葡萄肌醇半乳糖苷合成酶基因VvGolS2-4的克隆及表达特性分析

为了研究葡萄肌醇半乳糖苷合成酶基因家族的特性,以抗低温品种左优红组培苗为材料,通过同源克隆技术,获得VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4全长CDS,对其序列进行了生物信息学分析,同时利用实时定量PCR技术探究了3个基因的组织表达特性和响应逆境因子及相关信号分子的特性。结果显示:3个基因c DNA大小分别为954,978,1 011 bp,分别编码317,325,336个氨基酸序列;3个蛋白分子量分别为36.65,36.97,38.12 k Da;等电点分别为5.12,5.33和5.16,且均在C端含有一个疏水的五肽APXAA;实时荧光定量PCR证明,3个GolSs在葡萄不同组织中表达情况不同,VvGolS2和VvGolS4在叶片中表达量最高,而VvGolS3则在花和卷须中表达量最高;不同逆境因子及逆境信号分子均会影响VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4基因的表达量,其中VvGolS2和VvGolS4基因的表达受盐诱导最明显,VvGolS3基因的表达受低温诱导最明显;另外,胁迫信号分子乙烯、过氧化氢和脱落酸均可诱导VvGolS2基因表达量上升,而VvGolS3基因的表达受脱落酸和乙烯的诱导,乙烯、过氧化氢和硫化氢则均可诱导VvGolS4基因表达量上升。综上推测,3个Vv GolSs均与葡萄抵御逆境胁迫相关,但各自功能可能有所不同。     

蒜芥茄SsUBC基因的克隆及表达分析

本研究从蒜芥茄中克隆得到泛素E2结合酶UBC基因编码区序列,命名为SsUBC,登陆Gen Bank,编号:MF872897。SsUBC基因编码区全长859 bp,编码272个氨基酸。进行进化树分析,SsUBC编码的氨基酸序列与番茄和马铃薯等茄科植物有较近的亲缘性。利用荧光定量PCR技术分析SsUBC基因在蒜芥茄各器官表达特征和不同非生物胁迫处理下(镉,高温,干旱,盐和脱落酸)根部和叶片的表达特性。结果表明,SsUBC基因表达在不同器官中具有差异性,且叶片中表达量最高。非生物胁迫处理后叶片中SsUBC基因表达变化比根部中更为显著,除盐胁迫外,其它四种处理条件下该基因在叶片中的表达量均高于根部,其中高温胁迫下表达量升高变化最为显著。除盐胁迫外,叶片中基因的表达均为上调趋势,而干旱胁迫下根中该基因表达为下调趋势。综上,SsUBC基因在蒜芥茄响应镉(1 h)、高温(1 h)、干旱胁迫(1 h)时的应答较为迅速,其次为脱落酸(9 h),且响应部位为叶片;而在盐胁迫(12 h)下应答相对较为迟缓。     

木薯中肌醇半乳糖苷合成酶基因在大肠杆菌中的表达

本研究利用从木薯中克隆到的肌醇半乳糖苷合成酶基因构建到高效表达载体pGEX-6p-1上,构建重组载体MeGolS5-p GEX,并对GST-MeGolS5融合表达的IPTG诱导浓度、诱导不同温度、不同菌液浓度和诱导时间等条件进行优化。研究结果表明:随诱导时间增长GST-MeGolS5融合蛋白表达量提高,在37℃时,OD600为0.4左右,诱导4 h MeGolS5-GST融合蛋白的表达量达到最大,在0.2 mmol/L IPTG浓度下,可以有效诱导MeGolS5-GST融合蛋白的表达;MeGolS5重组菌株可以耐受5%的PEG6000模拟的干旱胁迫。本研究结果可为解析MeGolS5基因的功能以及在木薯抗旱过程中的作用机理提供参考。     

低温诱导泡核桃中查尔酮合成酶基因克隆及功能分析

查尔酮合成酶是植物中黄酮类物质生物合成的第一关键酶,在植物抗性生理中扮演重要作用。本研究利用RT-PCR技术从泡核桃中成功克隆获得一个受冷害诱导的查尔酮合成酶基因(Js CHS1),其基因全长1 490 bp,包含1个内含子,开放阅读框全长为1 170 bp,编码389个氨基酸,登录号为:KX657834。JSCHS1与核桃查尔酮合成酶蛋白序列同源性高达98%,而泡核桃和核桃查尔酮合成酶基因内含子DNA同源性为95%,核桃CHS内含子与泡核桃相比有8个碱基的缺失。系统进化树分析显示其与核桃形成一个独立分支。半定量PCR显示:泡核桃在常温及低温(4℃)处理后都有微弱表达,而在低温处理6 h后强烈表达,这说明Js CHS1是典型的受冷害诱导的查尔酮合成酶基因。本研究为揭示泡核桃抗寒机理以及查尔酮合成酶在冷害胁迫下的作用提供研究基础,并为利用基因工程手段培育抗寒新品种提供理论依据。     

膜荚黄芪C4H基因的克隆及表达分析

本研究采用RACE技术从膜荚黄芪中克隆得到两个肉桂酸-4-羟基化酶Am C4H1与Am C4H2,并进行了生物信息学分析;研究了Am C4H1与Am C4H2在根、茎和叶中的表达量与毛蕊异黄酮及其糖苷含量之间的相关性。结果表明,克隆得到的Am C4H1与Am C4H2基因均编码505个氨基酸,属于不稳定蛋白和亲水性蛋白,Am C4H1与Am C4H2基因编码氨基酸序列上的差异导致二级结构与三级结构不同。Am C4H2基因在根、茎、叶中的表达趋势与毛蕊异黄酮及其糖苷的含量基本一致,推测其参与了毛蕊异黄酮及其糖苷的生物合成,这为通过分子手段提高毛蕊异黄酮及其糖苷的含量提供了理论参考。     

香菇疏水蛋白hyd1基因高温胁迫下表达与生物信息学分析

为了探讨香菇中疏水蛋白hyd1基因在高温胁迫下的变化情况,进而研究提高香菇对高温的耐受性。本研究首先找出香菇中疏水蛋白hyd1基因序列,筛选出耐高温的香菇菌株18N44和高温敏感型的菌株18为研究对象,比较了高温胁迫下疏水蛋白hyd1基因在香菇两菌株中的相对表达量差异,最后对hyd1基因所编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析。实时荧光定量PCR结果显示,在整个高温胁迫期间(4 h除外),香菇菌株18N44的hyd1基因表达量显著高于18;生物信息学分析结果显示,香菇hyd1基因所编码的蛋白质由127个氨基酸组成,属分泌型蛋白,含多个功能位点,与平菇的亲缘关系较近。hyd1基因高温胁迫下表达与生物信息学分析可为香菇耐高温相关机制的进一步研究提供理论参考。     

番茄SlWRKY6基因克隆及其在重金属胁迫下的表达分析

为了揭示SlWRKY6基因与植物重金属胁迫的相关性,通过RT-PCR的方法从番茄中克隆得到SlWRKY6基因,该基因序列号为:NM_001365762.1。生物信息学分析结果表明,该基因含有一个长度为1 342 bp的完整开放阅读框,编码447个氨基酸残基。该基因编码的蛋白含有一个WRKY结构域,属于典型的GroupⅡ亚家族成员。系统进化分析表明,与番茄SpWRKY31氨基酸序列之间的亲缘关系最近。组织特异性分析表明,SlWRKY6基因在番茄的不同组织中均有表达,在老叶中表达量最高。实时荧光定量PCR分析结果表明,SlWRKY6基因在3种重金属(CdCl_2、CuCl_2、HgSO_4)胁迫下均上调表达,且在Cd和Cu胁迫下番茄根部的表达量较高。CdCl_2胁迫下,SlWRKY6基因在番茄根中受胁迫诱导显著高于叶中;CuCl_2胁迫下,番茄叶中SlWRKY6基因表达量在3 h时达到最大值后降低,而根中的SlWRKY6基因水平随着浓度增加而下降;HgSO_4胁迫下,根部和叶片该基因的表达量显著高于对照(0 h),并随着HgSO_4胁迫时间延长,SlWRKY6基因相对表达量在番茄根和叶中呈现相反的趋势。综上,本研究获得了SlWRKY6基因的编码区序列,并初步阐述了番茄SlWRKY6基因在3种重金属胁迫下的表达情况,为筛选番茄中响应重金属胁迫功能基因的研究提供了研究基础。     

甘薯抗逆相关基因IbERF3的克隆与表达分析

为了提高甘薯的抗逆能力,通过RACE的方法克隆到一个含有AP2结构域的ERF家族基因,该家族基因在植物逆境调控中起重要作用。该基因cDNA全长1025 bp,编码区为669 bp,编码223个氨基酸,该基因在甘薯中未曾报道,将其命名为IbERF3。通过进化树分析发现,IbERF3在茄目类作物中具有一定的保守性。通过定量PCR研究发现,IbERF3在甘薯根、叶中都有表达,且在叶片中的表达量最高,同时研究发现,在干旱、盐胁迫处理后IbERF3在根和叶片中表达量都显著上升。在用植物激素ABA处理后,IbERF3的表达量逐渐上升并在24 h时达到最大。因此,推测IbERF3在甘薯抗逆途径中起重要作用。     

百合花青素苷合成酶基因片段的克隆及表达分析

为了克隆百合花青素苷合成酶基因(anthocyanidin synthase, ANS),通过已报道的其他物种的ANS基因保守序列设计简并引物,采用同源克隆的方法成功克隆得到了百合ANS基因片段,该片段长701 bp,编码233个氨基酸残基。根据蛋白比对结果,百合ANS基因编码的氨基酸序列与郁金香、荷兰鸢尾、甜樱桃的一致性分别为86%、81%、77%。采用半定量RT-PCR法分析表明,该基因在百合花瓣中的表达水平最高,叶和茎次之,鳞茎中不表达。本研究从百合中分离得到了ANS基因片段,为后续获得基因全长打下了基础。     

水稻木质部中游离氨基酸的转运对外界氮素水平的响应

木质部长途运输的氨基酸是水稻地上部所需氮素的重要来源,但木质部氨基酸转运响应外界氮素的详细过程和调控机制并不清楚。本研究通过高氮、缺氮处理分析了苗期水稻木质部汁液中的游离氨基酸组分与含量。结果表明,木质部汁液中游离氨基酸的转运强烈响应外界氮素水平,且在短时间内(6 h)即可发生;高氮、缺氮培养可对应显著提高或降低木质部中的总游离氨基酸以及大多数游离氨基酸组分的含量,其中谷氨酰胺(Gln)受氮素处理变化最大,且在不同氮水平下均是含量最高的游离氨基酸,其次是天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)等;本研究还发现22个氨基酸转运蛋白编码基因对氮素缺乏有较明显的响应,其中OsAAP7、OsAAP13、OsATL6和OsATL12等基因在根部维管及附近组织的表达量较高,可能直接参与了木质部氨基酸的转运;此外,根部谷氨酰胺合成酶基因OsGS1;2和天冬酰胺合成酶基因OsAS1在缺氮条件下的表达量下降,可能是导致该条件下木质部氨基酸运输减弱的原因之一。本研究为探究水稻氮素转运和利用提供了重要参考。     

白粉菌(Erysiphe graminis)侵染诱导表达的小麦糖苷水解酶基因TaGlc2的克隆与鉴定

真菌病害是世界小麦生产中的最重要的病害之一。目前,在小麦中已经鉴定出一批小麦病菌侵染诱导基因,包括病程相关基因和抗真菌水解酶基因（葡聚糖酶基因和几丁质酶基因）。最近的研究表明,植物1,3-β-葡聚糖酶参与对真菌侵染的防卫。本研究从小麦cDNA文库中克隆出一个编码小麦1,3-β-葡聚糖酶的新基因,命名为 TaGlc2。该基因编码的氨基酸序列与糖苷水解酶基因家族17高度同源。采用实时定量PCR分析方法对TaGlc2基因在白粉菌侵染(Erysiphe graminis)后小麦叶片中的表达模式进行研究,发现TaGlc2基因在白粉菌侵染6 h后表达明显增强,至24 h达到峰值,说明该基因受白粉菌侵染诱导表达。还获得了TaGlc2基因5'上游调控区序列,发现存在与病菌侵染响应有关的顺式元件。小麦TaGlc2基因在小麦白粉病抗性上可能具有重要作用。     

过量表达大豆异丙基苹果酸脱氢酶基因Gm IPMDH促进植株开花和生长

异丙基苹果酸合成酶(isopropylmalate synthase, IPMS)和异丙基苹果酸脱氢酶(isopropylmalate dehydrogenase,IPMDH)是亮氨酸生物合成中的重要限速酶,但二者在植物生长发育中的功能鲜有报道。本研究对拟南芥AtIPMDH2基因在大豆中的同源基因GmIPMDH进行了克隆和分析。该基因编码的氨基酸序列中含有Iso＿dh亚家族保守结构域,且启动子中含有大量的光反应元件及激素应答元件。实时荧光定量PCR显示大豆叶片中GmIPMDH的表达量随着植株的生长发育逐渐升高。对GmIPMDH进行了烟草的异位表达和大豆的过量表达,表型分析发现GmIPMDH的过量表达显著提前了烟草和大豆的开花时间,且株高和节数均显著增加。转录组分析显示, GmIPMDH过量表达大豆叶片中的若干开花相关基因及赤霉素合成相关基因的表达量发生变化,推测GmIPMDH可能通过赤霉素合成通路参与赤霉素介导的植物开花诱导和株型调控。本研究首次阐明了GmIPMDH在开花期调控中的作用,为今后进一步研究GmIPMDH调控大豆开花和生长发育的分子机制提供了一定的基础。     

甜菜磷脂酰肌醇转运蛋白基因SbSEC14的克隆及低温胁迫下的表达分析

磷脂酰肌醇转运蛋白(PITPs)广泛存在于真核生物细胞中,能够在体外膜脂质双层之间调控磷脂酰肌醇(PtdIns)或者磷脂酰胆碱(PtdCho)单体的独立转运。参与磷酸肌醇代谢、膜运输、极性生长、信号转导、逆境胁迫、胞浆运动和细胞周期调节等多种重要的生命过程,在植物的逆境响应以及发育调节中具有重要的作用。为了研究甜菜磷脂酰肌醇转运蛋白基因及其在低温胁迫下的表达情况。本研究以甜菜基因组数据库中一条预测的磷脂酰肌醇转运蛋白基因CRS1为模板,用基因克隆的方法得到一条全长765 bp,开放阅读框596 bp,编码198个氨基酸的甜菜SEC14基因,命名为SbSEC14。理化性质分析表明,该蛋白质为不稳定亲水蛋白;蛋白质二、三级结构分析表明,该蛋白质α-螺旋所占的比例最高,为47.47%,β-转角所占比例最低,为5.56%;蛋白质保守结构分析表明,该蛋白质有典型的SEC14结构域;蛋白质系统进化树分析表明,甜菜SbSEC14基因与菠菜、藜麦的磷脂酰肌醇运转蛋白基因亲缘关系最近;实时荧光定量结果表明,SbSEC14基因在甜菜中组成型表达,在甜菜叶中的表达量最高,在甜菜根中的表达量最低,在叶中表达量约为根中的2.5倍。甜菜幼苗4℃处理0、2、6、12、24 h,该基因在植株处理0~2 h时表达量呈上升趋势,在植株处理2~6 h时表达量呈下降趋势,在植株处理6~24 h时表达量趋于平稳状态。因此,预测该基因与甜菜抗低温胁迫相关。     

玉米光周期敏感类Hd6基因的克隆和实时定量表达分析

水稻Hd6基因在调节水稻光周期敏感中起重要作用。本研究以热带玉米自交系CML288为材料, 利用同源基因克隆法结合3¢RACE技术克隆了与水稻Hd6基因同源的玉米类Hd6基因。该基因序列中999 bp的开放阅读框可编码332个氨基酸。BLAST分析发现, 该基因与玉米中编码蛋白激酶CK2的一个基因高度同源, 所推测的氨基酸序列包含2个CK2活性区域, 1个N末端区域, 1个ATP结合位点和1个丝氨酸/ 苏氨酸蛋白质激酶活性位点,与玉米、小麦、水稻和拟南芥的CK2氨基酸序列也有较高的同源性。建立了SYBR GREEN法实时荧光定量RT-PCR表达分析系统, 研究了不同光周期处理下类Hd6基因在光周期敏感自交系CML288茎尖和叶片中的表达。结果发现, 该基因在茎尖和叶片中均有表达。在短日条件下, 该基因在6~8叶期茎尖中的表达量存在明显差异, 在光周期敏感的7叶期出现表达高峰, 在叶片中的表达量均低于茎尖。在长日条件下, 该基因在茎尖中6叶期表达量较低, 在光周期敏感的9叶期在叶片中高量表达。由此可推测, 该基因与玉米光周期敏感密切相关, 可能在光周期敏感调节过程中发挥一定的作用。     

芒果GGPPS小亚基基因的克隆、进化和表达分析

香叶基焦磷酸(GPP)是香味成分单萜的前体物质,而香味是芒果重要的品质性状。本研究克隆了芒果中GPP合成关键酶基因,即香叶基香叶基焦磷酸合成酶小亚基基因(MinGGPPSssu),并开展了系统进化分析和表达分析。从芒果栽培品种贵妃芒的新鲜叶片中提取DNA和RNA,根据转录组测序拼接结果设计引物扩增得到Min GGPPSssu全长约1 kb的c DNA序列。通过测序、多重比对和聚类分析,证实该片段属于GGPPSssu的全长基因,且为最大的ORF。与近缘物种苦楝GGPPS1(KM108317)氨基酸序列同源性为83%。蛋白质序列分析表明该序列含有1个DDx_(2-4)D保守基元和一个Cxxx C基元。我们选取了拟南芥中12个GGPPS基因、2个FPPS基因、2个SPPS基因、一个GPS基因及其他物种的相关基因,通过聚类分析,将Min GGPPSssu聚类到香叶基香叶基焦磷酸合成酶小亚基所属的枝。表达分析表明,该基因在叶片中表达量最高,茎部表达量较低。果皮和果肉在芒果成熟前后表达量相似,但是在果皮中的表达量约为果肉表达量的3倍,推测其与果皮及叶片香味调控相关。     

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的克隆及表达分析

以苎麻 [Boehmeria nivea (Linn.) Gaud.] 栽培种湘苎3号为材料, 通过简并引物RT-PCR结合RACE技术首次成功克隆苎麻纤维素合成酶基因BnCesA1 5′端450 bp序列以外的全部cDNA 序列, 序列长3 276 bp, 编码一段938个氨基酸的蛋白质。经基因比对及蛋白质结构分析确证是苎麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析显示：BnCesA1在苎麻根、茎、叶和芽组织中均有表达, 其表达量为茎＞叶＞芽＞根, 相对表达量依次为 0.791、0.381、0.319和0.183。从其表达模式可以推测该基因同时参与了苎麻细胞初生和次生细胞壁纤维素的合成。     

桂花香气相关基因DXPS基因克隆及表达分析

本研究以四季桂花瓣和叶为材料,采用RT-PCR和RACE技术获得四季桂DXPS基因c DNA全长,并用凝胶定量软件Quanlity-One对四季桂不同季节花瓣和叶片及不同花期花瓣的半定量PCR产物的凝胶图像进行分析。结果表明,四季桂DXPS基因c DNA全长2 185 bp(Gen Bank登录号:KT099324),其中阅读框长1 926 bp,编码641个氨基酸,含有保守功能结构域TPP-DXS、TPP-PYR-DXS-TK-like及Transketolase-C;半定量PCR结果分析表明,四季桂DXPS基因表达量在花朵盛开期最高,花蕾期次之,衰弱期最低;在花瓣中的表达量要明显高于同时期在叶片中的表达量;在花瓣中,12月份DXPS基因的相对表达量最高,3月份次之,在6月份和9月份DXPS相对表达量较低。研究结果初步阐明了DXPS基因在四季桂开花过程中的表达模式,可为深入研究香气合成途径及开展花香植物的分子育种提供科学基础。     

桑树MaMYB308基因的克隆及表达分析

为研究桑树MYB转录因子在桑树非生物胁迫及发育中的功能,本研究以桑树品种‘桂优62号’为材料,克隆了桑树MYB转录因子MaMYB308的全长cDNA序列,运用生物信息学手段对其氨基酸序列进行分析,采用酵母单杂交验证其自激活性,采用实时荧光定量PCR方法检测基因在不同组织和非生物胁迫下的表达模式。研究结果显示,MaMYB308基因全长1 266 bp,包含一个1 026 bp的开放阅读框,可编码341个氨基酸,其编码蛋白质分子量为39 kD;具有两个SANT结构域,属于典型的R2R3型MYB转录因子,具有自激活活性。BLAST结果显示,MaMYB308与来源高等植物的多种R2R3-MYB类转录因子均具有较高的同源性,与川桑的MYB308同源性最高,氨基酸水平的一致性为96.48%。实时荧光定量PCR分析结果显示,MaMYB308在桑树根、茎和叶片组织中均有表达,在根中的表达量显著高于茎与叶片的表达量,且对高温、低温、高盐和干旱等非生物胁迫均有响应,其中对低温胁迫诱导最为显著,表达量为对照的40倍左右。本研究结果为进一步研究桑树MaMYB308基因的生物学功能及桑树的抗逆机理提供了帮助。     

香蕉MaCSase基因的克隆和表达分析

旨在克隆香蕉(Musa acuminata L. AAA group cv. Brazilian)半胱氨酸合成酶(cysteine synthase, CSase)基因,并进行序列特征、器官表达特异性和逆境胁迫下表达特性分析。通过对香蕉根的cDNA文库的测序和分析,获得了一段香蕉半胱氨酸合成酶基因的片段,运用RACE扩增技术获得基因全长,命名为MaCSase,并进行序列分析,最后利用荧光定量PCR技术分析该基因在香蕉不同器官中的表达特异性及在外源胁迫下的表达特性。序列分析显示,该基因全长1367 bp,存在1个完整的开放阅读框1065 bp,编码355个氨基酸。通过和已知植物的半胱氨酸合成酶基因相比,同源性达到79%以上。其中与水稻、苜蓿、葱、玉米的CSase编码的氨基酸序列的同源性分别为86%、85%、84%、84%,器官特异性分析表明,MaCSase在香蕉的根、球茎、叶片、花和果实中均有所表达,其中在球茎中表达量最高。通过对其在高盐胁迫下的表达分析显示,该基因在香蕉根中的表达随着处理时间的增加呈现上升趋势,在胁迫6 h时被大量诱导。