基于RNA-Seq技术的茶树响应高温胁迫转录组差异性分析

为探索茶树响应高温胁迫的分子生理学机制,本研究通过转录组和数字基因表达谱技术,对高温胁迫前后的‘福鼎大白茶’、‘早白尖5号’两组茶树的差异表达进行分析,并基于转录组数据筛选鉴定茶树中与适应高温胁迫相关的保护基因和调控基因。结果显示,项目共测序获得53.7 Gb数据,组装并去冗余后获得的各样本Unigene均超过60 976条,总长度,平均长度,N50以及GC含量分别大于53 974 945 nt,840 nt,1 411 bp和41.36%。使用Blast将Unigene比对到七大功能数据库进行注释,在核苷酸序列信息库(nucleotide collection, NT)中被注释的Unigene序列最多,有109 581 (63.53%)条;高温胁迫后,‘福鼎大白茶’高温胁迫(fuHT) vs‘福鼎大白茶’常温对照(fuCK)和‘早白尖5号’高温胁迫(zaoHT) vs‘早白尖5号’常温对照(zaoCK)两个比较组分别筛选获得5 256和5 765个差异性表达基因,其中‘福鼎大白茶’上调基因4 379个,下调877个,‘早白尖5号’上调基因4 997个,下调768个。将差异基因按GO功能分类,‘福鼎大白茶’、‘早白尖5号’高温胁迫后差异基因均富集到41个类别中,分属于GO功能分类体系的生物学过程、细胞组分和分子功能。将差异基因进行KEGG功能分析,‘福鼎大白茶’、‘早白尖5号’两个对比组显著富集的代谢通路(pathway)前3名均为代谢途径、内质网中的蛋白质处理、次级代谢物的生物合成。选取17个在高温胁迫后被诱导的基因,利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)对高通量测序数据进行验证,证明测序结果真实可靠。本研究筛选出大量与高温胁迫相关的响应基因,为下一步耐热茶树新品种的选育提供了更多的理论参考。     

芒果MiCO基因逆境胁迫下表达模式分析及转基因株系的获得

CONSTANS(CO)基因是调控植物开花光周期途径的关键基因,近来有研究发现其与植物的逆境胁迫也有关。目前CO参与植物逆境胁迫的作用尚不清楚。为了探究CO在芒果逆境胁迫中的功能,我们利用实时荧光定量技术对MiCO基因在芒果2℃低温胁迫、盐胁迫和PEG-6000模拟干旱胁迫后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h的表达模式进行分析。结果显示,这三种逆境处理均诱导芒果MiCO基因的表达,其中盐胁迫处理条件下MiCO基因的表达水平上调,2℃低温和PEG胁迫条件下MiCO基因的表达水平下调。说明该基因参与了芒果逆境胁迫的调控。为了验证MiCO基因在芒果逆境胁迫中的功能,本研究构建了MiCO超量表达载体,将MiCO基因转化到拟南芥中,获得阳性植株,经过三代筛选得到了纯合株系,为进一步验证MiCO基因在逆境胁迫中的作用提供实验材料。     

苹果MdCaM的克隆及其对果实采后非生物胁迫的响应

为解析苹果钙调蛋白基因MdCaM在非生物胁迫过程中的功能.以秦冠苹果为材料,克隆了苹果MdCaM基因,并利用MEGA 5.0软件对其编码的蛋白进行了聚类分析,利用qPCR分析了MdCaM在采后损伤、低氧、高温等胁迫条件下的表达模式.结果表明,不同物种间钙调蛋白具有较高的同源性,MdCaM与拟南芥的钙调蛋白CaM1基因关系较近;qPCR结果表明,MdCaM在损伤、低氧胁迫(0 O2或3％ O2)后均呈先升高后恢复正常水平的表达模式,损伤后6h达到峰值,低氧(0 O2)处理1h后达到峰值;高温(20℃/40℃)诱导后其表达量高于同期对照组,并在处理后12 h达到峰值,表明该基因可能参与了高温胁迫下的全程响应.因此推测,MdCaM基因可能在苹果适应损伤、高温、低氧等逆境胁迫过程中发挥重要作用,可能参与了苹果生长发育过程中的逆境调控.为后继研究MdCaM的功能和作用机制奠定基础.     

苹果MdCaM的克隆及其对果实釆后非生物胁迫的响应

为解析苹果钙调蛋白基因MdCaM在非生物胁迫过程中的功能。以秦冠苹果为材料,克隆了苹果MdCaM基因,并利用MEGA 5.0软件对其编码的蛋白进行了聚类分析,利用qPCR分析了MdCaM在釆后损伤、低氧、高温等胁迫条件下的表达模式。结果表明,不同物种间钙调蛋白具有较高的同源性,MdCaM与拟南芥的钙调蛋白Ca M1基因关系较近;qPCR结果表明,MdCaM在损伤、低氧胁迫(0 O_2或3%O_2)后均呈先升高后恢复正常水平的表达模式,损伤后6 h达到峰值,低氧(0 O_2)处理1 h后达到峰值;高温(20℃/40℃)诱导后其表达量高于同期对照组,并在处理后12 h达到峰值,表明该基因可能参与了高温胁迫下的全程响应。因此推测,MdCaM基因可能在苹果适应损伤、高温、低氧等逆境胁迫过程中发挥重要作用,可能参与了苹果生长发育过程中的逆境调控。为后继研究MdCaM的功能和作用机制奠定基础。     

小麦TaHPPR基因的克隆与表达分析

为研究羟基苯丙酮酸还原酶(HPPR)在小麦逆境胁迫中的作用,本研究利用同源克隆法获得1个小麦HPPR基因,命名为TaHPPR,并对其组织表达特性和逆境胁迫表达特性进行了分析。以‘太原806’、‘小白麦’、‘京冬8’及‘京411’为供试材料,用荧光定量方法获得组织表达和逆境胁迫表达数据。序列分析表明：TaHPPR基因含有1个975 bp的完整开放阅读框,编码324个氨基酸;TaHPPR蛋白含有一个NAD-binding domain结构域。系统进化分析表明：TaHPPR基因与二粒小麦处于同一分支,其亲缘关系最近。荧光定量表达分析表明：TaHPPR基因在小麦根、小穗（除去雄蕊）、叶鞘均有表达,其中,根中表达量最高;在低温、干旱、高盐和ABA胁迫处理下TaHPPR基因表达均有所下降;在高抗盐品种‘京冬8’中,TaHPPR基因表达升高,而在敏感品种‘小白麦’和较敏感品种‘京411’中,TaHPPR基因表达受到抑制。亚细胞定位结果显示,TaHPPR蛋白主要在线粒体中表达,过表达TaHPPR基因可能增加小麦的抗盐性。本研究分析了TaHPPR在小麦逆境应答及不同品种中盐胁迫处理下的表达特性,为研究小麦抗逆育种分子机制提供新基因资源和新的思路。     

根际高温对不同砧木黄瓜嫁接幼苗生长、光合及生理特性的影响

为研究嫁接提高黄瓜耐热性的问题,以黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)、日本南瓜(Cucurbita moschata)、‘甬砧8号’白籽南瓜(Cucurbita maxima×Cucurbita moschata‘Yongzhen No.8’)、‘五叶香’丝瓜(Luffa cylindrica‘Wuyexiang’)和‘傲美’苦瓜(Momordica charantin‘Aomei’)为砧木,‘春秋王2号’黄瓜(Cucumis sativus‘Chunqiuwang No.2’)为接穗,采用营养液栽培法,研究25℃(CK)和35℃根际温度下处理5天及恢复生长5天后不同砧木黄瓜嫁接苗和自根苗的生长、光合及生理特性变化。结果表明,35℃根际高温处理后,不同嫁接苗和自根苗的株高、茎粗、叶片数和叶面积都有所增长,其中‘五叶香’丝瓜砧木嫁接苗生长量最大,且‘五叶香’丝瓜砧木嫁接苗的叶片净光合速率(Pn)、抗氧化酶活性和脯氨酸含量都显著高于其他几种嫁接苗及自根苗,同时,丙二醛(MDA)含量最低。‘五叶香’丝瓜作为砧木嫁接黄瓜能更好地提高其对根际高温的耐受性,为黄瓜的耐热性研究提供理论依据。     

陆地棉漆酶基因家族成员表达模式分析

漆酶是铜蓝氧化酶蛋白家族的一员,在植物木质素合成和提高植株抵御胁迫能力等方面发挥着重要作用。本研究从陆地棉基因组中鉴定到104个漆酶基因(GhLAC)家族成员,进行了系统进化树和组织表达图谱的构建,并随机选取了20个基因进行荧光定量PCR分析,验证了表达热图的结果。为进一步探索漆酶在棉花中担当的角色,本研究采用启动子-GUS融合载体转化拟南芥,通过转基因拟南芥不同发育过程不同组织GUS染色结果,分析了陆地棉漆酶基因家族6个成员(GhLAC12A、GhLAC14A、GhLAC20A、GhLAC25D、GhLAC59D、GhLAC63D)的精细表达模式。为探究漆酶在逆境中发挥的作用,对该6个漆酶基因进行了切割和刺洞2种创伤胁迫诱导表达分析,并利用2个棉花品系‘84021’(高温耐受型)和‘H05’(高温敏感型)在常温和高温胁迫条件下不同时期的花药进行相应基因的荧光定量PCR分析。研究结果表明,随机挑选的20个基因在根、茎、叶、花瓣、花药和柱头6个组织中差异表达,大多数基因的表达与转录组结果一致。6个漆酶基因的启动子能够不同程度地驱动GUS基因在种子萌发时期、二叶期、四叶期表达;创伤处理结果...     

水稻干扰素相关发育调节因子的生物信息学分析

干扰素相关发育调节因子(interferon-related developmental regulator factor, IFRD)在动物中有较深入研究,参与动物细胞发育和分化及多种疾病的发生,但是在植物中研究较少。为了挖掘植物IFRD基因的功能,本研究对禾本科模式作物水稻IFRD基因家族成员进行了系统的生物信息学分析。本研究鉴定得到5个水稻IFRD基因家族成员,分布在4条染色体上,根据进化树把它们分为2个亚家族,不同亚家族成员具有不同的基因组结构、蛋白质保守基序和表达模式。高温、盐胁迫处理后的转录组测序分析结果显示,该基因家族成员(OsIFRD3, OsIFRD4)对逆境的响应变化差异显著;蛋白质相互作用分析结果显示水稻IFRDs可能与mRNA可变剪接因子、甲硫氨酰t RNA合成酶、rRNA加工蛋白相互作用;启动子分析显示水稻IFRD启动子具有非生物胁迫和植物激素响应元件。综上表明水稻IFRD基因家族可能通过调控m RNA可变剪接和蛋白质的合成参与高温、盐胁迫逆境响应途径。本研究为深入解析水稻IFRD基因功能提供了重要信息。     

水稻植物激素响应低温胁迫反应的转录组分析

植物激素在调节和控制植物生长发育、代谢过程、应对逆境等方面具有重要的作用。为明确水稻苗期植物激素对低温的应答机制,本研究以野生型粳稻品种‘中花11’为研究材料,经低温处理后,利用RNA-Seq技术分析植物激素调控水稻幼苗对低温胁迫的应答模式。通过转录组测序,共获得9.9×10~7条干净的序列,筛选出2 044个差异表达基因(DEGs)。首先,GO富集分析结果表明差异表达基因主要富集在生物学过程、细胞组分和分子功能三个方面。进一步的KEGG通路分析表明,差异表达基因主要富集在代谢途径、次生代谢生物合成、植物激素信号转导等途径。其中植物激素信号转导中低温应答的差异表达基因为31个,分别为25个上调表达基因和6个下调表达基因;主要参与了茉莉酸和脱落酸信号途径。这些研究结果对水稻苗期植物激素的低温应答机制完善和栽培调控具有重要的参考价值。     

逆境处理下水稻叶角质层蜡质积累及其与蜡质合成相关基因OsGL1表达的关系

植物角质层蜡质在抵抗各种生物和非生物胁迫中起着非常重要的作用。本试验以水稻(Oryza sativa L.)幼苗为材料, 分别以200 mmol L^-1 NaCl、12% PEG、1.0% H₂O₂、40℃高温和8℃低温为逆境, 研究叶角质层蜡质的积累情况以及其与水稻蜡质合成相关基因OsGL1表达的关系。扫描电镜观察以及叶角质层蜡质总量测定结果表明, 12% PEG、1.0% H₂O₂和8℃低温处理下水稻幼苗叶角质层蜡质的积累明显增加, 而200 mmol L^-1 NaCl和40℃高温处理下叶角质层蜡质覆盖量略有下降。RT-PCR分析显示, 逆境处理下水稻蜡质合成相关基因OsGL1的表达量变化与水稻幼苗叶角质层蜡质的积累存在相关性。     

干旱胁迫下接种ERM真菌对桃叶杜鹃幼苗光合特性的影响

以1年生桃叶杜鹃幼苗为材料,研究干旱胁迫下接种ERM真菌对桃叶杜鹃幼苗光合特性的影响.结果表明:接种ERM真菌显著提高了桃叶杜鹃幼苗的叶绿素含量、净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)以及水分利用效率(WUE),同时降低了叶片胞间CO2浓度(C,),对照不接菌处理差异显著;在持续干旱条件下,桃叶杜鹃菌根苗通过促进叶片叶绿素的合成与积累,提高水分的利用效率,以减缓幼苗各光合参数的下降速度,使幼苗保持较高的光合能力;复水后,菌根苗能较快恢复其光合作用,恢复能力显著高于对照苗,且TY 35和TY 29基本能恢复至旱前水平.由此可见,接种ERM真菌能够显著提高桃叶杜鹃幼苗的光合能力以及水分利用效率,从而增强桃叶杜鹃的抗旱能力,且以TY 35和TY 29的表现最好.     

优质面包小麦品种济南17和豫麦34灌浆期高温胁迫差异表达基因的分离

选用品质相对不稳定的小麦品种济南17和品质较稳定的品种豫麦34,于开花后15~18 d（灌浆中期）及30~33 d（灌浆后期）分别进行连续3 d的高温胁迫处理（昼夜温度为38℃,25℃）。提取籽粒总RNA,通过cDNA-AFLP分析获得差异条带。回收差异条带,再经过克隆、测序、BLAST比对,济南17、豫麦34分别获得85个和99个高温胁迫下差异表达基因片段的序列。经过反向Northern杂交验证后,济南17获得25个信号明显的序列,其中22个来自热诱导表达的基因,主要与小麦的胁迫响应基因、热激蛋白等同源;豫麦34获得31个信号明显的序列,其中25个来自热抑制表达的基因,主要与乙烯合成酶、吡咯啉-5-羧酸合成酶等同源。说明高温胁迫总体上诱导品质不稳定品种的基因表达,而抑制品质稳定品种的基因表达。济南17的序列有15个来自灌浆中期样本、10个来自灌浆后期样本,豫麦34的序列则分别有29个来自灌浆中期样本、2个来自灌浆后期样本,说明高温胁迫对灌浆中期基因表达的影响比灌浆后期显著,在品质稳定品种中则比品质不稳定品种中更为明显。2个品种在高温胁迫下的基因表达模式存在显著差异,济南17诱导表达胁迫响应基因,豫麦34抑制表达乙烯合成酶和吡咯啉-5-羧酸合成酶及胁迫响应基因,这可能是二者品质稳定性不同的重要原因。     

高温胁迫下不同杜鹃品种PSII活性变化及其耐热性比较

为了解杜鹃光合机构对高温的响应机制与筛选耐热品种,以7 个杜鹃品种‘胭脂蜜’、‘吐蕊玫瑰’、‘小青莲’、‘夏锦袍’、‘锦袍’、‘艳春’与‘紫鹤’为材料,研究了3 种高温(30℃/28℃、35℃/30℃、38℃/35℃)胁迫下,供试杜鹃品种的外观形态与叶绿素荧光参数Fo（初始荧光）、Fv/Fo（PSII 潜在活性）、Fv/Fm（最大光化学效率）、Fv’/Fm’（PSII 反应中心激发能捕获效率）与NPQ（非光化学猝灭系数）的变化。结果表明：供试杜鹃品种随着胁迫时间增加Fo 上升,Fv/Fo、Fv/Fm与Fv’/Fm’下降,变化幅度与胁迫强度及时间成正比;NPQ表现为前期下降后期升高,耐热性强的杜鹃品种叶绿素荧光参数变化幅度小而耐热性差的品种变化幅度大,与外观表现一致。隶属函数综合分析表明,‘胭脂蜜’、‘吐蕊玫瑰’、‘小青莲’耐热性较强,可部分替代常规品种‘紫鹤’应用于城市绿化。     

基于转录组测序的苦瓜热激蛋白相关基因分析

为获得苦瓜叶片高温胁迫状态下表达的相关基因,本研究以高温胁迫下苦瓜叶片为实验材料,采用Illumina HiSeq 2500高通量测序技术对正常温度(26℃)和高温胁迫(38℃)下苦瓜叶片转录测序后进行组装,再利用KEGG、Pfam、Swiss-Prot和NR数据库平台对热激蛋白的相关功能基因筛选,共获得24个热激蛋白相关基因,包括得20个热激蛋白基因、2个位于叶绿体中的小热激蛋白以及2个热激转录因子。聚类分析研究表明,涉及到热激蛋白相关的20个Unigene广泛分布于3大类中,其中c42567和c43094这两个亲缘关系最近;两个小热激蛋白c42963和c12133的亲缘关系次之;c35683和c3040两个热激转录因子亲缘关系最远。通过本次研究中获取的24个热激蛋白相关Unigene信息,有助于深入研究苦瓜耐高温胁迫机理等提供数据信息。     

宿根矮化病菌诱导甘蔗差异表达基因的cDNA-SCoT分析

宿根矮化病是危害严重的世界性甘蔗主要病害之一,为了探究甘蔗在该病胁迫下的抗病分子机制,本研究以甘蔗品种新台糖22健康植株为材料,利用含有宿根矮化病病原菌的蔗汁诱导其抗性,分别在接种后2、4、6、8和10 d取样,构建宿根矮化病侵染处理与对照的RNA混合池,利用cDNA-SCoT法进行差异显示研究。结果表明,80条SCoT引物扩增出500多条带,长度在100~1800 bp之间。从中筛选出30个差异明显的条带,测序后序列拼接,获得22条高质量的EST序列。生物信息学分析显示,对甘蔗宿根矮化病的差异基因主要涉及能量代谢、防卫反应、信号转导、蛋白质类代谢等方面。进一步基因功能分析显示,油菜素内酯合成蛋白、NBS-LRR类抗性蛋白、茉莉酸诱导蛋白、α-微管蛋白、ABA胁迫成熟蛋白、富含脯氨酸蛋白、翻译起始因子eif-2b α亚族等可能参与了甘蔗宿根矮化病病原菌互作的过程。     

高温逆境胁迫对油桃生理特征影响的研究

为分析油桃的耐热特性,为耐热品种选育研究奠定基础,以‘早红珠’油桃嫁接苗为试材,研究不同高温胁迫对植株形态特征和生理指标变化。结果表明,高温胁迫对植株形态特征产生影响,随着温度升高和持续,受害指数加大,33℃和39℃高温胁迫对植株生长影响小,45℃高温胁迫3d后植株热害症状明显;高温胁迫下,植株生理指标呈规律性变化,随着温度升高,叶绿素(Chl)和类胡萝卜素(Car)含量降低,且随着胁迫持续下降幅度越大;除胁迫初期外,丙二醛(MDA)含量呈微增－减少－增加趋势;脯氨酸(Pro)含量逐渐增加,但45℃高温条件下,随着胁迫延长其含量急剧下降;超氧化物歧化酶(SOD)活性持续缓慢升高,除45℃高温处理第3d外,其活性在其他处理时增幅小;过氧化氢酶(CAT)活性先升后降,39℃处理时达峰值;高温下植株受害指数与Chl、Car、MDA、Pro、SOD及CAT等生理指标间具有显著相关性。     

外源茉莉酸对高温胁迫下的红掌幼苗的影响

研究了外源茉莉酸对高温胁迫下红掌幼苗叶片热致死时间、膜质过氧化以及抗氧化物酶活性的影响。结果表明：1mmol/L的外源JA可以最大限度地提高38℃高温胁迫下的红掌叶片的热致死时间;外施JA可以提高高温胁迫下的红掌叶片的POD活性、SOD活性;降低MDA和O2－-含量;不同时间高温锻炼下可以提高红掌叶片内源JA 浓度。结合以前的试验结果推测： JA可能是通过提高抗氧化物酶活性,降低体内MDA和O2－-含量来缓解高温胁迫对红掌幼苗的生长发育的影响。     

从非洲水稻材料中筛选耐高温种质资源

为了更好的开展抗热水稻育种工作，本研究试图从非洲地区收集的水稻种质资源中筛选耐热资源。采用最新建立的梯级温度法对来自非洲各地区的6 个水稻品种进行花期高温处理，通过不同温度下的受精率，计算耐热指数和耐热综合指数，以耐热综合指数判定材料的耐热性。结果表明，品种‘SDWG005’在不同温度下的耐热指数皆大于0.9，耐热综合指数为6.462，表现出极强的耐热性；品种‘SDWG001’在不同温度下的耐热指数大于0.5，耐热综合指数为4.163，表现出强耐热性；品种‘SDBN001’与品种‘SDSL013’在37℃下的耐热指数小于0.5，其他温度下耐热指数大于0.6，耐热综合指数分别为3.694 与3.406，表现出较耐热性。筛选得到了一个极强耐高温品种‘SDWG005’，2 个强耐高温品种‘SDWG001’与‘SDBN001’，试验显示来源于非洲的水稻中可能潜藏有宝贵的可用于育种的耐热资源和基因。     

水杨酸对温度胁迫下紫御谷幼苗根系活力及根系形态指标的影响研究

为了给紫御谷在重庆的育苗、种植和应用提供参考,并为其他草坪草植被资源的筛选和研究以及为进一步丰富重庆地区园林地被资源做出贡献,以紫御谷幼苗为材料,设置高温胁迫和低温胁迫,研究水杨酸对温度胁迫下紫御谷幼苗根系活力及根系形态指标的影响。结果表明：（1）高温和低温胁迫影响根系活力,使根系活力迅速下降,水杨酸处理能显著提高高温胁迫第3天和第5天以及低温胁迫第5天和第7天紫御谷幼苗的根系活力。（2）温度胁迫处理抑制了紫御谷幼苗根系的生长,使紫御谷幼苗的根总长、根表面积和根体积降低,低温胁迫对根总长造成的影响要大于高温胁迫。水杨酸处理能显著提高高温胁迫下植株的根表面积。     

丛枝菌根对高温胁迫下牡丹生理生化的影响

采用盆栽试验,研究了高温胁迫下AM真菌对牡丹幼苗生理生化指标的影响。结果表明:在相同高温下,接种真菌的幼苗根系活力、叶绿素(a+b)含量、游离脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量均高于对照,相对电导率、丙二醛含量均低于对照;随温度的升高,接种AM真菌处理的叶绿素(a+b)含量、可溶性蛋白含量下降幅度均低于对照,相对电导率、丙二醛含量增加幅度低于对照,游离脯氨酸含量、可溶性糖含量增加幅度高于对照,说明AM真菌提高了牡丹抗热性。