葡萄VvMSA基因的克隆及表达特性分析

为了解VvMSA基因的功能,以抗性葡萄品种Vidal Blanc组培苗为试材,克隆得到VvMSA基因,对其序列进行了生物信息学分析,并利用实时定量PCR分析了其组织表达特性和多种非生物胁迫和信号应答表达特性。结果表明,VvMSA基因片段大小为450 bp,编码149个氨基酸序列。生物信息学分析结果显示,VvMSA蛋白分子量约为16.703 k Da,等电点为5.68,不稳定系数为41.71,推测为不稳定蛋白。VvMSA含有65个氨基酸组成的ABA/WDS保守结构域。在进化上属于单独一个分支,它和已报道过的番茄Le ASR1分别属于同一个祖先进化出的2个分支。实时荧光定量PCR分析显示,VvMSA在葡萄不同组织中均有表达,花中表达量最高。多种逆境胁迫因子如盐、干旱和低温等能诱导VvMSA不同程度的上调表达,盐胁迫3 h时诱导表达量最高。同时,VvMSA受逆境胁迫信号分子NO和H_2S不同程度诱导表达上调,而SA则抑制VvMSA表达。激素ABA、GA_3、IAA和ET均能不同程度诱导VvMSA表达上调,并且VvMSA盐处理下的表达模式与ABA诱导的类似。综合以上结果推断VvMSA可能通过调控ABA信号途径来调节葡萄对盐胁迫应答。     

棉花酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)家族基因的发掘及在非生物胁迫抗性中的功能鉴定

酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)家族基因在植物正常生长发育、响应逆境胁迫及生物膜修复等方面具有重要作用。本研究基于陆地棉(Gossypium hirsutum)遗传标准系TM-1基因组序列信息,鉴定并获得21个棉花ACBP家族基因成员的全序列和染色体定位等信息。聚类分析表明这21个基因分属于I~IV类。依据与拟南芥的同源性,将棉花ACBP家族基因命名为GhACBP1~GhACBP6等6大亚类。转录组分析表明,该家族基因在不同组织、不同发育时期表达差异较大。不同逆境诱导分析表明,GhACBP1、GhACBP3和GhACBP6显著受盐、旱、低温、高温逆境胁迫诱导,而GhACBP4和GhACBP5对逆境胁迫响应不强烈。进一步分析表明,GhACBP3和GhACBP6的表达受过氧化氢(H2O2)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、脱落酸(ABA)和乙烯(ET)的诱导。病毒诱导的基因沉默(VIGS)试验表明,沉默GhACBP3和GhACBP6亚类基因会降低棉花植株对干旱和盐的耐性。目标基因沉默后,植株干物质积累下降,株高变矮,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性降低,丙二醛(MDA)含量升高,表明GhACBP3和GhACBP6在棉花抗旱、耐盐中发挥作用。研究为利用ACBP家族基因进行棉花抗逆性研究及应用提供参考。     

辣椒Whirly基因家族的鉴定及表达分析

为了探索辣椒Whirly基因家族成员的功能和进化关系,通过生物信息学分析了其基因结构、保守基序、进化关系及表达模式,通过荧光定量PCR测定其在脱落酸、高温、低温、疫病等胁迫下的表达量。结果表明,从辣椒CM334中鉴定了2个Whirly基因家族成员,CaWHY1和CaWHY2。辣椒CaWHY1和CaWHY2同其他物种Whirly基因理化性质相比,差别不大,结构相似性高,CaWHY2基因和番茄的SlWHY2基因结构完全一样,在系统进化树中聚在一起。CaWHY1与SlWHY1聚在一起,但它们的基因结构不同,说明Whirly蛋白在进化过程中,结构保守。表达模式分析发现,CaWHY1和CaWHY2在辣椒CM334中均能表达,但在不同组织和果实发育时期的表达水平存在差异。CaWHY1和CaWHY2在不同胁迫处理下受到不同程度的诱导,其中CaWHY1明显受疫病的诱导,CaWHY2在低温处理和脱落酸胁迫下的表达量变化趋势相反。由此可知,Whirly基因家族在辣椒的生长发育中起调控作用,在各种逆境胁迫中也发挥一定作用。     

3个水稻WAX2同源基因表达的组织特异性及逆境响应特征

利用拟南芥的WAX2基因序列BLAST检索出3个水稻同源基因,命名为OsWAX2-1、OsWAX2-2和OsWAX2-3,与拟南芥WAX2基因的同源性分别为56.0%、55.2%和52.0%;其预测的编码蛋白与WAX2蛋白的同源性分别为61.5%、60.5%和64.7%。这3个蛋白都分别存在4个跨膜结构区和1个甾醇去饱和酶的保守区,说明它们都属于跨膜蛋白并可能与角质层的蜡质合成有关。采用半定量RT-PCR方法检测3个OsWAX2基因在水稻不同部位的表达情况,及高温、低温、NaCl、PEG和ABA5种处理对3个OsWAX2基因在转录水平表达的影响。结果表明,3个OsWAX2基因在水稻中的表达存在时空差异,3个基因在水稻萌动的胚中表达量都很高,OsWAX2-3基因在叶中的表达量最高;3个OsWAX2基因对高温、低温、盐、干旱及ABA胁迫响应也存在差别,OsWAX2-1只在ABA处理时增强表达;OsWAX2-2受高温、低温、盐、干旱胁迫及ABA诱导并且响应迅速。这一结果为进一步研究OsWAX2基因在水稻生长发育过程及逆境胁迫下的功能与作用机制提供了参考。     

酸枣肌醇半乳糖苷合成酶ZjGolS2基因的克隆及表达分析

肌醇半乳糖苷合成酶是催化棉子糖系列寡糖合成的关键酶,在植物抗逆生理过程中具有重要作用。本研究根据酸枣高温胁迫转录组数据,成功从酸枣幼苗叶片中克隆到1个肌醇半乳糖苷合成酶基因ZjGolS2,包含一个1 017 bp的开放阅读框,编码338个氨基酸,蛋白分子量为38.82 kD,GenBank登录号为XM_016044622.2。系统进化树分析表明,酸枣ZjGolS2编码氨基酸与葡萄VvGolS3 (Vitis vinifera, ARS22082.1)、海岛棉GbGolS (Gossypium barbadense, KAB1995026.1)亲缘关系最近。该基因在根、茎和叶片中均有表达,其中在叶片中的表达量最高;在45℃处理3和6 h后较对照表达量差异不显著,12和24 h后ZjGolS2基因表达量分别提高了1.82和2.08倍,这说明ZjGolS2受高温逆境诱导。同时本研究成功构建了表达载体pCambia-1300-ZjGolS2。本研究结果为进一步研究ZjGolS2基因的功能提供理论基础,并为提高果树耐高温能力和分子育种提供参考依据。     

四个苹果MdCBF基因克隆与表达分析

为了筛选出苹果中的抗冻负调控基因,培育抗冻苹果新品种奠定基础,通过生物信息学的方法从苹果中克隆了4个具有完整开放阅读框的CBF基因,命名为Md CBFL1~Md CBFL4。通过与其他植物CBF/DREB蛋白氨基酸序列的多重比对发现,这4个蛋白具有CBF蛋白典型的结构特点,即1个AP2结构域,2个特征序列,即核定位信号区PKRPAGRTKFRETRHP和DSAWR保守序列。从系统进化树中可以看出苹果Md CBFL1~Md CBFL4蛋白与At DREB1蛋白聚在A-1亚族,推测它与拟南芥A-1转录因子功能相似,Md CBFL1~Md CBFL4蛋白表达受干旱、盐碱、低温等逆境胁迫的诱导。采用半定量RT-PCR的方法检测分析苹果中Md CBFL1~Md CBFL4基因在高盐(200 mmol/L Na Cl)、干旱和低温处理下基因的表达情况,结果表明,Md CBFL1基因对低温、干旱、盐胁迫3种逆境胁迫均有一定程度的响应,Md CBFL2~Md CBFL4基因受低温与高盐的诱导。为进一步阐明苹果Md CBF基因在逆境应答中的功能、机制提供了有益线索。     

烟草乙烯反应突变体的抗冷性及机理分析

为了深入研究乙烯在植物抵抗逆境胁迫中的作用,以烟草为模式植物,利用幼苗对外源乙烯的"三重反应",筛选得到了40多个乙烯不敏感突变体,其中多数突变体具有较强的抗冷性;从中选取4个突变体株系,对它们耐受低温胁迫的生理基础和作用机理进行了分析。结果表明,低温(0℃)胁迫下,烟草乙烯不敏感突变体的电解质渗透率显著低于野生型,而抗氧化酶活性(POD、SOD)以及过氧化氢酶(CAT)活性都高于野生型,说明突变体具有抵抗低温胁迫的优势生理基础。进一步研究发现,低温(0℃)胁迫下,烟草突变体中冷诱导基因Nt CBFs和Nt COR47呈现高水平表达,乙烯信号传导途径中下游基因ERFs的表达也发生显著变化。这些研究为烟草乙烯不敏感突变体株系具有较强的抗冷性提供了直接的分子证据。     

番茄冷诱导基因SlCMYB1的克隆及其在水稻中异源表达研究

从番茄中克隆了一个编码MYB转录因子家族R2R3-MYB亚类基因SlCMYB1。不同逆境胁迫下的表达模式分析结果表明,该基因受低温、高盐、干旱和ABA胁迫诱导表达。洋葱表皮亚细胞定位研究表明,SlCMYB1为核定位蛋白。为深入了解SlCMYB1基因与非生物逆境应答的关系,我们构建了SlCMYB1基因过表达载体来转化水稻,获得了16个转基因水稻株系。SlCMYB1在水稻中异源表达能显著提高转基因水稻植株的苗期抗冷性,增加脯氨酸合成的关键酶基因OsP5CS1,膜转运蛋白基因OsWCOR413等低温胁迫应答基因的表达水平,这暗示着SlCMYB1与OsP5CS1、OsWCOR413基因处于同一低温调控信号转导路径。本研究结果为通过遗传工程操控低温信号通路的方法改良冷敏感植物抗冷性提供了理论基础。     

辣椒3-磷酸甘油醛脱氢酶基因CaGAPB的克隆及表达分析

本实验采用RT-PCR和RACE的方法,我们从辣椒叶片中克隆到3-磷酸甘油醛脱氢酶β亚基基因(CaGAPB)的全长序列,基因编码区共1 359 bp,编码452个氨基酸。生物信息学分析显示,该基因编码的蛋白分子量为48.2 kD,等电点6.52;进化树分析表明CaGAPB与同为茄科的番茄、马铃薯、烟草以及葡萄科的葡萄GAPB处于同一进化枝上,表现出较近的亲缘关系,其氨基酸序列同源性达到95%以上;荧光定量分析发现,CaGAPB基因可以被低温处理显著诱导表达,而其他的一些胁迫(NaCl,机械损伤,PEG,甘露醇)和信号分子(乙烯利,H_2O_2,SA)处理均会抑制其表达,同时非生物胁迫DC3000侵染对其表达无影响。综上所述,CaGAPB可能是同辣椒的低温抗性相关,其具体功能有待于进一步的研究。     

海岛棉转录因子基因GbMYB60的克隆、表达及其抗逆性分析

MYB转录因子是在真核生物细胞内广泛存在的一类转录因子蛋白,在植物的生长发育、代谢调节、抗病抗逆、以及激素介导的信号路径等方面都发挥着重要的作用。本研究从海岛棉品种海7124中克隆得到一个MYB转录因子基因,根据序列同源性和进化分析,将其命名为GbMYB60。该基因序列长990 bp,编码一个36.9 kD的R2R3类MYB转录因子蛋白。GbMYB60蛋白被特异地定位于植物细胞核。GbMYB60基因的表达水平较低,在真叶中优势表达,根系中表达量最低。该基因受甘露醇、NaCl、低温、高温等非生物逆境,以及脱落酸、乙烯利、茉莉酸甲酯和水杨酸等植物激素的诱导上调表达。利用病毒诱导的基因沉默技术在海岛棉中干涉GbMYB60发现,降低GbMYB60基因的表达水平,使棉花幼苗对高盐胁迫的耐受性降低;但GbMYB60干涉的植株在甘露醇溶液的处理下与对照植株并无显著的抗性差异。     

玉米干旱诱导表达基因ZmCKS2的克隆与表达分析

在本实验室前期研究的干旱胁迫相关的抑制差减文库(SSH)中,发现一个玉米干旱胁迫诱导表达的EST序列,与拟南芥AtCKS2和AtCKS1基因有较高的同源性。应用生物信息学手段和同源克隆的方法,分离得到该基因,命名为ZmCKS2。序列分析表明该基因开放阅读框区267bp,编码88个氨基酸。ZmCKS2蛋白含有真核生物中高度保守的CKS(cyclin-dependent kinase regulatory subunit)结构域。应用在线分析软件预测该基因上游2kb序列表明,该序列具有启动子的核心序列和增强子序列,同时还具有与干旱等多种逆境胁迫相关的调控序列。应用实时荧光定量PCR分析表明该基因在幼穗中表达量最高,且受干旱和MeJA诱导上调表达,受低温和外源ABA诱导下调表达。     

玉米液泡ATP酶亚基A基因的克隆及表达分析

V-ATPase在植物应对非生物胁迫中起着十分重要的作用, 对其关键亚基基因的克隆及分析有助于阐释其在逆境下的调节及响应机制。本文利用RACE技术从玉米自交系CN165花期水分胁迫下的总RNA中克隆出液泡ATP酶亚基A基因, 命名为ZmVHA-A。该基因cDNA全长2 414 bp, 含5′-UTR(293 bp)、3′-UTR(257 bp)及编码区(1 863 bp), 编码620个氨基酸。序列比对及结构域预测结果表明, ZmVHA-A基因编码的氨基酸序列与亲缘关系比较接近的禾本科作物如水稻、小麦和大麦的氨基酸序列同源性分别达92.7%、89.8%和89.8%, 且在编码蛋白的氨基酸序列上有两个与核苷酸的磷酸基团相互作用的保守结构域“GAFGCGKT”和“PSVNWLISYS”, 可见该亚基是相对保守的。Northern杂交分析结果表明, ZmVHA-A基因在花丝中被水分胁迫诱导表达且在苗期对盐胁迫、冷处理和ABA处理具有不同的表达响应方式, 因此认为VHA-A基因是一个比较保守的功能亚基,并且通过转录表达调节参与了V-ATPase对逆境胁迫的适应。     

河北杨脱水素基因(Phdhn1)的克隆与胁迫表达分析

为了鉴定河北杨中的脱水素基因并研究其在逆境胁迫中的表达规律,以初步分析脱水素基因在河北杨逆境胁迫中的调控功能,在实验室前期工作的基础上设计引物,通过PCR方法扩增河北杨cDNA文库获取脱水素基因,并通过半定量RT-PCR方法研究其在逆境中的表达情况。结果表明,河北杨脱水素全长基因856 bp,共编码227个氨基酸。同源性分析表明,河北杨中的脱水素基因与已知的其他杨树脱水素高度同源,因此将该基因定名为Phdhn1。半定量RT-PCR结果表明在干旱、低温、高温、高盐及ABA溶液不同时间段(0、0.5、1、2、5、10、24 h)的胁迫下,河北杨Phdhn1在干旱、ABA以及低温胁迫下均出现表达差异。该研究初步阐述了Phdhn1的逆境表达模式,说明了Phdhn1在河北杨逆境胁迫中起到的重要作用。     

木薯转录因子基因MeHDZ14的克隆与分析

HD-Zip家族基因在植物生长发育和逆境胁迫中起重要作用。为了研究MeHDZ14基因在非生物胁迫(尤其是干旱)应答中的作用,选用对干旱信号反应灵敏、相对耐旱的木薯品种"SC124"作为实验材料,利用RT-PCR克隆了MeHDZ14基因。生物信息学分析发现,MeHDZ14基因编码的蛋白具有典型的HD-Zip保守结构域。将该基因编码的蛋白与GFP融合,亚细胞MeHDZ14:GFP重组蛋白定位于细胞核。同时,酵母Y187中的转录自激活试验结果也表明,MeHDZ14蛋白具有明显转录自激活功能。推断MeHDZ14是一个典型的HD-Zip I转录因子。MeHDZ14启动子区具有多个ABA响应元件ABRE(ABA response element)。基因差异表达分析结果表明,MeHDZ14基因在叶片和根中的表达受干旱胁迫的诱导,并对外源ABA具有明显的响应。因此,认为MeHDZ14基因通过ABA依赖信号传导途径参与调控木薯干旱响应。此外,还发现MeHDZ14基因的编码区虽然存在数个SNP,但表现出高度保守性,且在不同木薯品种中的表达对干旱胁迫均有明显的响应,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

含异位表达花生AhNCED1基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力

AhNCED1是干旱胁迫下调控花生ABA生物合成的关键基因。以pCAMBIA1301为基本双元表达载体,分别构建CaMV35S启动子和拟南芥AtNCED3基因启动子(AtNCED3p)驱动花生AhNCED1基因的2个植物双元表达载体p35S::ORF和pAtNCED3p::ORF,通过根癌农杆菌介导法将上述两个表达载体分别转化野生型和129B08/nced3突变体拟南芥,经潮霉素筛选和PCR鉴定分别获得35S::ORF-WT和A3p::ORF-B08转基因植株,RT-PCR证实花生AhNCED1基因已在转基因植株中稳定表达,并对野生型、129B08/nced3突变体和转基因拟南芥进行外源ABA敏感性和耐渗透胁迫能力分析。结果表明,129B08/nced3突变体对外源ABA的敏感性下降,而花生AhNCED1基因在拟南芥中的异位表达提高了对外源ABA的敏感性。在山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体种子的相对萌发率明显低于野生型的,而A3p::ORF-B08转基因拟南芥种子的相对萌发率与野生型的相当,显著高于129B08/nced3突变体的,且300mmolL–1山梨醇胁迫下,35S::ORF-WT转基因拟南芥种子的相对萌发率明显高于野生型的。在300mmolL–1山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体幼苗叶片高度黄化,根的形成和幼苗生长受到严重抑制,而A3p::ORF-B08转基因突变体与野生型相似,叶片仅轻度黄化,幼苗生长势良好;35S::ORF-WT转基因植株幼苗生长未受明显影响。这些结果说明,拟南芥129B08/nced3突变体对山梨醇诱导的非离子渗透胁迫有超敏性,异位表达花生AhNCED1基因能恢复该突变体对山梨醇的超敏性,提高拟南芥的耐渗透胁迫能力。     

谷子PP2C基因家族的特性

PP2Cs (2C type protein phosphatases)是一种单体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,在真核生物中,PP2Cs在脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)等激素信号传导途径中起着重要的调控作用。本研究通过序列比对,从谷子基因组中筛选出80个PP2C候选基因,聚类分析将其分为12个亚族(A、B、C、D、E1、E2、F1、F2、G、H、I、J)。与拟南芥PP2C基因家族比对表明,A~I为2个物种共有的亚族,J亚族只存在于谷子基因组中,L亚族只存在于拟南芥中。将谷子A亚族的10个成员命名为SiPP2CA1-10。基因表达谱分析表明,A亚族基因不同程度受ABA、干旱、高盐、低温和低氮诱导表达,其中,SiPP2CA6、SiPP2CA8在5种处理下诱导表达量都高。对10个A亚族成员的启动子分析发现,在这些基因的启动子序列中含有多种参与逆境胁迫应答的顺式作用元件,其中,SiPP2CA5、SiPP2CA6、SiPP2CA7、SiPP2CA8的启动子中含有参与低氮胁迫响应的元件。进一步研究发现,SiPP2CA8主要在根部表达,且在低氮胁迫下一直有较高的表达水平。亚细胞定位结果显示SiPP2CA8定位在细胞膜、细胞质、细胞核中;双分子荧光互补试验(BiFC)结果表明,SiPP2CA8与一个ABA受体类似蛋白SiRCAR3(基因号Si018317m.g)在细胞膜、细胞质及细胞核上互作,表明SiPP2CA8在谷子中可能参与ABA信号传导过程。     

Expression and Regulation of the Plant Gene Under Enviromend Stress

To investigate the adaptation mechanisms of plant gene under adversity stress.By looking up the recent literatures dealt with the plant's adaptation and response to adversity stress and reviewing previous works on the plant's adaptation mechanisms under adversity stress.Unavoidably,plant is influenced by all kinds of adversity stresses because of its immobility.But it can adapt and resist effectively to adversity stress by itself.Many researches show that under adversity stress contents of ABA and SA in the plant cells are changed apparently wiich induced many new genes expression and protein synthesis to adapt environment's change.There may be two kinds of mechanisms of the plant's adaptation to adversity stresses. 1. ABA and SA induce the synthesis of mRNA or stabilization of mRNA. 2. ABA and SA can cause the responsive proteins' accumulation and regulation after translation.     

花生NAC转录因子AhNAC2和AhNAC3的克隆及转录特征

NAC转录因子是特异存在于植物中具有多种生物功能的新型转录因子。本实验从花生中克隆了2个NAC基因AhNAC2和AhNAC3(GenBank登录号EU755023和EU755022);蛋白序列分析表明,两者具有典型NAC转录因子特征,N端含有保守NAC结构域。半定量RT-PCR显示,在ABA和GA₃处理,以及控水和低温条件下,AhNAC2和AhNAC3在花生组织中的表达上调,呈现不同的表达模式。AhNAC2和AhNAC3为典型的NAC转录因子新基因,蛋白序列与拟南芥RD26同源性较高,推测与响应干旱和ABA信号有关。