu-B3位点,对面筋强度正效应为:h,d>f>g,b,j,对面包烘焙品质正向效应为:h>f,d>g,b,j。Glu-A3d/Glu-B3h亚基组合具有较好的面筋强度和烘焙品质。就低分子量谷蛋白亚基单个变异位点对品质综合效应而言,Glu-B3位点对品质作用比较大,与Glu-B1位点相近,同时,高低分子量谷蛋白亚基之间存在着互作效应,以Glu-B1/Glu-A3和Glu-D1/Glu-B3位点的互作效应比较显著。Glu-A3和Glu-B3位点及其所编码的不同亚基种类对品质的效应差异显著,并且与高分子量谷蛋白亚基位点存在互作,对不同位点优质亚基的聚合将有助于小麦品质的遗传改良。     

HMW-GS和LMW-GS组成及1BL/1RS易位对春小麦品质性状的影响

分析了221份春小麦品种（系）的HMW-GS、LMW-GS组成和1BL/1RS易位状况,并用其中104份品种（系）研究了HMW-GS和LMW-GS等位变异及1BL/1RS易位对品质性状的影响。结果表明,1、7+9、5+10、GluA3a和GluB3j分布较广,频率分别为57.5%、45.2%、63.8%、29.0%和42.5%。1BL/1RS易位系相当普遍,西北春麦区和东北春麦区频率分别为44.3     

The high and low molecular weight glutenin subunits and ω-gliadin composition of bread and durum wheats commonly grown in Portugal

A collection of 63 bread wheats (Triticum aestivum L.) and 21 durum wheats (Triticum durum Desf.) commonly grown in Portugal since 1982 were characterized for the composition of wheat storage proteins (WSP), high molecular weight glutenin subunits (HMW-GS), low molecular weight glutenin subunits (LMW-GS) and ω-gliadins. The composition of HMW-GS, LMW-GS and &-gliadins, encoded at loci Glu-1, Glu-3 and Gli-1, respectively, was revealed by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis. WSP allelic compositions of bread and durum wheat patterns were given. In the bread wheats, a total of 24, 24 and 18 patterns were observed for HMW-GS, LMW-GS and ω-gliadins, respectively. Forty-two different alleles were identified for the nine loci studied, Glu-A1 (3), Glu-B1 (7), Glu-D1 (4), Glu-A3 (5), Glu-B1 (7), Glu-D3 (2), Gli-A1 (2), Gli-B1 (8) and Gli-D1 (4). In the case of durum wheats, 19 alleles were identified: one allele at Glu-A1, two at Glu-B3, Glu-B2 and Gli-A1, three at Glu-B1, four at Glu-A3 and five at Gli-B1. For HMW-GS, LMW-GS and ω-gliadins, three, six and six different patterns were revealed, respectively. This study represents the first attempt to discriminate the bread and durum wheat varieties commonly grown in Portugal by the allelic variation of storage proteins. The database is useful for varietal identification and for plant breeders who seek to devise effective programmes aimed at improving wheat quality.     

Allelic variation at the storage protein loci of 55 US-grown white wheats

Fifty soft white and hard white wheat cultivars (Triticum aestivum L.), and five club wheat cultivars (T. compactum L.) were partially characterized in terms of their storage protein compositions, i.e. gliadins, and high molecular weight and low molecular weight glutenin subunits (HMW-GS and LMW-GS, respectively). At the Glu-1 loci, HMW-GS composition 1,7 + 9,2+ 12 was found to be predominant, being expressed in 11 cultivars out of 55. The most common alleles at the loci coding for gliadins and LMW-GS were found to be Gli-A1/Glu-A3a (43.6%), Gli-B1/Glu-B3b (36.4%), Gli-D1a/Glu-D3a (38.1%) and Gli-Dli/Glu-D3a (21.8%). Two-dimensional fractionation (acid-poly-acrylamide gel electrophoresis (A-PAGE) × sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)) of reduced and alkylated glutenins revealed that the number and the relative mobility of LMW-GS polypeptides were different from those reported for the corresponding Glu-3 alleles of hard-bread wheat cultivars. This result could account for the different technological properties of soft white wheats compared with hard-bread wheat cultivars, owing to the major impact of LMW-GS on dough quality.     

麦谷蛋白亚基Clu-1和Glu-3位点基因等位变异对小麦品质特性的影响

甲单向一步SDS-PAGE方法分析表明亲本品种Suneca和Cook在麦谷蛋白亚基的5个位点(Glu-B1,Glu-D1,Glu-A3,Glu-B3和Glu-D3)均含不同等位基因。本研究重点对Suneca×Cook的F_4代群体中在麦谷蛋白亚基位点均为纯合基因的60个系的出粉率(FY),面粉蛋白质含量(FP)及和面时间(PTM)进行了分析,以研究麦谷蛋白各亚基位点等位基因变异及位点间互作对小麦品质特性的影响。结果表明,不同基因型间出粉率无显著差异,Glu-D1位点等位基因d和a对FP的效应存在显著差异,Glu-Dld基因(编码5 10亚基)的正效应显著高于Glu-Dla基因(编码2 12亚基);Glu-D1、Glu-A3和Glu-B3位点上基因的等位变异对PTM有显著和极显著影响,含Glu-Dld、Glu-A3b和Glu-B3b基因的系分别比含Glu-Dla,Glu-A3d和Glu-B3h基因的系有较长的和面时间;Glu-B1位点上等位变异i和u以及Glu-D3位点等位基因b和e分别对PTM无明显影响。在这种遗传背景下,麦谷蛋白亚基位点对PTM的效应大小依次排列为Glu-D1>Glu-B3>Glu-A3>GIu-B1=Glu-D3。Glu-1位点和Glu-3位点间对和面特性的影响存在累加效应和互作效应。     

利用HMW-GS全缺失突变体快速构建Glu-1位点近等渗入系

小麦高分子量麦谷蛋白亚基(highmolecular weight glutenin subunit, HMW-GS)由Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位点中含有的复等位基因编码,评价和优化Glu-1位点组合是认识与改良HMW-GS表达与功能的重要途径。本研究创制了以小偃81为背景的HMW-GS基因完全缺失突变体DLGlu1。将DLGlu1与加拿大优质强筋小麦品种Glenlea杂交,结合后代幼胚培养与分子标记辅助选择技术,在BC₃F₃种子中快速鉴定出来自Glenlea的Glu-A1a、Glu-B1al和Glu-D1d位点不同组合的7种渗入系材料,可进一步发展成一套完整的Glu-1位点有差异的近等渗入系。本研究表明,DLGlu1可用于Glu-1位点近等渗入系的快速创制,对Glu-1位点功能研究和改良具有重要价值。     

利用PCR技术鉴别普通小麦Glu-1位点的某些等位基因

Glu-1位点的等位基因变异与普通小麦的烘烤品质有密切的关系, 本文利用根据Glu-Dly位点的基因序列设计的一对引物, 通过PCR技术, 可以准确鉴别等位基因的变异Glu-Dly10和Glu-Dly12, 同时还可以初步鉴定Glu-B1位点的等位基因变异Glu-Blh(14+15), 为分子标记辅助选择在小麦品质育种中的应用提供了基础.     

高分子量谷蛋白5+10亚基和1B/1R易位分子标记辅助选择在小麦品质育种中的应用

谷蛋白亚基组成对小麦加工品质具有重要作用。以豫麦34、藁城8901和中优9507为优质亲本,以轮选987、石4185和周麦16为农艺回交亲本,采用5+10亚基和1B/1R易位分子标记结合田间农艺性状选择,育成4个BC₂F₄群体共125个高代品系。2008—2009年度,将这些高代品系分别种植于北京和河南安阳,分析了5+10亚基和1B/1R易位对蛋白质含量、和面时间和峰值曲线面积等品质参数的影响。4个群体中蛋白质含量与和面时间、峰值曲线面积等参数变幅较大,后代品系间品质差异明显,5+10亚基可显著增加和面时间和峰值曲线面积,1B/1R易位对和面时间和峰值曲线面积的作用则受遗传背景的影响。和面时间和峰值曲线面积等主要品质参数还受亚基表达量的影响,和面时间和峰值曲线面积与低分子量谷蛋白亚基含量显著正相关(r = 0.38~0.74,P < 0.05),导入5+10亚基可显著增加高分子量和低分子量谷蛋白亚基含量;Glu-B3位点等位基因的变化对高分子量谷蛋白亚基含量的影响不显著,对低分子量谷蛋白亚基含量的影响则因组合而异。通过有限回交,育种早代在室内采用5+10优质亚基和1B/1R易位分子标记辅助选择,结合田间农艺性状选择,可以加速培育优质新品种。     

Glu-1位点缺失对小麦麦谷蛋白聚合体粒度分布及面团特性的影响

以Glu-1位点正常和部分缺失的小麦品系为材料,探讨HMW-GS和LMW-GS组成与谷蛋白聚合体粒度分布和面团特性的关系,为利用HMW-GS缺失系改良小麦品质提供理论依据。在20个供试硬白冬麦品系中,1个品系为Glu-A1位点缺失,5个品系为Glu-D1缺失,3个品系为Glu-A1和Glu-D1双缺失。所有品系的蛋白质含量皆较高(13.39%~14.12%),品系间无显著差异,缺失系与非缺失系间也无显著差异。Glu-1位点缺失显著降低了高分子量谷蛋白/低分子量谷蛋白比(HMW/LMW)、不溶性谷蛋白大聚体的含量和百分比。谷蛋白/醇溶蛋白比(GLU/GLI)在基因型间变幅较小,且在缺失系和非缺失系间无显著差异。Glu-1位点缺失显著降低了面团弹性,但显著提高了面团的延展性。部分Glu-1位点缺失系仍具有较高的面团强度和突出的延展性,谷蛋白聚合体粒度分布和面团特性受谷蛋白亚基组成和表达量的共同影响。研究结果表明,利用Glu-1位点亚基缺失可能是改善面筋延展性,提高食品加工品质的方法之一。