一个新的水稻生育期延迟T-DNA插入突变体

从水稻突变体库中筛选到一个生育期延迟突变体,主要表现为生育期延迟、植株矮化、叶色变深、叶角张大、根系变短。遗传分析表明该突变体受1对隐性单基因控制。对突变体及其后代分离群体做Basta抗性检测,证实该突变体是由T-DNA插入引起的,突变性状与T-DNA共分离。PCR和Southern杂交结果进一步证实了上述观点。该材料可用于插入座位的基因克隆和生育期调控机理的研究。     

T-DNA诱发的小麦强分蘖突变体研究初报

利用农杆菌介导的小麦活体转化技术转化多个小麦品种,得到一定数量的小麦转化体植株。在小麦品种鲁麦21的遗传转化体T0代植株中发现一强分蘖突变体,通过PCR技术和Southern杂交技术证明该突变体含有T-DNA序列;该突变体表现为单基因隐性突变,在突变体T3代中均能通过PCR扩增到T-DNA内的序列,表明该突变体为T-DNA插入诱发的突变体。通过对该突变体初步分析表明突变基因与温度应答有关,随温度的降低,突变体分蘖速度加快。     

一个水稻雄配子不育基因MGA1(t)的遗传及表达特征分析

在水稻转基因材料后代中筛选到一个自交后代标记基因呈1:1异常分离的雄配子不育突变体(暂命名为Male gametophyte abortion1,mga1(t))。该突变体花粉约50%败育,花粉败育表型与T-DNA共分离,且只能通过雌配子传递,表明mga1(t)是一个T-DNA插入引起的雄配子败育突变体。Southern blot分析表明,mga1(t)为单拷贝T-DNA插入突变体。侧翼序列分析发现T-DNA插入在水稻3号染色体上一个Bax inhibitor(BI)-1 like家族蛋白基因的5’非翻译区,该基因可能与细胞程序性死亡有关。RT-PCR表达分析显示MGA1(t)基因在水稻不同生长发育期均有表达,尤其在长度发育为0～7mm的颖花中强表达,表明该基因是一个水稻雄配子优势表达基因。     

水稻穗大小决定基因PS1的遗传分析及克隆

穗大小是影响水稻产量的重要农艺性状之一。本研究在水稻粳稻品种"中花11号"T-DNA插入突变体库中鉴定了一个植株略矮、穗长变短25%、一次枝梗和二次枝梗数目分别减少33%和80%、且粒型变异的突变体。T-DNA标签共分离检测表明:该突变体的表型与T-DNA插入无关。通过与籼稻品种"珍汕97"配置杂交组合构建遗传作图群体,F2杂合后代符合经典孟德尔遗传分离比3:1,证明突变性状受一对隐性基因PS1(Panicle Size 1)所控制。采用图位克隆的方法,将基因PS1初步定位在第11号染色体短臂上的IN44和IN50标记之间,两标记物理图距为105 kb。对候选基因进行进一步的表达量分析、比较扩增及测序发现基因LOC_Os11g12740(即SP1)可能是本研究的PS1基因。本研究为进一步分离克隆PS1基因及对水稻穗大小发育的深入研究提供依据。     

水稻密穗突变体A989突变基因克隆和转基因植株分析

从水稻T-DNA插入突变群体中分离得到一个密穗突变体A989,表现晚开花、穗二级枝梗和小花数增加以及包颈。分子检测证明A989中T-DNA是单拷贝插入,通过inverse PCR的方法分离得到A989中T-DNA的旁邻序列,表明T-DNA插入在RCN2基因polyA加A位点后330bp处;RT-PCR检测发现在A989中,RCN2基因的表达被显著上调。利用2×35S启动子在野生型水稻Zhonghua 11中超表达RCN2基因,转基因植株表现为不抽穗,通过细胞学观察发现转基因植株能完成营养生长向生殖生长的转变,但是生殖生长期的分生组织在分化出二级枝梗原基后停止分化和生长。此外,通过比较部分开花相关基因在野生型Zhonghua 11、突变体A989中的表达,推测了RCN2基因可能的作用途径。     

一个控制水稻侧生小穗形成基因的遗传定位分析

水稻的穗是一个典型的圆锥花序,其发育形态直接影响水稻产量。本研究利用本课题组创建的水稻"中花11号"T-DNA插入突变体库,通过表型筛选鉴定了一个稀穗突变体。该突变体在营养生长阶段表现为分蘖数减少,生殖生长阶段稻穗一次枝梗发育正常、但二次枝梗数和侧生小穗数目显著减少,表现为明显的稀穗表型。分子检测结果表明该突变体不是由T-DNA插入导致的。通过与籼稻品种"珍汕97"构建F2遗传定位群体遗传分析表明:该突变性状受一个隐性基因所控制。采用图位克隆的方法将目标基因定位于4号染色体上的SSR标记RM16880和RM1205之间约120 kb范围内。基因组序列分析表明:该突变体是由于LAX2基因序列缺失60 bp所导致。该突变体是LAX2的一个新的等位突变体,命名为lax2-4。lax2-4为研究LAX2控制水稻穗形态建成的分子机制积累了遗传材料。     

大丽轮枝菌致病缺陷型T-DNA插入突变体的筛选与鉴定

【目的】从大丽轮枝菌T-DNA突变体库中筛选鉴定致病缺陷型突变体并分析致病相关基因。【方法】将落叶型大丽轮枝菌菌株Vd991的294个T-DNA插入突变体在寄主棉花上进行致病力测定。利用Southern杂交和hiTAIL-PCR(High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR)技术分别对筛选获得的9个致病力显著降低的突变体进行拷贝数和侧翼序列分析。【结果】与接种野生型Vd991的棉花相比,接种突变体的棉花的病情指数极显著降低。Southern杂交表明其中1个突变体中T-DNA为双拷贝插入,其余8个突变体均为单拷贝插入。生物学特性分析发现T-DNA的插入导致这些突变体在生长速率和产孢量等方面与野生型Vd991相比均有不同程度的降低。Blast比对分析明确了这些突变体中T-DNA的插入位置和在基因组上的分布,并从野生型菌株Vd991中成功克隆得到了这些可能影响大丽轮枝菌致病力的相关基因。【结论】筛选和鉴定T-DNA插入突变是在全基因组范围内快速获得致病相关基因信息的1种有效方法,极大的促进了大丽轮枝菌的致病分子机制等研究,为进一步培育抗病棉花品种奠定了基础。     

水稻Ds插入双分蘖突变体形成机理的分析

在水稻Ds插入突变株筛选过程中,发现一个在同一分蘖节形成大、小两个分蘖的双分蘖突变体dt1（double tillers mutant）,两个分蘖均可正常抽穗形成有效分蘖。采用TAIL-PCR技术从该突变体中克隆了Ds插入的侧翼序列,将该序列作为查询序列进行核苷酸序列数据库（NCBI-BLAST）在线比对分析,发现所克隆的Ds侧翼序列与3号染色体的克隆OJ1345H02（gi|21281466）序列同一性达100%。以FGENESH和GeneMark.hmm两种软件分别对Ds插入基因的结构进行分析,在外显子的数目、大小、位置等方面均得出高度一致的结果。同时,用NCBI Entrez server和Pfam等软件对该基因进行功能预测,推测的基因编码产物含保守的FH2结构域,为水稻类形成素蛋白。突变体后代Ds插入基因型分析显示,其后代出现分离,表明该突变体为Ds插入杂合体。     

尖孢镰刀菌T-DNA插入突变体的筛选及插入基因分析

在建立T-DNA插入突变体库的基础上,为筛选出致病力明显下降的突变体并明确其插入位点信息,对突变体的培养表型和致病性差异进行测试,研究结果为进一步阐明尖孢镰刀菌致病分子机制奠定基础。在前期构建的T-DNA插入突变体库中,采用PCR检测筛选了300株T-DNA插入突变体,观察和测定菌落形态、生长速率、产孢量、遗传稳定性等生物学性状,用海棠胚根接种法比较突变体致病力差异,对筛选到的致病力明显减弱的突变体进行插入位点侧翼序列分析及Southern杂交分析。结果显示,283个供试突变体都已插入目的基因,并伴有绿色荧光。将T-DNA插入突变体连续转接培养5代后,在含潮霉素B的培养基上能稳定遗传,且菌落形态和颜色无明显改变;在对283株突变体进行致病性测定中,87.9%的突变菌株致病力减弱,在致病力减弱的突变体中,HS2-520、HS2-1016和HS2-2109几乎丧失了致病性。选取8株致病力明显减弱的突变体进行Southern杂交分析,结果显示,其中6株突变体为单拷贝插入菌株,1株为双拷贝插入菌株。对这8株突变体进行了TAIL-PCR侧翼序列扩增,经公司测序,与野生菌株HS2基因组序列比对后获...     

可去除选择标记的转Bt基因抗虫玉米研究

将组成型表达的玉米泛素启动子与苏云金杆菌杀虫蛋白基因Bt连接，插入根瘤农杆菌双T-DNA质粒，构建一个T-DNA结构域含有抗潮霉素选择标记基因hyg，另一个T-DNA结构域含有抗虫基因的双T-DNA单子叶植物表达载体，用以转化农杆菌菌株，再通过共培养转化玉米胚性愈伤组织。通过潮霉素培养基抗性筛选，用特异PCR扩增和Southern杂交检测，从分化再生的T0代植株中，鉴定出4个转化Bt基因的阳性植株。目前，正结合进行田间分离纯合和DNA分子鉴定，培育去除选择标记基因的转基因抗虫玉米自交系。     

水稻白条纹叶Gws基因的精细定位与遗传分析

叶色突变是一类十分明显的性状突变,在高等植物的叶绿素合成、叶绿体结构、功能、遗传、分化与发育等基础研究中均具有重要意义。到目前为止,已鉴定多个重要的水稻功能基因,据不完全统计,水稻中至少已定位了79个叶色突变位点,并已成功克隆出多个叶色相关基因,其中OsCHLH、OsCAO1、OsCAO2、chlorina1、chlorina9、ygl等直接参与编码叶绿素合成,其余基因均参与叶绿体发育调控。在日本晴(Nipponbare)T-DNA插入突变体库中筛选到一份对温度敏感的白条纹突变体gws(green-white-stripe),遗传分析表明它来自组织培养过程中的单隐性基因突变。利用gws与培矮64杂交组合的F2代群体,将Gws精细定位于第6染色体标记InDel15和InDel16之间,物理距离为73kb,此区间内包含13个基因。基因组序列分析发现,突变体在核糖核苷二磷酸还原酶小亚基(ribonucleoside-diphosphate reductase small chain,RNRS1)编码区第314～315碱基发生缺失,第316～317碱基由GC变为TT,导致该基因阅读框移码突变,蛋白质翻译提前终止。该基因是已经报道的水稻白条纹叶基因St1(Stripe1)的等位基因,gws突变体较st1突变体的白条纹出现早且明显,gws白条纹表型出现在第2片叶之后,而st1的白条纹表型仅出现在第4或5片叶之后。     

一个粳稻来源抗稻瘟病基因的鉴定、遗传分析和基因定位

7001S是一个广谱抗稻瘟病的粳稻两用核不育系,对来自全国不同稻区的22株稻瘟病菌系均表现为高度抗性。通过构建7001S/80-4B F2群体的遗传分析和初步定位表明,F2分离单株对稻瘟病菌的抗性呈明显的抗、感双峰分布,抗感分离符合3﹕1的理论比例,说明粳稻7001S对稻瘟病菌的抗性由1对显性核基因或一个显性QTL位点控制,并将该基因初步定位于第11染色体长臂末端。进一步通过扩大遗传群体和分子标记开发,利用基于BSA的隐性群体分析技术,将目的基因精细定位于P21-2415和RM27322之间约310 kb的范围内,并获得了可用于分子标记辅助选择的紧密连锁和共分离分子标记,同时对目标基因所在区域进行基因预测,初步确定了候选基因。为进一步开展该抗稻瘟病基因的克隆、功能验证和抗病机理研究,以及通过分子标记辅助选择技术培育抗稻瘟病水稻新品种等工作奠定了基础。     

水稻抗白叶枯病基因Xa23的RFLP标记定位及其STS标记的转化

用水稻抗白叶枯病基因Xa23的近等基因系CBB23与其感病轮回亲本金刚30（JG30）杂交,构建了包含2562个单株的F₂作图群体。用水稻白叶枯病广致病菌系P6进行抗性鉴定表明,F₂植株抗感分离比严格符合3：1。根据日本水稻基因组计划RGP水稻高密度图谱上的RFLP探针对F₂群体中的145个感病单株进行RFLP检测和连锁分析,获得了6个与Xa23紧密连锁的RFLP分子标记。其中RFLP标记C1003A靠着丝粒一侧,与Xa23的遗传图距为0.4cM,为Xa23的图位克隆奠定了重要基础。并将标记C1003A成功地转化为STS标记,为分子标记辅助选择育种（MAS）提供了方便有效的分子标记。     

一个新的水稻细条纹叶色突变体特性分析和基因克隆

叶色突变体作为一种易于观察的性状突变,是开展光合系统的结构和功能、叶绿素生物合成及其调控机制研究的理想材料。本研究以水稻T-DNA插入细条纹叶色突变体为研究材料,通过叶片的形态鉴定、石蜡切片、叶绿素和光合速率测定,分析突变体的表型和光合特性;采用TAIL-PCR技术,定位和克隆该突变基因。结果表明:突变体苗期幼叶上呈现间断的白色细条纹,而叶鞘、叶脉表现正常,三叶期后至分蘖期叶片逐渐转绿;突变体叶色对温度变化敏感;是国内外尚未报道的一种新型水稻细条纹叶色突变体。根据T-DNA插入标签,确定突变候选基因位于第7染色体上,并对候选基因进行了克隆已获得部分cDNA序列,暂命名为fs3(t)。     

Identification of a major blast resistance gene in the rice cultivar 'Tetep'

Analysis of near‐isogenic lines (NILs) indicated the presence of a novel resistance gene in the indica rice cultivar ‘Tetep’ which was highly resistant to the rice blast fungus Magnaporthe grisea.‘Tetep’ was crossed to the widely used susceptible cultivar ‘CO39’ to generate the mapping population. A Mendelian segregation ratio of 3 : 1 for resistant to susceptible F₂ plants further confirmed the presence of a major dominant locus, in ‘Tetep’, conferring resistance to the blast fungal isolate B157, corresponding to the international race IC9. Simple sequence length polymorphism (SSLP) was used for molecular genetic analysis. The analysis revealed that the SSLP marker RM 246 was linked to a novel blast resistance gene designated Pi‐tp(t) in ‘Tetep’.     

Inheritance of Dry Root Rot (Rhizoctonia bataticola) Resistance in Chickpea (Cicer arietinum)

The inheritance of resistance to dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola was studied. Parental F₁ and F₂ populations of two resistant and two susceptible parents, along with 49 F₁ progenies of one of the resistant × susceptible crosses were rested for their reaction to dry root rot using the blotting-paper technique. All F, plants of the resistant × susceptible crosses were resistant; the F₂ generation fitted a 3 resistant: 1 susceptible ratio indicating monogenic inheritance, with resistance dominant over susceptibility. F³ family segregation data confirmed the results. No segregation occurred among the progeny of resistant × resistant and susceptible × susceptible crosses.