表达鸡白细胞介素18重组禽痘病毒的构建及其表达产物生物学活性的检测

为构建表达鸡IL-18的重组禽痘病毒，将含痘病毒启动子IP2EP2驱动的鸡，IL-18基因插入到禽痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681／ChIL-18。将pSY681／ChIL-18转染已感染亲本禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组，产生表达鸡IL-18的重组禽痘病毒rFPV-ChIL-18。在含有X—gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选后，对重组病毒rFPV-ChIL-18又进行了多次蚀斑克隆。以重组禽痘病毒DNA为模板，利用鸡IL-18基因特异引物进行PCR，扩增出1条约0．6kb的带。收集含鸡IL-18蛋白的细胞上清液进行MTT试验，表达的产物能明显提高鸡淋巴细胞的转化率。     

水稻组氨酸磷酸转运蛋白OsAHP2的表达及纯化

细胞分裂素在植物生长发育和抵御环境胁迫过程中均扮演着重要的角色,其信号是由细胞分裂素受体组氨酸激酶、组氨酸磷酸转运蛋白(HPs)以及反应调节因子组成的复杂的双元组分系统进行传递的。为了获得高纯度的OsAHP2蛋白,从水稻中扩增了OsAHP2全长cDNA,通过酶切连接的方法构建了2个OsAHP2原核表达载体,命名为pET-32a-OsAHP2和pGEX-4T-1-OsAHP2,测序正确后分别转化大肠杆菌表达菌株Rosseta和XA90。SDS-PAGE检测结果显示,0.5 mmol/L IPTG诱导1,3,5 h条件下,pET-32a-OsAHP2重组菌株表达出分子量约为35 ku的融合蛋白,pGEX-4T-1-OsAHP2重组菌株表达出分子量约为42 ku的融合蛋白,筛选出融合蛋白表达量较高的pET-32a-OsAHP2进行后续试验。在0.5 mmol/L IPTG诱导3 h条件下,重组大肠杆菌pET-32a-OsAHP2以可溶性蛋白的形式表达OsAHP2融合蛋白,通过His镍离子亲和层析柱纯化后,获得了大量纯度较好的OsAHP2融合蛋白。     

小麦Ta-SKP2A克隆及其酵母双杂交诱饵载体的构建

SKP2A是调控细胞周期转录因子降解的F-box蛋白。为研究该蛋白在小麦-叶锈菌互作过程的作用,首先克隆获得中国春小麦Ta-SKP2A全长序列,然后将其与pGBKT7载体连接,转入酵母Y187感受态细胞中,构建酵母诱饵表达载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性和自激活效应。结果表明,Ta-SKP2A编码区序列长度为1 146 bp,其ORF区编码一条由382个氨基酸组成的多肽。在ORF区两侧连接酶切位点(EcoRⅠ和Bam HⅠ),并将其与载体pGBKT7连接,成功构建了包含目的基因的诱饵载体pGBKT7-Ta-SKP2A,且含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,其过夜培养物OD6000.8,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性。含重组诱饵质粒的酵母菌株在二缺、三缺及四缺营养缺陷平板上不能生长,表明诱饵质粒的表达产物不能自激活报告基因。成功构建了一个包含Ta-SKP2A的重组诱饵质粒,为深入筛选与其互作的靶蛋白,研究其在小麦-叶锈菌互作体系中的作用机制奠定了基础。     

抗菌肽Omiganan的克隆、表达和抑菌活性

为获得Omiganan抗菌肽并研究其抑菌活性,根据Omiganan抗菌肽的一级结构(NH_2-ILRWPWWPWRRK-COOH),通过基因工程技术,参考大肠杆菌和毕赤酵母偏爱密码子原则,分别获得Omiganan核苷酸序列,再以Omiganan核苷酸序列为模板,设计特异性引物,通过PCR技术扩增Omiganan基因,分别与pET32a表达载体和pPIC9K连接构建pET32a-Omiganan原核表达载体和pPIC9K-Omiganan毕赤酵母表达载体,对含pET32a-Omiganan重组质粒的菌株分别采用IPTG 25℃, IPTG 37℃2种温度和自诱导方式表达获得Omiganan重组蛋白,对含pPIC9K-Omiganan毕赤酵母菌株采用1%甲醇诱导获得Omiganan抗菌肽。结果表明,自诱导14 h后Omiganan重组蛋白的表达量最高,IPTG 25℃, IPTG 37℃2种温度皆能诱导Omiganan重组蛋白的表达,但两者之间无显著差异。通过毕赤酵母表达的Omiganan抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有很强的抑菌活性。     

甜味蛋白Brazzein基因合成及其在酵母中表达的初步研究

采用pGAPZαA为表达载体,SMD1168毕赤酵母为受体系统,构建分泌型的Brazzein毕赤酵母重组菌。按照毕赤酵母偏爱密码子设计Brazzein基因,共设计4对引物,采用SOE-PCR法合成Brazzein基因,构建克隆载体pUC57-Bra与酵母表达载体pGAPZαA-Bra。将重组质粒线性化,电转导入Pichia.pastoris SMD1168中,用高浓度的Zeocin筛选高拷贝转化子。将重组菌株接种于YPD培养基诱导表达,进行SDS-PAGE分析。成功构建了分泌型的Brazzein毕赤酵母重组菌,SDS-PAGE表明,目标蛋白的相对分子量与理论值一致,诱导72h后的目的蛋白表达量达0.12g/L。     

木薯干旱胁迫下离区发育相关基因MeAP2-2酵母单杂交文库构建及其上游调控基因的筛选

为了研究干旱胁迫下调节木薯叶片脱落相关的重要节点基因及其分子调控网络,以‘华南5号’木薯为实验材料,通过采用酵母单杂交筛选系统,将MeAP2-2启动子中激素与胁迫相关的元件串联后整合入酵母染色体,构建诱饵菌株;采用SMART技术进行离区cDNA文库的构建,将离区cDNA与pGADT7-Rec表达载体共同转化诱饵菌株,通过同源重组在酵母细胞内筛选MeAP2-2的上游转录调节因子;利用酵母菌落PCR法获得阳性克隆中的cDNA插入片段,测序后在JGI网站进行Blast分析。结果表明,构建的cDNA文库库容为1.5×106,插入片段大小为250~3000 bp。cDNA 插入片段经测序和Blast同源性分析和定量PCR分析,筛选出1个Metallothionein protein,1个Core histone protein,1个Heavy-metal-associated protein与MeAP2-2相关的调节因子。实验结果证明酵母单杂交文库构建成功,初步筛选获得了调节MeAP2-2的上游调节因子。为研究木薯干旱胁迫下离区发育的信号转导通路奠定了基础。     

重组葡萄糖氧化酶毕赤酵母高产菌株的高通量快速筛选方法

根据葡萄糖氧化酶的反应原理和毕赤酵母诱导表达的机制,本研究建立了葡萄糖氧化酶毕赤酵母表达菌株筛选方法。首先在MM平板中诱导重组子表达葡萄糖氧化酶,然后添加显色液,阳性酵母菌株周围可见显色圈。经过与传统液体培养筛选方法的比较验证,结果表明,该方法灵敏度高,稳定性和重复性好,筛选结果与传统方法一致。当葡萄糖氧化酶活力介于0–0.1 U/ml的范围内,显色圈的绝对面积与酶活力相关系数可达0.63。该平板筛选方法可以从大量毕赤酵母重组子中快速筛选出表达葡萄糖氧化酶的阳性菌株,并可方便地判断出各菌株之间表达水平的差异。同时,该方法也可为筛选其他重组酶毕赤酵母菌株提供参考。     

海岛棉纤维发育相关基因GbPDF2酵母单杂交文库构建及其上游基因解析

为研究棉纤维起始发育的分子调控网络,以海岛棉(Gossypium barbadence L.)品种"海渝"开花当天(0 DPA)胚珠为实验材料,利用酵母单杂交技术来筛选棉纤维起始发育相关基因GbPDF2的上游调控转录因子。首先,克隆GbPDF2的启动子(Accession:KJ475468);构建了该启动子的诱饵融合载体(GbPDF2-PRO)-pAbAi,转入酵母细胞中重组为Y1HGold[Bait-pAbAi]菌株。之后,应用Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System系统构建酵母单杂交cDNA文库,转化重组酵母菌株,通过同源重组筛选GbPDF2的上游转录调节因子。构建的cDNA文库库容为2.23×106,重组率为95.8%,插入片段大小为300 bp~2000 bp,其中大于1000bp的阳性克隆为109个。cDNA插入片段经测序和Blast同源性分析,筛选出2个生长素响应因子,1个WRKY7转录因子,1个WD-repeatprotein 40等与纤维发育相关的转录调节因子,为研究棉纤维起始发育的信号转导通路奠定了基础。     

大黄鱼生长激素在毕赤酵母中的表达

为大量获得具有生物活性的大黄鱼生长激素(Pseucdosciaena crocea,Growth Hormone,pcGH),利用本实验室分离的天然大黄鱼生长激素基因在毕赤酵母表达系统中的表达进行了研究。把pcGH克隆到酵母整合型质粒载体中构建重组表达载体pPIC9K-pcGH,电击转化将pcGH转化进his4缺陷型毕赤酵母GSll5菌株染色体上,经甲醇诱导得以高效表达,SDS-PAGE证实了表达产物为大黄鱼生长激素,表达量约为62.5 mg/L。     

鸡IL-2重组杆状病毒的构建及其病理组织学研究

以鸡白细胞介素2(IL-2)为免疫刺激因子,探讨鸡IL-2重组杆状病毒(BV-LMI-IL-2)对鸡脏器的影响,为IL-2促进疫苗免疫的研究提供理论依据。以IL-2为目的基因,以p LMI为杆状病毒转移载体,构建BV-LMI-IL-2。最终使用BV-LMI-IL-2与新城疫(NDV)抗原疫苗BV-LMI-F进行单独免疫和联合免疫,观察鸡腺胃、肝脏、心脏、十二指肠等器官病理变化情况。免疫和攻毒试验结果显示:BV-LMI-F与BV-LMI-IL-2联合免疫时,保护率提高了12.5%,说明BV-LMI-IL-2对疫苗起到了免疫增强作用,可以作为免疫增强剂使用。对攻毒后的对照组死亡鸡只和免疫组死亡的鸡只剖检,观察病变器官和病理组织切片结果显示,联合免疫组器官无明显病理变化,证明鸡IL-2重组杆状病毒提高了对鸡脏器器官的免疫保护作用。     

ahFAD2基因RNA干扰体的删除筛选标记载体构建及其遗传转化

将Napin启动子与含花生FAD2基因反向重复片段的RNA干扰结构连接,亚克隆至含雌激素诱导重组系统的植物表达载体pNCX相应位点中,构建完成由Napin启动子驱动的FAD2RNAi删除筛选标记表达载体pNCX-FAD2RNAi,经酶切鉴定,获得相应的启动子片段、FAD2RNAi片段及NCX-FAD2RNAi片段.利用农杆菌介导法进行遗传转化,已获得抗性丛生芽214丛.     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a蛋白转肽酶区的原核表达及鉴定

本研究对编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）非青霉素结合蛋白2a（PBP2a）的转肽酶区（TPase）原核表达并进行Western blot鉴定。首先通过PCR方法由MRSA基因组中扩增转肽酶区基因片段,并构建pGEX-6p-1-TPase重组质粒,转化BL-21,诱导目的蛋白表达,然后进行Western blot鉴定。结果表明,成功构建出pGEX-6p-1-TPase原核表达载体,并成功表达出PBP2a的转肽酶区蛋白（TPase）,为其进一步的研究和应用奠定了基础。     

ahFAD2A等位基因在中国花生小核心种质中的分布及其与种子油酸含量的相关性分析

在中国小核心花生种质中发掘出油酰PC脱氢酶的2个等位基因(ahFAD2A-wt和ahFAD2A-m)。研究结果表明:(1)突变型等位基因(ahFAD2A-m)与野生型等位基因(ahFAD2A-wt)在编码区442bp的SNP(448bpGA)可导致编码氨基酸的替换(D150N);(2)突变型基因ahFAD2A-m在中国花生小核心种质中广泛存在,出现的频率为53.1%,野生型基因ahFAD2A-wt出现的频率为46.9%;(3)突变型基因ahFAD2A-m在密枝亚种(普通型和龙生型变种)中出现的频率(82.8%)显著高于其在疏枝亚种(珍珠豆型和多粒型变种)材料中出现的频率(15.4%),卡方测验结果表明,核心种质的油酸含量与其携带的等位基因类型密切相关(χ2=98.71,χ20.01,3=11.34,P0.01),携带突变型基因(ahFAD2A-m)材料的油酸平均值显著高于野生型基因的材料(t=18.48t0.01=2.62,P0.01);(4)ahFAD2A等位基因的存在与种子油酸含量密切相关。     

Identification and inheritance of a new gene for powdery mildew resistance in mungbean (Vigna radiata L. Wilczek)

Powdery mildew (PM) is one of the important foliar diseases of mungbean. Resistance sources have been identified in India and the inheritance studies showed that complete resistance (RO) was controlled by two dominant genes, Pm1 , Pm2 . The breakdown of complete resistance (RO) into moderate resistance (R2) by race-2 (Akola) has been reported. It is assumed that the change in resistance reaction is due to a mutation in the pathogen. The present investigation was carried out with a view to screen germplasm, cultivars and mutants for identification of complete resistance (RO) sources against race-2 and to study their inheritance. 'Mulmarada', a local mungbean cultivar from Maharashtra state of India was identified as a complete resistance (RO) source for race-2. The inheritance of Mulmarada's resistance (RO) was studied. The F₁ and the segregation in F₂ and F₃ showed that the complete resistance (RO) in 'Mulmarada' is controlled by a single dominant gene, which is different from the earlier identified Pm1 and Pm2 resistance genes. Mulmarada's resistance gene is designated as Pm3 for PM resistance.     

玉米o16基因回交渗入o2系的分子标记辅助选择

在高赖氨酸玉米育种中,主要是以玉米opaque-2(o2)突变体作供体回交转育培育亲本材料,再行培育高赖氨酸杂交种。但是,迄今培育的o2玉米系及其杂交种的籽粒赖氨酸含量约为0.4%,不能满足食用和饲用的需求。为了提高o2玉米的赖氨酸含量,本研究利用一个新的高赖氨酸突变基因opaque-16(o16)的载体QCL3021作供体,o2玉米系太系19为受体,将o16基因回交渗入o2玉米系。在回交的每一世代及随后的自交世代,用o2基因内的SSR标记umc1066和o16基因的连锁SSR标记umc1141进行前景选择,再对中选单株进行全基因组SSR标记的背景选择,最后用染料结合赖氨酸法测定籽粒赖氨酸含量,以便保证筛选出遗传背景恢复率和赖氨酸含量均高的目标单株。在BC₂F₄代,获得携带o2和o16基因的家系17个,其遗传背景与o2玉米系相当(恢复率为92%~95%),赖氨酸含量为0.469%~0.599%。其赖氨酸含量比普通玉米平均提高约122.63%;比高值亲本太系19(o2o2)平均提高约22.33%,增幅为6.11%~35.52%;比低值亲本QCL3021(o16o16)平均提高约65.86%,增幅为43.87%~83.74%。表明采用标记辅助选择技术将o16基因回交导入o2玉米,能有效提高玉米籽粒的赖氨酸含量,对高赖氨酸玉米的遗传改良和育种具有重要意义。     

大豆光合气体交换参数的QTL分析

光合气体交换参数是用来表示植物光合能力的常用指标。利用来自大豆品种科丰1号和南农1138-2的重组自交系群体NJRIKY(184个家系)及其分子遗传图谱,通过两年盆栽试验定位与光合速率、气孔导度、胞间CO₂浓度和蒸腾速率有关的QTL。结果表明,4个参数的遗传力中等偏低,在0.48~0.60之间;两两间存在极显著正相关关系,相关系数在0.192~0.686之间;两年共检测到15个QTL,分别位于C1、C2、D2、E、H、I和O连锁群上,LOD值在2.25~6.31之间,贡献率为4.80%~12.30%,;有6个QTL在不同环境下稳定表达,它们分别是控制光合速率的qPnC1.1、控制气孔导度的qSCD2.1和qSCI.1、控制胞间CO₂浓度的qCiI.1和qCiO.1,以及控制蒸腾速率的qTrO.1;检测到4个同时控制两个或两个以上参数的标记区间,它们分别是C1连锁群上控制光合速率和气孔导度的sat_311~sct_191区间,E连锁群上控制光合速率、气孔导度和胞间CO₂浓度的sat_172~satt268区间,I连锁群上控制气孔导度和胞间CO₂浓度的satt726~satt330区间,以及D2连锁群上控制气孔导度和胞间CO₂浓度的sat_296~sat_277区间。     

小麦蛋白质含量分子标记辅助选择的效果分析

对小麦回交后代的蛋白质含量进行了分子标记辅助选择研究。先对2个与蛋白质含量相关的Xgwm570和E41M62-168标记进行验证,表明其与蛋白质含量密切相关。再通过表型选择、分子标记辅助选择(MASBC2)和不加选择(RNDBC2)产生的BC2中,蛋白质含量的平均值和群体中蛋白质含量高于16.5%的植株比例在PHEBC2和MASBC2之间没有显著差异,但均显著高于RNDBC2。对群体中的植株按两分子标记的类型分为A(2个位点)、B(1个位点)和C(无)3大类,蛋白质含量的平均值和植株中蛋白质含量高于16.5%的比例从高到低的排列顺序为:A类植株>B类植株>C类植株。由此看来,利用分子标记辅助选择来培育高蛋白质含量小麦是十分有效的方法。     

普通丝瓜果肉褐变程度的主基因+多基因遗传模型分析

果肉褐变是影响丝瓜品质的重要性状之一,对普通丝瓜果肉褐变程度进行遗传分析,为丝瓜的品质改良奠定基础。以易褐变自交系‘YX014’和耐褐变自交系‘LJ-01’配制成6个世代(P1、P2、F1、F2、B1、B2)为试验材料,应用数量性状主基因+多基因混合遗传模型对丝瓜果肉褐变特性进行遗传模式分析。结果表明：普通丝瓜果肉褐变程度的最佳遗传模型为E-1模型,即由2对加性—显性—上位性主基因+加性—显性多基因控制,且具有耐褐变亲本的优势。B1、B2和F2分离世代的主基因遗传率为81.20%、72.08%和0.52%,多基因遗传率均为0,环境方差占表型方差的比例分别是18.8%、27.92%和99.48%,表明丝瓜果肉褐变程度主要受两对主基因控制,以遗传效应为主,同时受环境影响较大,B1、B2世代主基因选择率高,应在早期世代进行选择。因此,在丝瓜褐变的群体改良中,可对低褐变单株进行定向选择或轮回选择,以提高育种效率。     

粗蛋白含量的快速测定

文章提出用量气法测定粗蛋白含量，在ＰＨ＝８－１０的胡酸钠缓冲介质中，加入过量的次氯酸钙溶液与氨氮反应，量取氮气体积，方法快速，操作简便，分析结果与凯氏法一致。     

大豆对胞囊线虫4号生理小种的抗性遗传分析

大豆胞囊线虫病（Soybean cyst nematode）严重危害我国大豆生产。我国大豆胞囊线虫有8个生理小种,其中,4号生理小种致病力最强,主要分布在黄淮海大豆产区。了解抗源的遗传模式有助于抗病基因的定位和分子标记的开发。以对大豆胞囊线虫4号生理小种高抗抗源CBL黑豆为父本、高感材料品75-14为母本,构建了F₁、F₂和F_2∶3 3个世代群体,利用植物数量性状主基因+多基因混合遗传模型的联合分离分析方法,分析CBL黑豆抗大豆胞囊线虫4号生理小种的遗传效应。结果表明：CBL黑豆对胞囊线虫4号生理小种的抗性受2对加性-显性-上位性主基因和加性-显性-上位性多基因控制,F₂世代主基因遗传率为64.47%,F_2∶3世代主基因遗传率为75.99%。主基因遗传率较高,育种可以在早代选择。