转基因水稻BarKasalath-01事件特异性检测

利用hi TAIL-PCR方法研究了转基因水稻Bar Kasalath-01中外源基因在基因组上插入位点的序列特征,获得了外源基因T-DNA右边界旁侧序列511 bp,与水稻基因组数据库比对发现,外源基因插入位点位于水稻基因组第8号染色体的第3 326 720处。根据整合位点水稻基因组序列和外源基因T-DNA左边界序列设计引物,扩增得到了左旁侧序列783 bp。基于左右旁侧序列,建立了转基因水稻Bar Kasalath-01的事件特异性定性PCR检测方法,扩增片段分别为783 bp和411 bp。该方法特异性强、灵敏度高,能够在Bar Kasalath-01基因组DNA含量为0.1%的模板中检测出转基因成份。依据旁侧序列,还建立了快速鉴定转基因后代植株基因型的3引物PCR检测方法。这些方法的建立,实现了对转基因水稻Bar Kasalath-01转化事件的特异性检测。     

多重PCR检测多价转基因甘蔗

甘蔗(Saccharum officinarum)是制造蔗糖、提炼乙醇的主要原料。随着甘蔗转基因育种的开展,建立一套快速精准转基因分子检测技术在甘蔗转基因研究中有重要的应用前景。本研究以二价抗虫转基因甘蔗为材料,利用多重PCR建立同时检测Bar基因、Bt基因和马铃薯蛋白酶抑制剂基因(PinⅡ基因)。研究表明,该多重PCR检测体系的最佳退火温度为53℃,有效扩增Bar基因(415 bp)、Bt基因(780 bp)和PinⅡ(1 000 bp)3个基因片段。多重PCR技术进行外源基因的检测,节省时间、降低成本、提高效率并可以对该转化植物进行特异性鉴定。     

木薯内参照基因LAM2定性PCR和定量PCR分析

在转基因植物及其产品的成分检测中,内参照基因(endogenous reference gene)起着重要的作用,木薯内参照基因的研究是转基因木薯成分定性PCR和定量PCR检测的基础。本研究选择木薯的亚麻苦苷酶(linamarase,LAM)和Polyubiquitin(PUBQ)基因为研究对象,运用定性PCR的方法在22种木薯的不同品种中进行稳定性分析,在12种大戟科其它植物、20种非大戟科植物及五类主要转基因作物的混合样品(玉米,大豆,水稻,棉花和油菜)中对LAM2和PUBQ1定性PCR引物进行特异性检测分析及灵敏度检测分析。结果显示:LAM2和PUBQ1引物在木薯的不同品种中均能得到稳定性扩增;在12种大戟科其它植物、20种非大戟科植物能够进行特异性扩增,没有发现非特异性扩增产物出现;LAM2在五类主要转基因作物的混合样品(玉米,大豆,水稻,棉花和油菜)中也没有非特异性扩增产物出现,而PUBQ1在五类主要转基因作物的混合样品(玉米,大豆,水稻,棉花和油菜)中却有很多的非特异性扩增产物出现。灵敏度检测发现定性PCR LAM2检测方法的灵敏度达到质量百分含量0.01%,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测结果表明LAM2的灵敏度可达到0.001~0.000 1 ng/μL。选择部分品种的PCR扩增产物进行测序,序列分析表明LAM2在不同品种的木薯的基因组DNA均可以扩增到293 bp的核苷酸片段,比对分析表明所获得的木薯不同品种中LAM2 PCR扩增片段的核苷酸序列一致没有发现变异位点。研究结果表明LAM2引物扩增系统初步符合内参照基因的种内一致性,稳定性,种间特异性的特点,灵敏度检测的要求可应用于转基因木薯成分定性和定量PCR检测。     

多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162

为对转基因玉米MIR162的进口实行监测、规范转基因玉米在国内市场中的流通,建立一种转基因玉米MIR162准确快速的检测方法,通过设计转基因玉米MIR162品系特异性序列的引物和探针,摸索和优化多重荧光PCR体系和参数,开发建立多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162。结果表明,转基因玉米MIR162品系标准品和平行样品中内标基因和品系特异性基因均出现明显扩增曲线,其他转基因玉米品系标准品仅内标基因有扩增曲线,空白对照无扩增曲线,说明该TaqMan-MGB探针对转基因玉米MIR162品系具有扩增特异性。该方法可作为鉴定筛查转基因玉米MIR162品系及其转化体成分的有效方法,用于规范管理转基因产品在市场上的流通。     

转耐盐基因水稻的PCR检测方法及其分子辅助育种

研究采用改良CTAB法和磁珠自动提取法提取水稻种子基因组DNA,通过对水稻内源SPS基因、ThST3和Ubiquit-in启动子间构建特异序列进行PCR扩增,扩增产物结合排枪凝胶电泳实现快速检测。其中PCR扩增内源SPS基因的结果表明,采用改良CTAB法和磁珠自动提取法可用于市售水稻种子和转基因种子的DNA提取。实验合成的构建特异引物以及建立的PCR扩增反应体系能特异性地检测转耐盐基因水稻Theli。该方法检测灵敏度高,绝对检测低限达17.3×10-2ng,相对检测低限为0.41%,能有效地对转基因水稻ThST 3进行鉴定;稳定性好,可完全满足转基因水稻的定性检测、监督和标识管理需要。同时可用于对转基因水稻的辅助选择(MAS)育种。     

转基因玉米MON88017旁侧序列分析及定性PCR检测

采用基因组步移法和巢式PCR方法研究转基因玉米MON88017外源基因插入位点旁侧序列特征,获得了外源基因插入位点的左边界旁侧序列504bp,包括336bp的插入载体序列和168bp的玉米基因组序列。根据此旁侧序列,设计MON88017转化事件特异性引物并进行定性PCR扩增,扩增片段为446bp,建立了转基因玉米MON88017转化体特异性检测方法。该方法特异性强、灵敏度高(0.1%),为转基因玉米品种MON88017进出口检测和标识检测提供了技术基础。     

转基因植物DNA成分检测技术研究进展

综述了转基因植物的DNA成分定性、定量检测,基因芯片检测技术的原理和特点,初步探讨未知转基因核酸成分检测技术研究状况,最后指明转基因检测技术的发展依赖于现代分子生物学研究技术的发展,并朝着低成本、自动化、高灵敏度、高特异性、高通量的方向发展。     

转基因水稻标准质粒分子的构建与分析

针对目前转基因(GM)产品检测标准分子的缺乏,构建适用于转基因水稻的标准质粒分子pMDSPS和pMDTheli,其中包含水稻内源基因SPS通用序列,耐盐基因ThST3和Ubiquitin启动子序列的构建特异性Theli序列。对其特异性及制备标准曲线的可靠性进行鉴定研究,研究结果显示,在进行普通PCR扩增时,采用质粒标准分子为阳性对照,均能特异扩增目的条带。以标准质粒分子构建的标准曲线,SPS基因的定量标准曲线的相关系数平均为0.9993,PCR扩增效率在1.0004~1.034之间;ThST3基因的定量标准曲线的相关系数平均为0.9937,PCR扩增效率在0.9358~0.9486之间。因此,构建的标准分子pMDSPS和pMDTheli既能作为普通PCR的阳性对照,也能用于定量标准曲线的构建,为转基因水稻的定量检测提供简便、价格低廉的标准分子打下基础。     

多重RT-PCR快速检测转基因油菜

全球转基因油菜的数量和种类日益增多,其所带来的潜在风险也备受人们的关注,迫切需要开发一套精准、高效、便捷检测转基因油菜的技术体系。本研究针对花椰菜花叶病毒35 S启动子(pCaMV 35S)、膦丝菌素乙酰转移酶(bar)、5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(epsps)3个目标基因的序列,以及油菜内源基因cruciferinA (CruA)序列设计四重实时荧光定量聚合酶链式反应(Multiplex real-time fluorescence quantitative,PCR)特异性强的引物和多重荧光探针。通过对多个转基因油菜材料验证,结果表明该方法检测特异性强,重复性好,4个基因的扩增效率都在90%～105%之间,标准曲线相关系数R2都大于0.99。转基因成分bar,epsps和pCaMV35S的检出限为0.1 ng/μL,内参基因CruA的检出限为0.01 ng/μL。本研究建立了一种能快速、高效、准确检测转基因油菜四重实时荧光定量PCR技术的检测体系。     

转基因甜菜H7-1实时荧光PCR检测方法

运用实时荧光PCR方法对转基因甜菜H7-1外源基因FMV 35 S启动子、E93’终止子、CP 4-EPSPS外源基因和品系特异性进行了检测.建立了快速、准确的转基因甜菜H7-1转基因成分的PCR检测方法.本研究采用的FMV 35 S启动子、E93’终止子、CP 4-EPSPS和品系特异性检测引物探针能有效检测转基因甜菜H7-1中转基因成分,具有特异性,且灵敏度达到0.01％.     

转基因抗虫棉外源DNA插入整合结构分析和转化事件特异性检测方法的建立

通过3’端2次高效热不对称交互PCR(hiTAIL-PCR)和5’端4次hiTAIL-PCR及1次长链PCR获得了转基因抗虫棉材料06N-119的外源DNA插入片段的全序列。外源DNA插入片段全长11578bp,由NptⅡ基因和Bt基因两个表达盒串联构成。插入位点处缺失75个碱基,未发生基因重组现象。根据3’端旁侧序列设计引物,特异性和灵敏度检测结果表明,建立的3’端定性PCR检测方法特异性强,灵敏度高,最低检测限为每100ng模板量的0.05%,相当于11个靶标序列拷贝。本研究结果对转基因抗虫棉外源基因检测和生物安全评价具有重要意义。     

非洲猪瘟病毒一步法巢式锁核酸荧光定量PCR方法的建立

试验基于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)B646L(P72)蛋白基因序列，建立一种高灵敏度和高特异性的检测方法。采用Oligo 7软件设计一步法巢式锁核酸荧光定量PCR(One Step NestedLocked Nucleic Acid real-time PCR,LNA-OSN-PCR)的嵌套引物以及探针，并对外引物进行锁核酸修饰。建立并优化LNA-OSN-PCR反应体系和条件，确立LNA-OSN-PCR标准曲线，并检验LNA-OSN-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。采用LNA-OSN-PCR方法，对96份临床疑似患病样品进行检测，同时与普通荧光探针PCR方法进行比较。试验确立并优化了LNA-OSN-PCR的反应条件和体系，建立的LNA-OSN-PCR标准曲线，具有较好的线性(R²=0.9945)。该方法的最低检测限为3×10^-1copies/μL，变异系数小于3%，并且与其他病毒或细菌核酸无交叉反应。LNA-OSN-PCR方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法比较，检测灵敏度提高10～100...     

转基因玉米转化体特异性寡核苷酸芯片测试方法的研制

根据7种转基因玉米Bt11、Bt176、Mon810、Mon863、TC1507、GA21和NK603的重组DNA结构,利用Primer premier 5.0引物设计软件分别设计转化体特异性引物,优化PCR反应条件,对引物特异性及灵敏度进行验证。结果表明,所设计引物特异性强,灵敏度达0.1%。在植物基因组与外源基因的连接区域,利用Primer premier 5.0和Oligo 6.0软件分别设计和筛选7种转基因玉米40mer oligo转化体特异性探针,制备转基因玉米的寡核苷酸芯片,并对芯片检测的特异性、重复性及检测灵敏度进行检验。证明所设计探针特异性强,灵敏度达0.01%。与PCR检测方法相比,基因芯片检测法灵敏度高、特异性强,可有效检测及鉴定多种转基因玉米,大大提高检测的准确率和效率。     

多重PCR结合DHPLC方法检测番茄中转基因成分

应用多重PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,检测转基因番茄华番1号中的转基因成分。对番茄中特异的PG内源基因、华番1号中含有的CAMV35S、NOS和NPTII外源基因进行多重PCR扩增,将扩增产物测序验证。利用DH-PLC分离多重PCR产物,建立了多重PCR-DHPLC技术检测转基因番茄的方法;将样品进行稀释,确定了该方法的检测灵敏度。试验结果表明,所建立的多重PCR-DHPLC方法操作简便,快速准确,能够同时检测转基因番茄4个内、外源基因,检测限达0.5ng/μL,可用于番茄中转基因成分的检测。     

水貂绿脓杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了利用环介导等温扩增(LAMP)技术建立水貂绿脓杆菌核酸快速检测方法。根据绿脓杆菌外毒素A基因240 bp片段保守序列设计一套LAMP特异性引物,对水貂绿脓杆菌基因组DNA进行LAMP扩增,通过浑浊度、SYBR Green荧光染料显色及电泳观察结果,并进行特异性和敏感性检验。结果表明：完成反应仅需要60 min(65℃),特异性强,最低检测限为1 ng/μL。该方法简单快捷、特异性强、灵敏度高,适合于基层使用,具有广泛的临床应用前景。     

转基因植物(农产品)中转基因成分的PCR检测

转基因(植物)食品的安全性是科学界及公众普遍关心的问题。在转基因植物研究中,根据转基因植物所带有的转基因成分的DNA序列,设计引物对耐草铵膦转基因植物中转入的转基因成分进行了PCR分析,结果表明,采用PCR扩增对外源基因和遗传标记基因的分析方法灵敏、准确。     

转基因玉米Bt11品系特异性荧光RPA检测

重组酶聚合酶介导的等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)作为一种新型等温扩增技术,具有反应时间短、灵敏度高、特异性强等特点,在转基因检测领域得到了广泛关注。本研究针对转基因玉米Bt11外源插入链接区域设计筛选了特异性引物和探针,建立了快速准确的荧光RPA检测方法,在39℃条件下,20 min内完成扩增并且能够实时监测,可以准确有效地检测到50个拷贝的靶标片段。而且,对于背景复杂的植物基因组DNA能够得到准确的扩增曲线。本研究不仅可以满足常规实验室检测,通过RPA便携式仪器,还可以满足转基因植物现场检测,具有广阔的应用前景。     

转基因玉米LAMP检测体系的建立及应用

以转基因抗虫和耐除草剂玉米Bt11为研究材料,建立Bt11环状等温扩增快速检测技术方法.利用一种具有链置换活性的Bst DNA聚合酶,针对Bt11中玉米基因组与外源基因结合处序列,设计4条特异引物,并对反应温度、时间、灵敏度、结果判断方法等参数进行初步探索.结果显示,LAMP检测方法最适反应温度及反应时间分别为65℃和60 min,其灵敏度为常规定性PCR的20倍.LAMP技术检测转基因玉米品系Bt11具有特异性高、快速、简便等优点,具有广阔的应用前景.     

转基因耐除草剂大豆A2704-12定性PCR检测方法研究

本研究建立了转基因耐除草剂大豆A2704-12定性PCR检测方法.根据A2704-12转化体外源插入片段5'端与大豆基因组连接区序列设计特异性引物,以大豆内源基因Lectin为内标,从A2704-12转化体中特异性扩增出239 by大小的特异性目的片段.同时对该方法特异性和灵敏度进行测试,结果显示:该方法能检测出A27...     

植物转基因产品检测方法的评价

对植物转基因产品进行检测包括筛选、鉴定和定量三个步骤。定性PCR和Southern印迹是筛选的常用方法。由于假阴性或假阳性结果的存在，外源基因类型的鉴定需要结合使用针对转入的外源基因的特异性引物。竞争定量PCR，实时PCR和酶联免疫分析可以确定转基因成分含量。本文进一步讨论了各种检测方法的优缺点、灵敏度以及适用范围。并且认为，在比较分析的基础上，使用国际公认的检测方法，根据目的和条件的不同，综合使用多种检测手段是准确检测植物转基因产品的合理策略。