β-氨基丁酸早期诱导表达基因StWRKY5参与马铃薯晚疫病抗性

β-氨基丁酸(β-aminobutyric acid,BABA)诱导能够增强马铃薯对晚疫病的抗性。本研究从马铃薯中克隆了一个WRKY转录因子家族的基因St WRKY5。c DNA-AFLP表达谱研究表明,BABA(2 mmol/L)处理马铃薯6 h后该基因明显上调表达,晚疫病菌(Phytophthora infestans)接种16 h后上调表达。半定量RT-PCR检测表明水杨酸SA(10μmol/L)处理马铃薯离体叶片4 h后该基因上调表达,茉莉酸甲酯Me JA(50μmol/L)诱导12 h后开始表达,机械伤害处理24 h后,该基因表达也会增强,表明该基因参与多种生物和非生物因子的胁迫反应。通过稳定转化获得了超量表达St WRKY5的转基因马铃薯株系。采用离体叶片接种鉴定方法对转基因马铃薯株系晚疫病抗性进行了鉴定,研究结果显示接种4 d后超量表达转基因株系其病斑面积均显著小于对照,表明在马铃薯中超量表达St WRKY5提高了晚疫病抗性。     

棉花WRKY22基因分离及其对黄萎病的抗性分析

为了克隆棉花抗黄萎病相关基因,利用生物信息学、病毒诱导基因沉默技术(VIGS)、实时定量PCR(q PCR)和接菌分析来研究棉花WRKY基因对大丽轮枝菌的诱导响应和抗性。结果从棉花中筛选出8个与拟南芥直系同源的棉花抗病相关WRKY基因,这些直系同源WRKY基因表达受到大丽轮枝菌浸染诱导响应。其中有6个GhWRKY基因的表达均受到大丽轮枝菌诱导上调,而GhWRKY70和GhWRKY48的表达量随着不同的时间点呈现上调或下调。GhWRKY22等5个基因表达量在24,72 h分别表现为上调,呈现出双峰曲线。对GhWRKY22表达特征进一步分析,结果显示,GhWRKY22基因在茎里优势表达,同时表达受到大丽轮枝菌、水杨酸和茉莉酸激素的诱导。GhWRKY22基因沉默植株对大丽轮枝菌的敏感性增加,抗病标志基因(PR1、PR3、PR4、PR5、PAL和PDF1. 2)表达量也显著降低,揭示GhWRKY22是通过SA和JA信号途径参与棉花对大丽轮枝菌的响应过程。总之,棉花中8个WRKY基因参与棉花对黄萎病抗性调控,其中GhWRKY22基因正调控棉花的抗性,可作为棉花抗病育种的候选基因。     

N-3-羰基十四烷酰基高丝氨酸内酯诱导番茄对灰霉病抗性机制初探

为了探究细菌群体感应(QS)信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)在植物上诱导对于真菌病害的抵抗能力。以番茄为试验材料,以灰霉为病原指示菌,通过不同侧链长度和侧链修饰的AHLs信号分子预处理后接种病原菌,发现长链信号分子N-3-羰基十四烷酰基高丝氨酸内酯(3OC14-HSL)对灰霉有最佳的抗性效果。实时荧光定量PCR检测抗病基因发现,与未处理对照组相比,信号分子3OC14-HSL预处理能显著诱导接种灰霉病后的番茄体内与茉莉酸(JA)信号通路相应基因PI1、PI2上调;而与水杨酸信号(SA)通路相关的NPR1基因显著下调,PR1基因则没有显著变化。进一步通过DAB染色、过氧化氢含量测定以及过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性检测发现,3OC14-HSL预处理相比未处理对照组使得番茄产生大量活性氧,且可以保持较高的POD、SOD活性。这些结果表明,长链信号分子N-3-羰基十四烷酰基高丝氨酸内酯可以诱导番茄对灰霉的抗性,而且该抗性效果可能与茉莉酸信号路径相关。     

棉花GhTGA1与GhTGA9.2基因克隆及表达特征分析

为了揭示棉花GhTGA1与GhTGA9. 2基因的生物学功能,利用RT-PCR技术,从抗枯萎病棉花品种中棉所12号中克隆了TGA转录因子基因GhTGA1与GhTGA9. 2。生物信息学分析表明,2个基因开放阅读框(ORF)长分别为1 281,1461 bp,分别编码405,486个氨基酸。序列分析表明,2个基因均含有b ZIP和DOG1结构域,属于b ZIP亚家族TGA转录因子基因。利用实时荧光定量(qRT-PCR)技术进行表达特征分析表明,GhTGA1基因能被枯萎病菌、乙烯(ET)、茉莉酸(JA)诱导上调表达,水杨酸(SA)诱导后,在各处理时间点,该基因表达量均低于Mock,以上结果表明,GhTGA1基因可能通过参与乙烯(ET)和茉莉酸(JA)信号通路调控棉花对枯萎病的抗性;枯萎病处理后,GhTGA9. 2基因在各时间点表达量均低于Mock,呈下调表达,但能被激素(ET、JA、SA)诱导上调表达。结果表明,GhTGA9. 2基因可能通过激素(ET、JA、SA)途径参与胁迫应答,通过对GhTGA1与GhTGA9. 2基因表达特征分析为后续研究提供基础。     

StBAG3基因介导的马铃薯对晚疫病抗性研究

为了探究来源于马铃薯中的StBAG3基因在马铃薯抗性建立过程中可能具有的功能,以夏坡蒂马铃薯的离体叶片为试验材料,利用马铃薯的瞬时表达体系对StBAG3基因的功能进行了初步的研究。结果表明,在瞬时表达StBAG3基因的马铃薯离体叶片上人工接种马铃薯晚疫病菌,24,48,72,96 h后接种位置病斑的相对面积较对照病斑显著减少了1.92～39.15百分点,说明瞬时表达StBAG3基因后显著提高了马铃薯对晚疫病菌的抗性水平。这一结果也从对接种部位坏死细胞的染色中得到了证实。H_2O_2定性和定量测定的结果表明,瞬时表达StBAG3基因后接种部位H_20_2积累量在接种后0～48 h差异不显著,接种后72,96 h与对照差异显著,二者均在72 h达到最大值,分别为0.146,0.086μmol/g。ROS清除酶活性测定的结果表明,接种后瞬时表达StBAG3基因部位SOD和CAT的活性随着接种时间推移,变化的模式有所差异,但二者在0～96 h均高于对照叶片,而POD的活性在接种后0～72 h与对照叶片没有显著差异,仅在接种后96 h显著高于对照叶片,间接证明了H_2O_2参与了StBAG3基因介导的正向调控马铃薯对晚疫病的抗性建立过程。由此可见,StBAG3基因能够提高马铃薯对晚疫病的抗性水平。     

响应辣椒疫霉菌诱导的CaWRKY转录因子筛选及其信号通路分析

在辣椒基因组中全面鉴定WRKY转录因子并筛选出受辣椒疫霉菌诱导的CaWRKY基因,并分析关键CaWRKY基因参与的信号通路。以CM334和NMCA10399为材料,基于辣椒基因组和RNA-seq数据,并在水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理下通过qRT-PCR技术检测基因表达并分析。全基因组共鉴定出69个CaWRKY基因。接菌后12 h,抗、感材料中分别鉴定出7个和3个差异表达基因;接菌后36 h,分别有13个和22个差异表达基因,表明抗病材料能更快速应答。在筛选出的8个关键CaWRKY基因中,CaWRKY19和CaWRKY65受SA诱导上调表达;CaWRKY50受MeJA诱导上调表达;CaWRKY25受SA诱导上调表达同时受到MeJA抑制下调表达,而CaWRKY49同时受SA和MeJA抑制下调表达,推测CaWRKY19和CaWRKY65通过SA,CaWRKY50通过JA,而CaWRKY25和CaWRKY49则通过SA和JA信号途径参与辣椒抗疫病防御反应。     

NPR在SA信号通路中的研究进展

长期以来,水杨酸(SA)被认为是植物的内源信号分子,并与植物体内的多种抗性相关。病程相关基因非表达子(NPR)是SA信号通路中的关键性因子,能够介导该信号转导途径的顺利进行。为了详尽地阐述近年来多项研究对NPR研究的进展,本研究在分子水平上介绍了NPR的研究起源、SA受体,归纳了NPR1与其旁系同源物NPR3和NPR4之间相互协调的关系,分析了SA信号通路与SA提高植物抗性的机制。指出在多种植物体内,虽然NPR在SA信号通路中扮演着不可或缺的角色,但是由SA所诱导的植物抗病机制是一个复杂、精密的网络,现有的生物分子技术仍然无法使NPR的作用完全透明化。而且,在不同的植物体和相同植物的不同部位中,各种信号的转导方式也未必相同。因此,需要通过进一步确认整个信号通路中各组分及其功能、对模式植物进行详细研究来使该过程完整化。     

JAs、SAs介导的植物防御反应及在药用植物中的应用

茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）介导的信号网络能调节植物防御反应。一般JA信号通路涉及抗虫反应,而SA通路则与抗病有关,JA和SA通路之间的交互作用在防御反应的微调中起重要作用。研究表明JA和SA也能有效调节抗寄生植物的防御反应。本文综述一些防御信号分子,尤其是JA和SA在植物防御中的作用,包括JA、SA介导的途径和JA/SA交互作用在抗病虫害和抗植物寄生中的作用;介绍茉莉酸、水杨酸类物质在药用植物研究中的初步应用。     

水稻稻瘟病菌诱导表达启动子OsQ16p的克隆与功能分析

qRT-PCR分析表明,日本晴OsQ16基因受稻瘟病菌诱导表达。利用PCR技术从日本晴基因组中克隆了该基因编码区5′端上游1 229 bp的启动子序列,命名为OsQ16p。用其取代pBI121中gus基因上游的CaMV35S启动子,构建重组表达载体pBIQ16p,经农杆菌介导转化日本晴,获得转基因植株。GUS组织化学染色和qRT-PCR分析表明: (1) gus基因在抗性愈伤组织和阳性转基因植株中均能表达; (2)转基因植株在接种稻瘟病菌后12 h,GUS表达量是处理前的2.7倍; (3)抗病相关信号分子水杨酸(salicylic acid,SA)和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)喷施转基因植株叶面后12 h,GUS表达量分别为处理前的3.1倍和3.5倍。以上结果表明,OsQ16p启动子具有启动活性,并明显受稻瘟病菌、MeJA和SA诱导表达。     

苹果MdVQs基因响应SA、JA及斑点落叶病的表达分析

VQ家族是一类植物转录调控辅助因子,参与调节植物生长发育以及防御反应。本研究根据水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)以及已报道的苹果斑点落叶病菌(Alternaria alternata apple pathotype)处理下苹果不同组织的转录组数据,采用Array、RT-qPCR和RNA-Seq检测和分析苹果品种‘Gala’的20个MdVQs基因的表达模式。Array结果表明,MdVQs基因在苹果各组织部位中都有高表达;RT-qPCR结果表明,多数MdVQs基因在早期响应激素信号,其中14个MdVQs基因受两种激素共同响应,MdVQ19只响应SA诱导表达,MdVQ5、MdVQ12、MdVQ16、MdVQ35、MdVQ47只响应JA且Md VQ47表达显著受抑制;RNA-Seq结果表明,MdVQs基因除在后期个别时间段下调表达外,其余时间段均上调表达,其中MdVQ21、MdVQ27、MdVQ42上调表达显著。MdVQs基因家族可能在响应SA、JA信号途径以及生物胁迫中存在潜在重要作用。该研究结果为深入解析MdVQs基因在苹果防卫生物胁迫中的功能提供参考。     

玉米抗禾谷镰刀菌的转录组分析

赤霉菌茎腐病是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum,有性态,Gibberella zeae)引起的一类土传性病害,严重危害玉米的产量和品质。本研究依据玉米第10和第1染色体上的2个抗茎腐病QTL,qRfg1和qRfg2,培育近等基因系NIL-R (2个QTL位点均为抗病等位基因)和NIL-S (2个QTL均为感病等位基因)。在成株期和幼苗期接种禾谷镰刀菌,两近等基因系的抗性差异均显著。用2个近等基因系的幼根接种禾谷镰刀菌,进行转录组分析研究。结果表明,与NIL-S相比,NIL-R在接种禾谷镰刀菌后,乙烯(ethylene,ET)合成、信号途径基因,病程相关蛋白、脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素(deoxynivalenol,DON)解毒基因等呈现特异上调表达。与NIL-S相比,有1170个基因在NIL-R对照组中表达量较高,其中水杨酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)和乙烯合成和信号介导途径以及苯丙烷合成途径中的基因显著富集;接种禾谷镰刀菌6 h或18 h后,病程相关蛋白、激素JA和ET合成基因、DON解毒基因在NIL-R中表达量较高。     

棉花GhIQM1基因克隆及抗黄萎病功能分析

棉花是我国重要的经济作物,而黄萎病(Verticillium wilt)是棉花生产上的主要病害,严重危害棉花产量和纤维品质。本研究通过转录组数据分析筛选出1个与棉花抗病相关、不依赖Ca²⁺的钙调素结合蛋白基因GhIQM1。该基因受黄萎病菌和水杨酸(SA)诱导表达。利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术研究其在棉花抗黄萎病中的功能发现,抑制GhIQM1基因表达增强了植株对黄萎病的抗性, TRV:GhIQM1植株病情指数、维管束褐化程度、体内病原菌积累量都显著低于TRV:00。qRT-PCR分析表明,抑制GhIQM1表达的植株接种黄萎病后,作为参与水杨酸途径中的3个重要基因NPR1、NPR3和PR5的表达量显著高于对照。以上结果初步表明,GhIQM1基因可能通过抑制SA途径负调控了棉花的黄萎病抗性。     

漾濞大泡核桃JsWRKY1过表达增强转基因烟草对胶孢炭疽菌的抗性

为进一步研究JsWRKY1的生物学功能,构建JsWRKY1的植物超表达载体并转入烟草中过表达。再生的JsWRKY1转基因烟草与野生型烟草在表型上无明显差异。JsWRKY1过表达上调了转基因烟草体内几个防卫相关基因MnSOD、Cu/Zn SOD、CN、NADPH oxidase和PR1的转录水平。与野生型烟草相比,JsWRKY1转基因烟草体内的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶活性在正常生长以及胶孢炭疽菌接种后均显著增强。平板抑菌试验结果显示,JsWRKY1转基因烟草叶片总蛋白对病原真菌葡萄座腔菌、串珠状赤霉菌、胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌的菌丝生长具有不同程度的抑制作用。此外,用胶孢炭疽菌接种烟草叶片,转基因烟草对胶孢炭疽菌的抗性明显增强。显然,JsWRKY1是漾濞大泡核桃中正调控病害防卫反应的转录因子。     

2种黑籽南瓜响应枯萎病菌侵染的转录组学研究

为了筛选白皮黑籽南瓜和绿皮花纹黑籽南瓜抗枯萎病的差异表达基因,挖掘参与抗性相关的代谢通路。以尖孢镰刀菌侵染2 d后和未侵染的2种幼苗叶片作为材料,利用Illumina Hiseq 2500测序技术进行转录组测序分析。以未侵染的幼苗作为对照,白皮和绿皮花纹黑籽南瓜差异表达基因分别有2082和1116个。其中141个基因在2种黑籽南瓜中均呈现出差异表达,62个基因具有相同表达趋势。对差异表达基因进行GO功能注释,结果显示2种黑籽南瓜差异表达基因主要富集在生物学过程中。KEGG代谢通路分析发现白皮有22个差异表达基因显著富集在植物激素信号通路,绿皮花纹有30个差异表达基因富集在苯丙烷生物合成通路。本研究挖掘出黑籽南瓜抗枯萎病差异表达基因,预测了抗性通路,为瓜类抗病机制的深入研究奠定了理论基础。     

甘蔗Ca~(2+)/H~+反向运转体基因的克隆与表达分析

CAX(Ca~(2+)/H~+antiporter)是植物细胞膜Ca~(2+)主动运输体系的一个大类。本研究以高粱的CAX1基因(GenBank登录号为XM_002441593)为探针,利用电子克隆并结合RT-PCR技术,获得甘蔗CAX1基因的1条cDNA序列,命名为Sc CAX1(GenBank登录号为KT799799)。生物信息学分析显示,ScCAX1基因全长784 bp,包含1个645 bp的开放阅读框,编码1个214个氨基酸的蛋白质。ScCAX1蛋白被定位于叶绿体类囊体膜,为稳定的疏水性蛋白,不存在信号肽。蛋白二级结构元件多为α-螺旋,具有1个Na_Ca_ex superfamily。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗ScCAX1基因的表达具有组织特异性,在各组织中均表达,但在茎中表达量最低,叶中的表达量最高。在PEG、NaCl、SA、ABA和Me JA胁迫过程中,ScCAX1基因的表达均受到调控。其中ABA、SA和PEG胁迫下表达量上调,均在胁迫24 h达到最大值。SA胁迫24 h的表达量为对照的5.47倍,而ABA胁迫24 h的表达量为对照的3.5倍。NaCl胁迫6 h的表达量达最大值,为对照的2.14倍。推测ScCAX1基因能够响应逆境胁迫,其表达可能与甘蔗的抗盐、抗渗透胁迫性状有关。     

灭多威胁迫下罗非鱼精巢转录组变化及信号通路分析

应用高通量测序技术(RNA-seq),获得显著差异表达基因369条,160条基因显著下调,209条基因显著上调。其中显著差异表达基因在ECM与受体相互作用信号通路和MAPK信号通路中富集明显。分析发现,灭多威对精巢组织细胞粘附性造成影响,诱导ECM与受体相互作用中相关基因表达显著上调,如层粘连蛋白Laminins、整合素ɑ6、β1等,以稳定精巢组织结构；JNK途径中MAP3K、MKK4、JNK显著表达上调,增强录因子AP-1,促进 P53、Bax等促凋亡蛋白的表达；MAPK信号通路ERK途径中相关生长因子表达受到影响,从而可能对罗非鱼精巢组织生殖细胞增殖产生影响。     

红掌响应细菌性叶疫病的转录因子基因AanWRKY1的鉴定

WRKY家族转录因子参与植物各种生物胁迫和非生物胁迫反应,同时也参与形态建成、物质代谢、种子休眠、衰老等过程。本研究在前期红掌疫病诱导转录组数据中筛选到一个WRKY家族基因,RT-PCR扩增到1 658 bp全长cDNA,包含一个1 035 bp的开放阅读框,生物信息学分析预测此基因是一个典型的WRKY转录因子,命名为Aan WRKY1(NCBI No.KY597634)。qRT-PCR证实该基因叶片中受疫病侵染上调表达,同时能够被SA、JA、ABA、ETH、GA等激素信号分子诱导,非处理条件下在花梗和茎中表达量最高。通过农杆菌介导洋葱表皮侵染法,瞬时表达AanWRKY1-eGFP,显示该基因编码蛋白定位于细胞核,进一步酵母单杂交实验,证明该基因具有离体转录激活活性。研究结果表明红掌AanWRKY1基因能够响应细菌性疫病及其他胁迫反应,具有应激转录调控的作用,该基因的鉴定为进一步解析其分子病理学作用机理提供依据。     

过表达TaJRL53基因提高了小麦赤霉病抗性

Jacalin-related lectins(JRLs)是一种含有Jacalin结构域的植物凝集素,在植物应对生物胁迫和非生物胁迫过程中发挥重要作用。根据其糖结合特性被划分为半乳糖特异性JRL(gJRLs)和甘露糖或葡萄糖特异性JRL(mJRLs)两类。前期研究表明普通小麦TaJRL53编码一个具有Jacalin结构域和Dirigent结构域的蛋白,并能在赤霉菌的诱导下上调表达。由赤霉菌侵染引起的小麦赤霉病是一种毁灭性的病害,它不仅能够导致大幅度减产,而且使感病的麦粒品质下降。受真菌毒素污染的籽粒,严重影响人畜健康。为分析该基因在抗赤霉病方面的作用,本研究利用VIGS系统在小麦中沉默TaJRL53,导致了其对赤霉病的抗性减弱。通过基因枪的方法将该基因的过量表达载体导入到感赤霉病小麦品种中,增强了赤霉病抗性,其病小穗数,病轴长都明显缩短。在赤霉菌侵染后,ROS合成途径相关基因、JA信号通路中的主要标志基因、JA合成基因及病程相关蛋白基因在TaJRL53过量表达的转基因植株中明显高于它们在野生型中的表达量,因此推测TaJRL53提高小麦赤霉病抗性可能跟ROS和JA合成,JA信号转导途径有关。本研究增进了对小麦JRLs家族基因功能的了解,为解析TaJRL53抗赤霉病机制奠定了基础。     

马铃薯StBAG3基因cDNA的克隆及晚疫菌对其诱导表达

为了研究马铃薯内源BAG基因在晚疫病抗性建立中的作用,利用拟南芥和水稻的BAG基因保守序列,在马铃薯基因库中比对获得马铃薯内源StBAG3的基因序列。以StBAG3基因序列为模板设计引物,通过RT-PCR克隆得到了StBAG3基因cDNA序列。序列分析的结果表明,该基因开放阅读框为1026bp,编码341个氨基酸。蛋白二级结构预测结果表明,StBAG3具有UBQ和BAG2个保守功能域。StBAG3基因的表达谱分析结果显示,不同马铃薯品种中StBAG3基因表达水平存在差异,其中在冀张薯12号中表达量最高,而夏坡蒂中表达量最低。该基因在马铃薯不同组织中表达量测定结果表明,马铃薯茎中的表达水平最高,老叶中表达水平最低。接种晚疫菌后,StBAG3能够被显著上调并在接种48h后达到最高值,预示着StBAG3基因在马铃薯晚疫病抗性建立过程中具有一定的调控作用。     

拟南芥茉莉酸信号途径突变体jar1的灰葡萄孢菌抗性分析

为研究拟南芥JAR1 (At2g46370)基因在灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)抗性反应中的作用,从拟南芥生物资源中心获得其功能下降突变体jar1 (SALK_030821)。以纯合突变体为材料,将灰葡萄孢菌的孢子悬浮液接种到4周龄的拟南芥叶片上,统计接种后一周内植株病情指数。通过实时荧光定量RT-PCR测定灰葡萄孢菌肌动蛋白基因(B. cinerea actin)在拟南芥叶片中的表达量,分析了病原物的繁殖情况。结果发现,从接种后的第2天开始,jar1植株的病情指数显著高于野生型。qRT-PCR检测结果表明,在接种后的第三天,野生型植株中B. cinerea actin的表达量是对照的6.9倍,而jar1植株中B. cinerea actin的表达量是对照的20.2倍,说明病原物在jar1突变体叶片上的繁殖速度显著高于在野生型中的。本研究的结果初步表明JAR1基因参与拟南芥对灰葡萄孢菌的抗性调控。