基于Cre/loxP系统的无筛选标记转耐低磷转录因子GmPTF1大豆种质创制与分析

筛选标记基因在转基因植物应用中存在一定潜在安全风险,在转基因植物改良中如何合理消除该基因非常必要。转录因子PTF1具有改善植物在低磷胁迫下吸收磷效率的作用。本研究用根癌农杆菌介导法将Cre/loxPGmPTF1导入大豆品种豫豆22,利用β-雌二醇诱导Cre/loxP系统删除筛选标记基因,获得了无筛选标记的转GmPTF1基因大豆。用PCR法扩增删除标记基因后的重组序列并测序显示,筛选标记基因在大豆基因组中已经被完全删除,重组序列中目的基因序列正确并保持了正确开放读码框;loxP位点重组出现一种新的拼接类型,重组后2个loxP序列全部缺失,新重组拼接位点长38 bp,与NCBI数据库的其他序列均无同源性,并且重组涉及2个loxP位点的外侧翼序列,造成Cre/loxP盒上游loxP和下游loxP外侧翼序列部分缺失。经过RT-PCR和Western杂交验证显示无筛选标记转基因大豆植株中GmPTF1能够正常转录和翻译,在根系、叶片及茎中的GmPTF1蛋白表达量均高于野生型对照,而在种子中与对照无显著差异。沙培试验表明,在低磷条件下无筛选标记转基因大豆苗期根系指标、生物干重、叶绿素含量和磷含量均显著高于野生型对照,而丙二醛含量低于对照。利用Cre/loxP重组系统可以有效删除转基因大豆中的筛选标记基因。     

一个含LoxP-FRT重组酶位点及易于操作的植物表达双元载体pYBA100

在农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的植物遗传转化中,常常需要用到植物表达双元载体。为便于基因工程操作并能在获得转基因植物后方便将标记基因删除,我们构建了植物表达双元载体pYBA100,以满足用于生产安全转基因植物的需要。本研究通过融合PCR方法,尽可能去除所有非必需的序列,将pYBA载体最小化。pYBA载体在大肠杆菌中为多拷贝,骨架为3.69kb。我们构建的含NptⅡ植物筛选标记基因的载体pYBA100仅为5.37kb,多克隆位点为22个,方便基因工程操作。载体pYBA100的T-DNA植物筛选基因表达框两侧预留有LoxP-FRT融合位点,方便在获得转基因植物后通过Cre或FLP重组酶将植物筛选标记基因删除。pYBA100载体能于大肠杆菌和农杆菌中自我复制,并成功转化了拟南芥,符合农杆菌介导的植物转基因要求。离体删除实验结果证明,载体pYBA100能经Cre重组酶删除植物标记基因表达框。     

CspB基因植物表达载体的构建及转化玉米自交系的研究

利用来自Bacillus subtilis细菌的CspB基因(Gene ID:936224)构建了Ubiquitin启动子驱动的CspB基因植物表达载体PBPC-CspB-bar,以bar基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将构建的表达载体转化到玉米自交系京501、京517和吉444,通过喷洒除草剂筛选得到60株草丁膦抗性植株,用PCR检测得到48株bar基因阳性植株,将获得的转基因植株进行CspB基因PCR鉴定,获得13株同时整合CspB和bar的转基因株系。     

GsZFP1基因植物表达载体构建及对苜蓿的遗传转化

从野生大豆中获得的具有耐旱、耐冷特性的锌指转录因子GsZFP1基因,构建到以CaMV35S为启动子、E12为增强子的植物表达载体pCEOM中,以bar基因为筛选标记基因,通过农杆菌介导法将构建的植物表达载体转化苜蓿品种农菁1号的子叶节,用含0.5mg/L草丁磷的筛选培养基进行筛选,获得了70株抗性植株,用PCR检测得到20株bar基因阳性植株,将获得的转基因植株进行GsZFP1基因的RT-PCR鉴定,获得3株RT-PCR阳性植株。结果表明,GsZFP1基因在苜蓿中得到表达。     

耐碱GsCHX19基因的克隆及对苜蓿的遗传转化

基于实验室前期野生大豆G07256碱胁迫转录组数据,结合生物信息学方法筛选得到响应碱胁迫的cation/H+逆向转运蛋白基因Gs CHX19,克隆了Gs CHX19基因全长CDS编码序列并将其构建到p CAMBIA330035Su植物超量表达载体中。以肇东紫花苜蓿为受体材料,通过农杆菌介导法将重组的植物表达载体转化其子叶节,用含0.5mg/L草铵膦的筛选培养基进行筛选,获得20株抗性植株。采用PCR方法检测抗性植株中bar基因的表达,获得16株PCR阳性植株。对获得的PCR阳性植株进行RT-PCR及real-time PCR检测,鉴定共获得11株RT-PCR阳性植株,且证明Gs CHX19基因在各转基因植株中均有不同程度的表达。结果表明,Gs CHX19基因成功转化苜蓿,并且得到表达,该转基因植株将为耐盐碱转基因苜蓿新品种的培育提供重要的试验材料。     

高品质转野生荠菜凝集素基因棉花的获得

利用花粉管通道转基因技术,将DE35S启动子驱动的野生荠菜凝集素(WSA)基因导入10个高品质棉花品种(系)。所使用的转基因表达载体还含有选择标记基因NPTⅡ(卡那霉素抗性基因)和Ω序列,以利于转基因植株的筛选以及WSA基因的高效表达。对转化当代3197棵棉苗的检测结果表明,4.88%植株具有卡那霉素抗性(Kan )。根据野生荠菜凝集素基因序列设计一对特异性引物,对156个Kan 植株进行PCR检测,筛选出45个转WSA基因棉花工程植株。45个株系纤维品质测定结果表明,获得了9个高品质转WSA基因棉花株系。并对植物基因工程研究中以NPTⅡ作为标记基因的局限性以及一些转WSA基因棉花株系纤维强度变劣的原因进行了探讨。     

双丙氨磷在橡胶树遗传转化中的应用

本研究以GV3101::pMP90RK为工程菌株,bar基因作为筛选标记基因,研究了双丙氨磷在橡胶树根癌农杆菌介导法转基因体系中对转基因愈伤组织的筛选效果,并利用该体系将橡胶树转录因子HbWRKY5转入橡胶树无性系热研8-79中。实验结果表明,3mg/L双丙氨磷可作为橡胶树转基因体系中抗性愈伤组织筛选的最佳浓度。本研究中共获得了3个抗性愈伤组织系,抗性愈伤经过体细胞胚发生共获得234个体细胞胚,经植株再生培养后共获得22株再生植株。对再生植株进行的PCR鉴定结果表明,所获得的再生植株均为转基因植株。因此,bar基因结合双丙氨磷的筛选体系可以作为橡胶树转化体系中的有效筛选体系。     

利用Cre/loxP系统和rd29A启动子构建诱导型植物标记基因删除载体

出于对转基因作物中标记基因的安全性考虑,植物转基因育种中标记基因的删除将成为未来研究的热点之一。位点特异性重组系统之一Cre／loxP系统是目前在植物遗传转化中应用较多,较成熟的一个标记基因删除系统。为了利用Cre／loxP系统构建一种可调控的标记基因删除系统,本研究首先从拟南芥中克隆了逆境诱导型的启动子rd29A,同时从质粒pCre上克隆了Cre基因,构建了含有rd29A：Cre：Tnos表达元件的中间载体,将这一表达元件插入到另一植物双元表达载体pKsb中,最终构建了含有loxP-Pnos—nptⅡ-Toes—rd29A—Cre-Tnos-loxP的可诱导型删除标记基因nptⅡ的植物双元表达载体。     

安全选择标记和无选择标记转基因技术研究进展

转基因植物中选择标记的存在是影响转基因植物安全的重要因素之一。目前主要从两个方面来解决转基因植物中选择标记的安全问题,一是选用安全的选择标记,二是构建无选择标记或标记删除转化系统。对目前几种重要的安全标记和无选择标记转基因技术的最新研究进展进行了综述,并对这些技术在转基因植物研究中的应用前景进行了展望。     

红色荧光蛋白基因DsRed2植物表达载体的构建及遗传转化

本研究通过简单检测DsRed2基因的表型就能快速筛出含有目的基因的成熟籽粒。DsRed2是一种在激发光下呈红色的荧光蛋白,根据在GenBank中获得的DsRed2及其特异性启动子Ltp2的基因序列,设计特异性引物,并构建筛选标记为Bar基因的植物表达载体pCAMBIA3300-Ltp2-DsRed2,通过农杆菌介导法转入玉米品种郑单958中。经除草剂筛选获得210株抗性植株,PCR检测得到阳性植株80株,对PCR检测呈阳性的植株进行试纸条检测,结果表明红色荧光蛋白基因DsRed2已成功整合到玉米基因组中。通过标记基因的快速检测,从而减少后代筛选的工作量和降低制种成本,为转基因玉米新品种的筛选提供直观有效的筛选标记。     

利用共转化方法创制携带Pi9抗稻瘟病基因的无选择标记转基因水稻

水稻稻瘟病是由子囊菌(Magnaporthe oryzae)引起的水稻灾害性病害。培育抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的措施之一。水稻Pi9抗稻瘟病基因来源于小粒野生稻并已被克隆和应用于转基因育种。为了提高无选择标记转基因植株的选择效率,将绿色荧光蛋白(GFP)用作可视遗传标记,对双菌株共转化系统进行改良:目的基因载体携带Pi9抗稻瘟病基因;标记基因载体用潮霉素磷酸转移酶(HPT)作为植物转化选择标记,用GFP作为负选择标记,筛除标记基因分离植株。两种载体的农杆菌转化株混合,分别与水稻品种‘浙恢414’、‘浙粳22’、‘浙11B’、‘日本晴’、‘空育131’和‘粤泰B’的愈伤组织共培养,然后从5%~38.3%的起始愈伤组织筛选获得了转化愈伤组织(HPT+GFP+)。对T0植株进行Pi9基因PCR检测,11.8%~77.8%的T0植株为共转化植株(HPT+GFP+Pi9+)。对共转化植株T1代进行绿色荧光检测,筛选阴性植株(GFP-),再通过PCR筛选Pi9+植株。根据13个T1群体的研究结果,61%的共转化植株在T1代分离出无选择标记转基因植株(HPT-GFP-Pi9+)。转Pi9的无选择标记植株和后代株系对水稻稻瘟病呈抗病反应。因此,本研究通过GFP标记提高了双菌株共转化系统的选择效率,转Pi9的无选择标记水稻株系为水稻抗稻瘟病育种提供了有用的遗传资源。     

反义外壳蛋白基因介导的抗SCMV转基因玉米研究

玉米矮花叶病（MDM）是一种世界性病害，在我国主要由甘蔗花叶病毒(SCMV)所致。为探索一条高效、安全的抗SCMV转基因途径，构建了无标记基因的SCMV反义外壳蛋白基因（cp）表达载体pACP。通过冻融法将该载体与抗除草剂标记基因(bar)载体分别导入农杆菌LBA4404,然后共转化玉米自交系综3的幼胚。通过除草剂梯度筛选，从抗性愈伤组织分化获得了35株再生苗。PCR检测证明，其中26株带有抗除草剂标记基因（bar），14株带有SCMV反义cp基因。这14株带有目的基因的玉米植株自交，其种子在田间种植成株行（T₁代）。玉米T₁代幼苗人工接种SCMV，筛选出2个抗病株率高于70%的株行。ELISA检测表明，抗病株SCMV含量极低，抗性达高抗水平。PCR检测表明，抗病性是反义cp基因作用的结果，并且获得了2株cp基因阳性而标记基因阴性的抗病株。     

转基因植物中选择标记基因的控制策略

近年来,转基因植物中的选择标记的安全性问题引起公众关注,如何消除选择标记,培育无选择标记基因的转基因植物已成为基因工程研究的热点。本文系统介绍了通过共转化、转座子、染色体内重组和位点特异性重组消除选择标记及用正向选择标记基因代替负向选择标记基因手段培育无选择标记的转基因植物的发展策略。     

农杆菌介导的共转化体系的研究进展

实现多基因在同一受体植株中的共转化在研究植物多基因控制的代谢途径和获得去选择标记转基因植株中具有巨大的应用前景。本文综述了目前国内外在共转化上的研究进展,尤其对农杆菌介导的共转化系统的新类型、作用机理、影响因素及其应用前景进行了阐述。     

利用玉米黄绿苗标记单倍体诱导系选育早期加倍双单系（EDH）的研究

介绍了一种新型玉米单倍体诱导系,该诱导系兼具籽粒标记、幼苗标记和成株标记,可在幼苗期通过黄绿苗性状鉴别出杂合二倍体植株,可在早期加倍（EDH）、高自然加倍、单倍体回交和单倍体轮回选等技术方面应用,有明显的技术优势与应用前景。     

分子标记在松树遗传与进化研究中的应用

松树是世界上分布最广且最具经济价值的树种之一。近年来随着DNA分子标记技术的发展,分子标记已经广泛应用于松树的遗传多样性、亲缘关系、遗传图谱构建、基因定位及分子标记辅助选择等方向。本文从遗传多样性、亲缘关系、遗传图谱构建、基因定位及标记辅助选择等角度,评述了松树遗传与进化上常用的DNA分子标记如RFLP、RAPD、AFLP和SSR等的应用情况和进展。在遗传多样性方面,DNA分子标记技术已成为鉴定松树种间、种内遗传多样性的有效手段,并用于指导杂交育种;在亲缘关系判定方面,可以在分子水平上阐明生物系统演化及分类情况,揭示育种亲本的选配和种质资源的有效利用;在松树遗传图谱构建和基因定位及标记辅助选择方面也取得了显著进展,构建了二十多张连锁图谱,并对其生长、材性和抗性等性状进行了基因定位,获得了一些重要的与抗病相连锁标记。     

Coat protein-mediated protection against plum pox virus in herbaceous model plants and transformation of apricot and plum

Summary The expression of the viral coat protein gene in transgenic plants has been shown to induce tolerance against virus infection (Beachy et al., 1990). Transgenic plants ofNicotiana clevelandii andNicotiana benthamiana- herbaceous host plants for PPV - transformed withAgrobacterium strain LBA 4404 containing the plasmid pBinPPVm, regenerated on selection media containing kanamycin were tested for the expression of the PPV coat protein gene by ELISA and immuno western blot. After rooting and acclimatisation plants were tested for the protection against PPV Following the inoculation plants were investigated for symptom development and virus accumulation. Different lines were identified, according to the different reaction to the mechanical inoculation, ranging from a complete absence to a strong reduction of symptoms. There have not been many reports on transformation of trees in general, and in fruit trees particularly. It is obvious that the major obstacle is the regeneration of transformed plantlets. Attempts to improve crop plants by genetic engineering techniques will always depend very strongly on the availability of reliable protocols for transformation, selection and regeneration (Laimer et al., 1989, 1990). Different systems involving juvenile and adult plant material have been developed allowing the transfer of foreign genes into apricot and plum cultivars. We report the transformation and regeneration ofPrunus armeniaca andPrunus domestica plants withAgrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 containing various binary plasmids, pBinGUSint, carrying the marker geneβ-glucuronidase (GUS) and pBinPPVm, carrying the coat protein gene of Plum Pox Virus (PPV), the causal agent of Sharka disease. The marker geneGUS was used for the optical evaluation of the efficiency of different transformation systems involving cotyledons of immature embryos as well as somatic embryos and leaf discs. The coat protein gene of PPV was used to introduce the coat protein mediated resistance against one of the most important pathogens of stone fruit trees in Europe and the whole Mediterranean area.     

Genomic selection in hybrid breeding

While hybrid breeding is widely applied in outbreeding species, for many self‐pollinating crop plants, it has only recently been established. This may have had its reason in the limitations of methods available for hybrid performance prediction, in particular when established heterotic pools were absent. Genomic selection has been suggested as a promising approach to resolve these limitations. In our review, we briefly introduce the principles of genomic selection as an extension of marker‐assisted selection using genome‐wide high‐density molecular marker data and discuss the advantages and limitations of currently used algorithms. Including the outcome from a recent extended approach to hybrid wheat as a timely example, we summarize current progress in empirical studies on the application of genomic selection for prediction of hybrid performance. Here, we put emphasis on the factors affecting the accuracy of prediction, pointing in particular to the relevance of relatedness, genotype x environment interaction and experimental design. Finally, we discuss future research needs and potential applications.     

转基因油菜研究进展

随着分子生物技术研究的快速发展,油菜的遗传转化研究日趋成熟。2003年,转基因油菜在全球种植面积为352万公顷。油菜基因工程研究的重点主要放在转化的目的基因、筛选标记、再生体系的建立和遗传转化方法方面。目前油菜已建立了子叶、下胚轴、茎段、原生质体培养、小孢子培养的再生体系;用于油菜基因转化的方法有根癌农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、激光微束穿刺法、显微注射法和花粉介导法等。在油菜转基因中所转化的目的基因趋于多样化,如:品质改良、抗病、抗逆、不育基因等;较常用的筛选标记基因是新霉素磷酸转移酶基因(NPTII);本文主要从油菜转基因的再生体系建立、筛选标记及转化方法方面进行综述,并对油菜转基因上存在的问题及前景进行了探讨和展望。     

植物表达重组蛋白的N-糖基化研究进展

分子农业中，植物作为生物反应器生产药用重组蛋白是近十几年来基因工程研究的一大热点。植物具有完整的真核表达系统、重组蛋白通常可以正确组装、折叠和修饰，同时，由于植物表达体系的方便、廉价等优点，利用转基因植物生产药用蛋白的研究迅猛发展，已有100余种蛋白中得到表达，有些已进入商业化生产。但是植物与动物对蛋白的转译后修饰并不是完全保守的，植物是否能够真正“忠实”地表达出实用、可靠的目的蛋白产品已成为备受瞩目的话题，由于大多数药用蛋白都是分泌型蛋白，因此植物表达重组蛋白的N-糖基化成为新的研究热点。笔者对植物表达体系对药用蛋白的N-糖基化修饰途径和人源化改造植物表达重组蛋白的研究进展两个方面加以综述，并对生物反应器的未来发展方向进行了探讨和展望。