棉花GhWRKY106-1的克隆与表达分析

为了研究WRKY转录因子对棉花抗枯萎病的作用机理,发掘抗枯萎病基因资源,本实验以枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱中筛选出的WRKY基因片段为探针,利用电子克隆结合RT-PCR技术,从陆地棉"中棉所12"根部c DNA克隆得到一个WRKY基因,命名为Gh WRKY106-1(登录号:KP202869)。序列分析表明,该基因开放阅读框全长918 bp,编码306个氨基酸,含有1个WRKY结构域和一个典型的C2HC锌指结构,属于典型的第Ⅲ类WRKY家族转录因子。q RT-PCR检测该基因在"中棉所12号"中的表达特性结果分析表明:枯萎病菌诱导后,该基因的表达量表现出先升高后降低的趋势,并且在处理后3 h基因的表达量达到最大。激素处理:茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)和乙烯(ET)胁迫后Gh WRKY106-1基因表达量均发生变化,其中茉莉酸在处理后4 h基因的表达量达到最大,而水杨酸和乙烯诱导响应最强烈的时间均在3 h;并且水杨酸诱导Gh WRKY106-1基因的表达较茉莉酸强烈,而乙烯的表达量在处理前期又明显高于水杨酸和茉莉酸,因此推测该基因在棉花对枯萎菌的抗性反应中起着一定作用,可为今后棉花抗枯萎病研究提供依据。     

棉花抗枯萎病相关转录因子基因GhERFB101的克隆与表达分析

为了探究ERF转录因子家族与棉花枯萎病抗性之间的关系,也为海岛抗枯萎病品种的选育工作提供新的基因资源,从Solexa高通量测序技术建立的棉花基因表达谱中筛选探针序列,通过电子克隆结合RT-PCR技术从高抗枯萎病的棉花品种中棉所12中克隆到一个新的ERF-B1亚组转录因子基因,命名为Gh ERFB101(Gen Bank:KF850521)。序列分析表明,该基因开放阅读框738 bp,编码245个氨基酸,含有一个保守的AP2/ERF结构域,在进化上与拟南芥At ERF11的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,枯萎病菌诱导后,Gh ERFB101基因在抗病品种根中的表达量呈现下降趋势;而在感病品种中,该基因呈上调表达,随着病菌处理后时间延长,其表达量呈现先增加后降低的变化趋势,在病菌处理后12 h表达量达到最大,在48 h下降到最低。乙烯和茉莉酸诱导后,该基因表达量均呈现明显的先增加后降低的变化趋势,在乙烯处理后2 h基因的表达量达到最大;茉莉酸则在处理后1 h基因的表达量达到最大;而水杨酸诱导后基因的变化幅度不大;推测该基因可能通过茉莉酸、乙烯信号传导途径参与对枯萎病菌的防御反应。     

棉花ERF-B3亚组转录因子基因GhERF5-3的克隆及表达

植物在受到病原菌侵染时,ERF转录因子被诱导调控抗病相关基因的表达。为了研究棉花AP2/ERF-B3类转录因子在棉花抗病调控中的作用,用电子克隆及RT-PCR技术,从陆地棉抗枯萎品种‘中棉所12’根部c DNA克隆得到一个新的ERF转录因子Gh ERF5-3(登录号:MF197875)。利用q RT-PCR检测枯萎病及不同激素处理后该基因的表达。结果表明:其c DNA全长为672 bp,编码223个氨基酸,分子量24.95 k D,等电点为9.04,含有一个典型的保守AP2结构域,通过进化树分析属于B3亚组。枯萎病菌侵染后,随着侵染时间的延长,Gh ERF5-3基因呈现出先增后降的趋势,在24 h时间点,其相对表达量达到峰值;ET和Me JA处理后,Gh ERF5-3基因呈上调表达。SA处理后为下调表达。推断Gh ERF5-3基因响应枯萎病菌。     

苹果MdVQs基因响应SA、JA及斑点落叶病的表达分析

VQ家族是一类植物转录调控辅助因子,参与调节植物生长发育以及防御反应。本研究根据水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)以及已报道的苹果斑点落叶病菌(Alternaria alternata apple pathotype)处理下苹果不同组织的转录组数据,采用Array、RT-qPCR和RNA-Seq检测和分析苹果品种‘Gala’的20个MdVQs基因的表达模式。Array结果表明,MdVQs基因在苹果各组织部位中都有高表达;RT-qPCR结果表明,多数MdVQs基因在早期响应激素信号,其中14个MdVQs基因受两种激素共同响应,MdVQ19只响应SA诱导表达,MdVQ5、MdVQ12、MdVQ16、MdVQ35、MdVQ47只响应JA且Md VQ47表达显著受抑制;RNA-Seq结果表明,MdVQs基因除在后期个别时间段下调表达外,其余时间段均上调表达,其中MdVQ21、MdVQ27、MdVQ42上调表达显著。MdVQs基因家族可能在响应SA、JA信号途径以及生物胁迫中存在潜在重要作用。该研究结果为深入解析MdVQs基因在苹果防卫生物胁迫中的功能提供参考。     

棉花WRKY22基因分离及其对黄萎病的抗性分析

为了克隆棉花抗黄萎病相关基因,利用生物信息学、病毒诱导基因沉默技术(VIGS)、实时定量PCR(q PCR)和接菌分析来研究棉花WRKY基因对大丽轮枝菌的诱导响应和抗性。结果从棉花中筛选出8个与拟南芥直系同源的棉花抗病相关WRKY基因,这些直系同源WRKY基因表达受到大丽轮枝菌浸染诱导响应。其中有6个GhWRKY基因的表达均受到大丽轮枝菌诱导上调,而GhWRKY70和GhWRKY48的表达量随着不同的时间点呈现上调或下调。GhWRKY22等5个基因表达量在24,72 h分别表现为上调,呈现出双峰曲线。对GhWRKY22表达特征进一步分析,结果显示,GhWRKY22基因在茎里优势表达,同时表达受到大丽轮枝菌、水杨酸和茉莉酸激素的诱导。GhWRKY22基因沉默植株对大丽轮枝菌的敏感性增加,抗病标志基因(PR1、PR3、PR4、PR5、PAL和PDF1. 2)表达量也显著降低,揭示GhWRKY22是通过SA和JA信号途径参与棉花对大丽轮枝菌的响应过程。总之,棉花中8个WRKY基因参与棉花对黄萎病抗性调控,其中GhWRKY22基因正调控棉花的抗性,可作为棉花抗病育种的候选基因。     

棉花早衰的分子机理研究进展

早衰是棉花生长发育的一种异常现象,是大量衰老相关基因差异表达的结果。早衰棉花光合作用、碳水化合物和其他生物大分子合成相关基因大多下调表达,而蛋白、核苷酸、脂类降解和氨基酸、糖类、嘌呤、嘧啶和离子转运体等养分循环利用相关基因大多上调表达;脱落酸(ABA)、乙烯、生长素、茉莉酸(JA)和赤霉素(GA)相关基因大多上调表达,而细胞分裂素合成基因IPT下调表达;NAC和WRKY等转录因子基因也大多上调表达。结合作者在该领域的研究,总结评述了光合作用及大分子降解、养分循环利用、激素和转录因子相关基因在早衰棉花中的表达模式及作用机理。     

玉米抗禾谷镰刀菌的转录组分析

赤霉菌茎腐病是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum,有性态,Gibberella zeae)引起的一类土传性病害,严重危害玉米的产量和品质。本研究依据玉米第10和第1染色体上的2个抗茎腐病QTL,qRfg1和qRfg2,培育近等基因系NIL-R (2个QTL位点均为抗病等位基因)和NIL-S (2个QTL均为感病等位基因)。在成株期和幼苗期接种禾谷镰刀菌,两近等基因系的抗性差异均显著。用2个近等基因系的幼根接种禾谷镰刀菌,进行转录组分析研究。结果表明,与NIL-S相比,NIL-R在接种禾谷镰刀菌后,乙烯(ethylene,ET)合成、信号途径基因,病程相关蛋白、脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素(deoxynivalenol,DON)解毒基因等呈现特异上调表达。与NIL-S相比,有1170个基因在NIL-R对照组中表达量较高,其中水杨酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)和乙烯合成和信号介导途径以及苯丙烷合成途径中的基因显著富集;接种禾谷镰刀菌6 h或18 h后,病程相关蛋白、激素JA和ET合成基因、DON解毒基因在NIL-R中表达量较高。     

响应辣椒疫霉菌诱导的CaWRKY转录因子筛选及其信号通路分析

在辣椒基因组中全面鉴定WRKY转录因子并筛选出受辣椒疫霉菌诱导的CaWRKY基因,并分析关键CaWRKY基因参与的信号通路。以CM334和NMCA10399为材料,基于辣椒基因组和RNA-seq数据,并在水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理下通过qRT-PCR技术检测基因表达并分析。全基因组共鉴定出69个CaWRKY基因。接菌后12 h,抗、感材料中分别鉴定出7个和3个差异表达基因;接菌后36 h,分别有13个和22个差异表达基因,表明抗病材料能更快速应答。在筛选出的8个关键CaWRKY基因中,CaWRKY19和CaWRKY65受SA诱导上调表达;CaWRKY50受MeJA诱导上调表达;CaWRKY25受SA诱导上调表达同时受到MeJA抑制下调表达,而CaWRKY49同时受SA和MeJA抑制下调表达,推测CaWRKY19和CaWRKY65通过SA,CaWRKY50通过JA,而CaWRKY25和CaWRKY49则通过SA和JA信号途径参与辣椒抗疫病防御反应。     

棉花酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)家族基因的发掘及在非生物胁迫抗性中的功能鉴定

酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)家族基因在植物正常生长发育、响应逆境胁迫及生物膜修复等方面具有重要作用。本研究基于陆地棉(Gossypium hirsutum)遗传标准系TM-1基因组序列信息,鉴定并获得21个棉花ACBP家族基因成员的全序列和染色体定位等信息。聚类分析表明这21个基因分属于I~IV类。依据与拟南芥的同源性,将棉花ACBP家族基因命名为GhACBP1~GhACBP6等6大亚类。转录组分析表明,该家族基因在不同组织、不同发育时期表达差异较大。不同逆境诱导分析表明,GhACBP1、GhACBP3和GhACBP6显著受盐、旱、低温、高温逆境胁迫诱导,而GhACBP4和GhACBP5对逆境胁迫响应不强烈。进一步分析表明,GhACBP3和GhACBP6的表达受过氧化氢(H2O2)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、脱落酸(ABA)和乙烯(ET)的诱导。病毒诱导的基因沉默(VIGS)试验表明,沉默GhACBP3和GhACBP6亚类基因会降低棉花植株对干旱和盐的耐性。目标基因沉默后,植株干物质积累下降,株高变矮,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性降低,丙二醛(MDA)含量升高,表明GhACBP3和GhACBP6在棉花抗旱、耐盐中发挥作用。研究为利用ACBP家族基因进行棉花抗逆性研究及应用提供参考。     

溃疡病不同抗性杨树SA和JA信号转导相关基因的差异表达分析

为了探讨抗、感病杨树品种受欧美杨细菌性溃疡病菌(Lonsdalea quercina subsp. Populi)诱导后植物激素相关基因的差异表达规律,为阐明杨树抵抗溃疡病菌的防卫反应机制提供试验依据。筛选了12SA和JA信号转导的相关基因,利用实时定量PCR技术分析了抗病树种‘毛白杨’(Populus tomentosa)和感病树种‘中菏1 号’(P. deltoids cv.‘Zhonghe 1’)在接种溃疡病菌后不同时间段（1、3、6、9 天）各基因的表达动态差异。结果显示,在溃疡病菌胁迫下,基因PR1-1、PR1-2、NPR1-1、NPR1-2、TGA1、TGA2、MYC2-1、MYC2-2 在抗病品种中有更高的表达量,尤其是基因PR1-1、MYC2-1、MYC2-2;基因JAZ1、COI1-1、COI1-2 在抗、感品种接种溃疡病菌后的前期皆为普遍下调表达,但在抗病品种中表达量更低;基因JAZ2 在抗、感品种中的表达量变化不大。该研究初步表明,抗病品种‘毛白杨’对溃疡病的抗性是溃疡病菌诱导了基因PR1-1、PR1-2、NPR1-1、NPR1-2、TGA1、TGA2、MYC2-1、MYC2-2 的上调表达以及基因JAZ1、COI1-1、COI1-2的下调表达,开启了SA和JA信号转导通路的结果。     

β-氨基丁酸早期诱导表达基因StWRKY5参与马铃薯晚疫病抗性

β-氨基丁酸(β-aminobutyric acid,BABA)诱导能够增强马铃薯对晚疫病的抗性。本研究从马铃薯中克隆了一个WRKY转录因子家族的基因St WRKY5。c DNA-AFLP表达谱研究表明,BABA(2 mmol/L)处理马铃薯6 h后该基因明显上调表达,晚疫病菌(Phytophthora infestans)接种16 h后上调表达。半定量RT-PCR检测表明水杨酸SA(10μmol/L)处理马铃薯离体叶片4 h后该基因上调表达,茉莉酸甲酯Me JA(50μmol/L)诱导12 h后开始表达,机械伤害处理24 h后,该基因表达也会增强,表明该基因参与多种生物和非生物因子的胁迫反应。通过稳定转化获得了超量表达St WRKY5的转基因马铃薯株系。采用离体叶片接种鉴定方法对转基因马铃薯株系晚疫病抗性进行了鉴定,研究结果显示接种4 d后超量表达转基因株系其病斑面积均显著小于对照,表明在马铃薯中超量表达St WRKY5提高了晚疫病抗性。     

AP2/ERF转录因子对植物非生物胁迫的应答机制研究进展

AP2/ERF (APETALA2/ethylene responsive factor)家族转录因子是植物中的一大类转录因子,最早从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中分离出。该家族转录因子一般包含两个AP2/ERF结构域,该结构域大约由60～70个氨基酸组成与DNA结合有关。AP2/ERF家族参与非生物胁迫的反应,比如干旱胁迫、高盐胁迫和低温胁迫等。这些胁迫会激活植物激素ABA、茉莉酸(jasmonate, JA)、乙烯(ethylene, ET)、水杨酸(salicylic acid, SA)等信号途径,同时激活AP2/ERF转录因子家族基因的表达,进而调控其下游功能基因的表达。本研究综述了近年来有关植物AP2/ERF转录因子响应非生物胁迫应答机制的新进展,探讨了该家族转录因子的结构特点、分布,及其对植物发育和次级代谢的影响以及对非生物胁迫的应答。     

橡胶树皮乳管组织茉莉酸诱导相关因子AP2/EREBP基因的克隆与表达分析

摘要：茉莉酸（jasmonic acid,JA）可诱导橡胶树（Hevea brasiliensis Muell.Arg.）乳管分化,是乳管分化的关键信号分子。目前,对JA诱导橡胶树乳管分化的分子机理仍然不清楚。我们在前期研究中通过筛选JA刺激乳管分化时期的橡胶树树皮组织cDNA差减文库,获得了4条与茉莉酸诱导乳管分化相关的AP2/EREBP家族转录因子基因的EST。本研究在此基础上,采用RACE法完整地克隆了这4个AP2/EREBP转录因子基因的开放阅读框,蛋白氨基酸序列分析表明其中3个属于ERF亚类,1个属于RAV亚类;表达分析发现,这4个基因在乳管分化时期的橡胶树树皮组织的表达受JA诱导,随JA处理时间的延长,其表达量先增强后减弱,推测它们可能在JA诱导橡胶树乳管分化过程中起着重要的调控作用。     

病原诱导的中间偃麦草ERF转录因子基因的克隆及其表达特性

应用RT-PCR、RACE技术，从病原诱导的中间偃麦草叶片cDNA中，分离出1个编码ERF基因的全长cDNA序列，该基因暂命名为TiERF1a，编码由292个氨基酸组成的蛋白质，具有ERF转录因子典型的结构，即保守的AP2/ERF DNA 结合域、核定位位点和酸性激活区。TiERF1a的氨基酸序列与一个水稻ERF蛋白OsBIERF3具有66%的同源性，与拟南芥AtERF1同源性仅39.7%，为植物ERF转录因子家族B3亚群的一个新成员。表达分析结果表明，纹枯病菌、赤霉病菌侵染可诱导TiERF1a基因的上调表达，与防卫相关的激素乙烯、茉莉酸也可诱导该基因上调表达，且TiERF1a对外源乙烯、茉莉酸的响应时期早于对纹枯病菌、赤霉病菌响应时期，说明TiERF1a可能通过乙烯、茉莉酸信号途径参与寄主调控对纹枯病菌、赤霉病菌的防御反应。     

植物生长调节剂与杀菌剂互作防治棉花枯萎病及增效作用探究

本实验旨在筛选出能有效防治棉花枯萎病的植物生长调节剂与杀菌剂组合，并探究其增效机理，为植物生长调节剂与杀菌剂互作防治棉花枯萎病提供技术指导和理论依据。通过室内毒力测定挑选EC₅₀最小的2种杀菌剂；通过种子活力和分生孢子萌发实验确定植物生长调节剂的最适浓度；两者混用进行室内盆栽试验，测定两者互作的防治效果及增效作用；通过q RT-PCR测定茉莉酸(jasmonic acid,JA)和水杨酸(salicylic acid,SA)途径相关基因在棉花中的表达量。试验结果发现，5种杀菌剂中多菌灵和萎锈灵的EC₅₀最小，对枯萎病菌的毒力最强，EC₅₀分别为13.894 mg/L和29.566 mg/L；综合苄氨基嘌呤和萘乙酸2种植物生长调节剂对种子活力的影响和对枯萎病菌分生孢子萌发的影响，得到其最适防治浓度分别为5 mg/L和50 mg/L。杀菌剂与植物生长调节剂互作防治棉花枯萎病效果最好的为苄氨基嘌呤与多菌灵组合，防效可达80.95%，且具有显著增效作用；qRT-PCR结果显示，JA和SA途径相关基因在药剂处理的棉花中的相对表达显...     

ERF转录因子对生物胁迫的反应及对棉花抗性改良的意义

大量研究表明植物中ERF(ethylene responsive factor)类转录因子广泛参与外界环境胁迫应答基因表达的调控.它编码的蛋白能够特异结合GCC-box元件,从而调控启动子含有GCC-box的病程相关蛋白基因的表达,在植物抗病反应中发挥重要的调控作用.棉花中ERF基因表达受生物和非生物胁迫诱导,并在乙烯、茉莉酸和水杨酸信号传导途径中发挥一定的作用.一些ERF基因在转基因植物中的超表达表现出了一定的广谱抗性,因而在棉花分子育种中具有较为广阔的应用前景.本文主要论述了棉花等植物中ERF的结构与功能特征,当前相关研究进展,及其对棉花抗病性分子遗传改良的意义.     

红掌响应细菌性叶疫病的转录因子基因AanWRKY1的鉴定

WRKY家族转录因子参与植物各种生物胁迫和非生物胁迫反应,同时也参与形态建成、物质代谢、种子休眠、衰老等过程。本研究在前期红掌疫病诱导转录组数据中筛选到一个WRKY家族基因,RT-PCR扩增到1 658 bp全长cDNA,包含一个1 035 bp的开放阅读框,生物信息学分析预测此基因是一个典型的WRKY转录因子,命名为Aan WRKY1(NCBI No.KY597634)。qRT-PCR证实该基因叶片中受疫病侵染上调表达,同时能够被SA、JA、ABA、ETH、GA等激素信号分子诱导,非处理条件下在花梗和茎中表达量最高。通过农杆菌介导洋葱表皮侵染法,瞬时表达AanWRKY1-eGFP,显示该基因编码蛋白定位于细胞核,进一步酵母单杂交实验,证明该基因具有离体转录激活活性。研究结果表明红掌AanWRKY1基因能够响应细菌性疫病及其他胁迫反应,具有应激转录调控的作用,该基因的鉴定为进一步解析其分子病理学作用机理提供依据。     

棉花GhIQM1基因克隆及抗黄萎病功能分析

棉花是我国重要的经济作物,而黄萎病(Verticillium wilt)是棉花生产上的主要病害,严重危害棉花产量和纤维品质。本研究通过转录组数据分析筛选出1个与棉花抗病相关、不依赖Ca²⁺的钙调素结合蛋白基因GhIQM1。该基因受黄萎病菌和水杨酸(SA)诱导表达。利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术研究其在棉花抗黄萎病中的功能发现,抑制GhIQM1基因表达增强了植株对黄萎病的抗性, TRV:GhIQM1植株病情指数、维管束褐化程度、体内病原菌积累量都显著低于TRV:00。qRT-PCR分析表明,抑制GhIQM1表达的植株接种黄萎病后,作为参与水杨酸途径中的3个重要基因NPR1、NPR3和PR5的表达量显著高于对照。以上结果初步表明,GhIQM1基因可能通过抑制SA途径负调控了棉花的黄萎病抗性。     

Ca2+和茉莉酸对菠菜CBF表达的影响

为探究钙离子、茉莉酸（Jasmonic acid,JA）对菠菜CBF转录因子表达的影响。以菠菜（Spinacia oleracea L.）为材料,对其进行低温(4℃)或JA处理、或用钙离子载体A23187预处理菠菜幼苗,利用Northern印迹技术检测各处理时CBF的表达情况。结果表明,低温和JA均可诱导菠菜中CBF基因的表达。推测低温可能首先导致细胞中JA含量升高,JA通过一定的机制诱导细胞质基质中游离钙离子浓度（[Ca2+]cyt）升高,然后Ca2＋可能通过CaM (Calmodulin)或CaM相关蛋白传递低温信号,从而诱导CBF的表达。