林烟草NsylCBL10互作蛋白激酶NsylCIPK的鉴定与分析

植物中的类钙调神经素B亚基蛋白CBL (calcineurin B-like protein)家族成员与其互作蛋白激酶CIPK (CBL-interacting kinase protein)家族成员形成了复杂精细的CBL-CIPK信号调控网络,在解码生物和非生物胁迫激发的钙信号及信号的进一步传导中发挥重要作用。CBL家族成员CBL10参与植物抵抗高盐胁迫、应对病菌侵染、参与分生组织和花器官发育、调节离子平衡等多个过程,对其下游互作CIPK家族成员的筛选与鉴定对于明确上述调节机制至关重要。为了鉴定林烟草(Nicotiana sylvestris) NsylCBL10下游互作NsylCIPK家族成员,本研究首先以拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtCIPK家族成员和水稻(Oryza sativa) OsCIPK家族成员基因的CDS序列为检索序列,利用NCBI和中国烟草基因组数据库对林烟草中可能存在的NsylCIPK家族成员进行了预测;然后通过RT-PCR方法对预测到的NsylCIPK家族成员进行了克隆并利用生物学分析软件对其基因结构和蛋白保守结构域进行了分析;最后通过酵母双杂交实验鉴定了与Nsyl CBL10互作的NsylCIPK家族成员。结果表明,在林烟草中可能存在28个NsylCIPK家族成员,实际克隆获得了20个NsylCIPK家族成员,在酵母双杂交体系中与NsylCBL10互作的只有1个NsylCIPK家族成员Nsyl CIPK14a。本研究为解析林烟草及其他物种中CBL-CIPK信号通路的调节功能提供了试验数据。     

植物CBL-CIPK信号通路响应非生物胁迫作用机制的研究进展

环境胁迫是阻止植物生长和发育的关键性因素。类钙调磷酸酶B亚基蛋白CBLs与其互作蛋白激酶CIPKs组成的CBL-CIPK信号系统是一种基本的钙感受器,在感知不利的环境条件时起到重要的作用。近几年,CBL-CIPK复合体的研究主要集中于逆境条件下其如何调控下游靶点,例如:离子通道和转运蛋白。文章主要对CBL和CIPK家族的结构特征、CBL-CIPK复合体抵御环境胁迫和植物激素应答的研究进展进行了综述,并对未来CBL-CIPK信号系统研究的重要方向做出了展望。     

玉米ZmCIPK24-2基因在盐胁迫应答中的功能研究

土壤盐化会影响作物正常生长发育,导致农作物减产。植物在长期适应环境的过程中,进化出了相应的耐盐分子机制。钙调磷酸酶B类蛋白(CBL)及CBL互作蛋白激酶(CIPK)参与植物对盐胁迫的响应。本研究鉴定到一个拟南芥AtSOS2的同源基因ZmCIPK24-2,实时荧光定量聚合酶链式反应结果表明ZmCIPK24-2基因在玉米各组织部位广泛表达,其中在花粉表达量最高;ZmCIPK24-2受盐胁迫诱导表达。ZmCIPK24-2能部分互补拟南芥atsos2突变体的盐敏感表型,在高盐浓度下转基因株系比atsos2突变体的存活率显著提高,根长显著增长。亚细胞定位实验表明ZmCIPK24-2定位于细胞质、细胞膜与核膜。利用酵母双杂交实验及LUC互补成像实验发现ZmCIPK24-2与玉米CBLs家族中的ZmCBL1、ZmCBL4、ZmCBL8和ZmCBL9互作。本研究为解析玉米CBL-CIPK信号通路的功能提供了新的实验证据。     

铁皮石斛CIPK24与CBL1的互作及盐胁迫下的表达分析

为研究铁皮石斛(Dendrobium catenatum Lindl.)应对盐胁迫的抗性机制,利用PCR技术从铁皮石斛cDNA中克隆丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因CIPK24和类钙调素B亚基蛋白基因CBL1,用生物信息学技术对其编码蛋白的进化关系进行了分析;采用实时荧光定量PCR技术分析它们的表达模式;并构建酵母表达载体,利用酵母双杂交技术研究这两个蛋白的互作关系。结果表明,铁皮石斛CIPK24和CBL1分别与拟南芥CIPK24以及CBL1蛋白的亲缘关系最近;空间表达模式分析发现CIPK24和CBL1基因在花萼、合蕊柱等生殖器官中表达量较高,而在营养器官中表达量较低;盐处理铁皮石斛组培苗后,CIPK24在根中受盐胁迫诱导上调表达,在茎和叶中表达量变化不明显;而CBL1基因在根和叶中受盐胁迫诱导均呈现上调表达,且根中CIPK24和CBL1基因的表达模式相似。酵母双杂交结果表明铁皮石斛CIPK24和CBL1蛋白能够互作。本研究表明,根中CIPK24和CBL1通过互作可能在铁皮石斛响应盐胁迫中起到重要作用,为进一步研究铁皮石斛耐盐性提供理论参考。     

过表达ZmCIPKHT基因增强植物耐热性

高温胁迫对植物正常生长发育及产量的影响越来越显著。为了适应外界环境的变化,植物进化出了一系列应对高温胁迫的分子遗传机制。类钙调磷酸酶B蛋白(CBL)互作蛋白激酶(CIPK),在ABA信号转导途径上积极参与植物对高温胁迫的响应。在前期全基因组关联分析的基础上,本实验克隆了一个与玉米耐高温性状相关的候选基因ZmCIPKHT, qRT-PCR结果表明ZmCIPKHT基因受高温胁迫的显著诱导。室内表型鉴定的实验发现过表达ZmCIPKHT的转基因拟南芥植株在高温胁迫下,比野生型的存活率显著提高,生长状态更好。玉米原生质体瞬时转化实验证明ZmCIPKHT蛋白定位于细胞核中。酵母双杂交实验验证了ZmCIPKHT蛋白与玉米CBLs家族中的ZmCBL4蛋白存在互作关系。同时, ZmCIPKHT转基因拟南芥在高温胁迫条件下,脱落酸(ABA)通路相关基因的表达水平有其相应的变化,揭示了ZmCIPKHT可能依赖于ABA信号转导通路来增强植物的耐热性。这些结果为解析玉米CBL-CIPK信号通路依赖于ABA途径对植物非生物胁迫响应的分子机制提供了新的实验根据。     

酵母双杂交系统筛选马铃薯StMAPKK1互作蛋白及其生物信息学分析

促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)级联反应是参与植物生长发育、激素及胁迫的响应信号通路中重要而复杂的信号网络之一。促分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase kinase, MAPKK)是其主要成员之一,是该级联反应中位于通路中间、对信号传递起着收集和发散的关键作用的激酶。已有研究表明马铃薯(Solanum tuberosum L.) StMAPKK1基因响应干旱胁迫。本研究采用同源重组的克隆方式构建了StMAPKK1的诱饵载体pGBKT7-StMAPKK1,通过酵母(Saccharomyces cerevisiae)双杂交系统筛选马铃薯c DNA文库,共得到5种StMAPKK1互作蛋白,并利用小规模杂交回转验证对互作真实性进行了验证。通过生物信息学分析鉴定这5种StMAPKK1互作蛋白分别为水解酶(水解O-糖基化合物)、RING-H2亚家族RHE蛋白、氰酸酯酶、ARF GTPase活化因子以及一个含有C2结构域的蛋白。本研究结果为进一步研究马铃薯St MAPKK1所参与信号通路及其生物功能提供理论依据。     

木薯MeSAUR1互作蛋白的筛选及鉴定

木薯MeAGPS1a基因编码的小亚基是淀粉合成关键酶AGPase的催化中心,前期研究发现MeSAUR1转录因子可结合MeAGPS1a基因启动子并调控该基因表达。采用酵母双杂交技术筛选MeSAUR1转录因子的互作蛋白,可进一步解析MeAGPS1a基因表达的分子调控网络。本研究构建了MeSAUR1的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-MeSAUR1,采用酵母双杂交技术从木薯cDNA文库中筛选MeSAUR1的候选互作蛋白,结果共筛选出31个阳性克隆。通过酵母双杂交点对点实验验证了候选互作蛋白MePP2C与MeSAUR1的互作关系,本研究结果有助于揭示Me SAUR1蛋白调控木薯淀粉合成的互作网络。     

甜菜BvM14-STPK蛋白激酶互作蛋白的鉴定及筛选

为进一步探究BvM14-STPK蛋白激酶在甜菜中应答盐胁迫的信号途径,本研究对BvM14-STPK蛋白激酶进行了互作蛋白的鉴定及筛选。使用转基因技术获得转基因烟草,使用亲和纯化串联质谱技术鉴定蛋白复合物,通过搜索烟草蛋白质数据库,获得BvM14-STPK蛋白激酶的候选互作蛋白;使用实验室甜菜M14品系盐胁迫转录组数据,对得到的互作蛋白的编码基因进行盐胁迫下的转录水平分析。结果表明,在烟草数据库中,非盐处理条件下获得3个BvM14-STPK蛋白候选互作蛋白质,盐处理条件下获得6个候选互作蛋白质;经过盐胁迫转录组数据分析,发现有4个互作蛋白编码基因在不同的组织部位、不同的盐浓度条件下应答盐胁迫。为后续进一步在植物体内验证BvM14-STPK蛋白激酶与候选互作蛋白的相互作用及甜菜抗盐机理奠定良好的基础。     

辣椒14-3-3蛋白基因家族全基因组鉴定与表达特征分析

14-3-3蛋白(GRF)基因家族通过与靶蛋白相互作用,广泛参与植物激素信号转导和生理代谢过程,在植株生长发育和逆境响应中发挥重要作用。本研究以辣椒(Capsicum annuum)为材料,利用生物信息学研究方法,鉴定得到15个辣椒14-3-3基因家族成员,命名为CaGRF1～CaGRF15。系统分析了CaGRF基因家族成员的结构、进化关系、启动子顺式作用元件、组织及冷胁迫表达,并对CaGRF蛋白互作网络进行预测。结果表明,根据进化关系CaGRF家族成员被分为ε类和非ε类,ε类CaGRF含有更多外显子和内含子;启动子序列分析发现CaGRF启动子中有多个响应激素、胁迫、光的顺式作用元件;表达分析表明CaGRF各成员在辣椒各组织和冷胁迫响应中特异性表达;蛋白互作网络预测发现CaGRF可能与氮代谢、质子转运、转录调控相关蛋白互作。本研究为深入研究辣椒14-3-3家族成员功能及调控途径提供了参考。     

拟南芥ROP2与GGB蛋白互作的分析

为了阐明拟南芥ROP蛋白家族成员ROP2与蛋白异戊二烯化中I型香叶酰基的β亚基GGB的互作关系,本研究先后采用酵母双杂交和三杂交技术分析了两者之间的相互作用。结果表明,ROP2与GGB之间在酵母细胞中并没有发生相互作用。我们又采用双分子荧光互补(BiFC)技术在植物体内再次验证两者之间的相互作用。重新构建了一套带多克隆位点的常规BiFC重组表达载体,基于这套BiFC载体,进行了验证分析。结果表明,实验组在本氏烟草的表皮细胞中发现了黄色荧光信号,并且信号定位在细胞膜上,而阴性对照组未发现荧光信号,说明GGB蛋白与ROP2蛋白在植物体内存在相互作用,并且这种相互作用发生在细胞膜上。本研究结果为进一步揭示ROP2的生化调控机制奠定了前期基础。     

植物光调蛋白激酶PPKs作用机制的研究进展

蛋白激酶(Protein kinases)又称蛋白质磷酸化酶,能够催化蛋白质分子中丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)及酪氨酸(Tyr)残基的磷酸化反应。Ⅰ型酪蛋白激酶(casein kinaseⅠ,CK1)是一类Ser/Thr蛋白激酶,从酵母到哺乳动物中都非常保守。近期研究发现,拟南芥中存在一类蛋白激酶能够在光下特异催化重要光受体及光信号蛋白的磷酸化,故将其命名为光调蛋白激酶(photoregulatory protein kinases,PPKs)。通过序列分析发现,PPKs与Ⅰ型酪蛋白激酶同源,但在功能和结构上都有别于Ⅰ型酪蛋白激酶。拟南芥中,PPK家族主要由4个成员组成:PPK1、PPK2、PPK3和PPK4。PPKs广泛参与多种植物生理过程,在调节植物生长发育中发挥重要作用。本研究对拟南芥蛋白激酶PPKs信号转导途径的相关研究进行探讨,旨在总结目前关于PPKs调控植物生长发育分子机制的认识。     

小麦TaCIPK3与TaCBLs的互作分析

植物类钙调磷酸酶B蛋白CBLs(Calcineurin B-like proteins)和CBL互作蛋白激酶CIPKs(CBL-interacting protein kinases)在应答非生物逆境的钙信号系统中起着重要作用。为了研究小麦TaCIPK3的互作调控网络,以普通六倍体小麦(Triticum aestivum)品种矮抗58的叶片c DNA为模板,PCR扩增获得TaCIPK3的编码序列。TaCIPK3基因开放阅读框(ORF)长1348 bp,编码447个氨基酸。生物信息学分析显示TaCIPK3的N-端催化结构域含有CIPK家族蛋白的典型激活环,C-端调节域含有该家族高度保守的24个氨基酸NAF基序,具有丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶的结构特征。利用酵母双杂交体系对TaCIPK3与TaCBL1、TaCBL2、TaCBL3、TaCBL4、TaCBL6、TaCBL7、TaCBL9进行相互作用鉴定,发现分别转化有p GADT7-TaCIPK3×p GBKT7-Ta CBL1、p GADT7-TaCIPK3×p GBKT7-Ta-CBL2、p GADT7-TaCIPK3×p GBKT7-Ta CBL3和p GADT7-TaCIPK3×p GBKT7-Ta CBL4的二倍体酵母菌能够在二缺培养基SD/-Trp/-Leu平板上长出白色菌落,同时这些二倍体菌株在四缺培养基SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His/X-α-Gal/Ab A上能够长出淡蓝色菌落,表明下游的4个报告基因ADE2、HIS3、MEL1和AUR1-C被激活,因此说明TaCIPK3与TaCBL1、TaCBL2、TaCBL3和TaCBL4之间存在互作。本研究结果对进一步研究TaCIPK3的生物学功能以及与TaCBLs的互作网络具有一定的参考作用。     

叉柱棉sHSP基因家族的鉴定与特征分析

植物小分子热激蛋白(small heat shock protein, sHSP)是植物热激蛋白中一类分子量最小的基因家族,该家族具有保守的α-晶体结构域,在响应外界环境胁迫过程中具有重要的作用。叉柱棉(Gossypioides kirkii)有关sHSP家族的鉴定与特征分析还未见相关报道。本研究在叉柱棉中共鉴定了39个GksHSP成员,并且可以将GksHSP成员进一步分为10个亚家族。在GksHSP家族中发现了7个基因复制事件,并且所有的基因复制事件都是片段复制事件。棉属特有的全基因组复制事件主要导致了GksHSP成员的扩增,其扩增还与蛋白激酶家族、线粒体载体蛋白家族以及植物生长素响应蛋白家族有关。此外, GksHSP家族可能与ABA和茉莉酸甲酯调控的胁迫响应相关,并且GksHSP26成员及其在陆地棉中的同源基因可能在胁迫响应中具有关键的作用。本研究的结果可以进一步为今后叉柱棉和棉花的抗逆育种研究提供一定的理论基础。     

棉属野生种旱地棉蛋白激酶基因GarCIPK8的克隆与功能分析

CIPK (calcineurin B-like calcium sensor interacting protein kinase)是植物钙感受器钙调磷酸酶B类似蛋白特定靶向的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在前期的研究中, 我们将棉属野生种D亚组旱地棉(Gossypium aridum)盐胁迫前后RNA混合样品进行转录组测序, 发现一CIPK相关基因存在较高的转录丰度。盐胁迫下荧光定量PCR分析表明该基因在根部表现诱导上调表达, 推测该基因可能参与植物在高盐胁迫下的生理调控。利用电子克隆及RT-PCR方法从旱地棉中克隆了一个ORF全长为1350 bp的蛋白激酶基因GarCIPK8。序列分析表明该基因编码的蛋白含有449个氨基酸, 分子量为51.12 kD, 理论等电点为8.13, 其N端催化结构域包含一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶域, C端具有植物CIPK蛋白家族特有的24个氨基酸组成的NAF保守结构域; 与水稻OsCIPK8蛋白的相似度为73.95%。为进一步验证其功能, 利用组成型高效强启动子CaMV35S和拟南芥逆境胁迫启动子rd29A构建植物表达载体并转化烟草, 经PCR和RT-PCR分子检测, 证明GarCIPK8基因已经整合到烟草基因组中, 并正常表达。T₁代转基因植株耐盐性鉴定结果表明GarCIPK8基因对提高转基因植株的耐盐性有较明显的作用, PEG干旱模拟试验也证明GarCIPK8基因可增强植株的抗旱性。     

马铃薯StMAPKK4基因表达分析及互作蛋白筛选与鉴定

MAPKKs是促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)级联反应主要成员之一,位于该级联反应通路中间,对信号传递起着收集和发散的关键作用。有研究表明马铃薯StMAPKK4基因响应干旱胁迫,为进一步探究该基因的生物学功能,本研究对StMAPKK4基因进行了生物信息学分析。结果表明, StMAPKK4与科民茄亲缘关系最近。其含有蛋白激酶家族的Proteinkinasedomain(PF00069)结构域,位置定位于64～302aa之间。StMAPKK4含有多个激素(茉莉酸甲酯、乙烯、脱落酸、ABA)及胁迫相关响应元件。qRT-PCR分析结果表明, StMAPKK4基因在马铃薯茎中表达量最高,且在干旱及盐处理下均上调表达。亚细胞定位表明该基因定位于细胞膜上。利用酵母双杂交方法筛选出8个与StMAPKK4相互作用的蛋白,并通过回转试验验证了其互作的真实性。对互作蛋白进行Blast比对结果显示,StMAPKK4与多酚氧化酶、藻蓝蛋白、天冬氨酸转氨酶、渗透素、磷酸盐转运蛋白等多种蛋白互作,初步判断StMAPKK4可能参与光合作用响应机制、植...     

木薯MYB转录因子基因MeMYB60表达特征分析及其互作蛋白筛选

Myeloblastosis (MYB)类转录因子在植物对非生物胁迫的响应过程中起重要调控作用。本研究在分析栽培木薯MYB家族成员表达模式的基础上,筛选并克隆到了一个R2R3-MYB转录因子基因MeMYB60。基因表达特性分析表明,该基因在叶片特异表达,受干旱、低温负调控,同时对ABA处理也有响应。启动子活性分析发现,MeMYB60可以在保卫细胞表达,预示着该转录因子基因的表达可能与木薯气孔开闭调节有关。MeMYB60编码蛋白主要定位于细胞核中,具有转录激活活性,其转录激活结构域在蛋白C端第194～343氨基酸残基范围内。以MeMYB60蛋白N端第1～194氨基酸残基片段为诱饵,从干旱胁迫后木薯叶片的cDNA文库中筛选到18种可能与MeMYB60互作的蛋白,酵母双杂确定了MeCatlase1和MeCatalase2分别与MeMYB60存在互作关系。本研究为深入研究转录因子MeMYB60在木薯响应非生物胁迫过程中的功能并解析其调控网络奠定了基础。     

玉米ZmMAPKKK21基因的克隆和生物信息学分析

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）在植物应对生物和非生物胁迫过程中发挥着重要作用。在前期研究中我们挖掘到ZmMAPKKK21这一潜在的重要抗旱基因,本研究从玉米抗旱自交系J24中克隆获得ZmMAPKKK21基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明,玉米ZmMAPKKK21基因开放阅读框长1419 bp,编码472个氨基酸,是不具有信号肽的亲水性蛋白,且其启动子序列含有多个与逆境胁迫和激素有关的顺式作用元件;玉米中的MAPKKK21蛋白预测定位在细胞核上,蛋白互作预测结果显示,ZmMAPKKK21蛋白与参与植物逆境胁迫相关的MAPKK3蛋白和ZIM家族蛋白发生互作,其结构与高粱（Sorghum bicolor L.）和谷子（Setaria italica L.）等高抗旱禾本科作物相比,不但在STKc＿MAPKKK结构域上高度保守,且具有更加相似的二级结构和三级结构;qRT-PCR分析发现,ZmMAPKKK21基因在玉米根系中表达水平较高,干旱胁迫后该基因在根和叶中表达上调,进一步验证了ZmMAPKKK21基因的表达与干旱胁迫响...     

日本结缕草ZjERF2转录激活验证及互作蛋白的初步筛选

为了研究ZjERF2转录因子在日本结缕草(Zoysia japonica)生长发育和环境胁迫中的调控通路,筛选与ZjERF2转录调控过程中互作的蛋白。本研究采用酵母双杂的方法,通过构建"诱饵"载体p GBKT7-ZjERF2,并转化酵母感受态细胞,表明"诱饵"载体在酵母细胞中无毒且不能自激活。将p GBKT7-ZjERF2和日本结缕草全长cDNA文库共转化酵母感受态细胞,经SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal培养基筛选获得29个菌落,通过PCR扩增获得23个条带,进一步筛选到18个与ZjERF2互作的候选蛋白。对候选蛋白进行生物信息学分析,初步筛选到5个参与植物的生长发育、抗病原菌及环境胁迫调节的互作蛋白。本研究为探索Zj ERF2在植物生长发育和环境胁迫应答的调控机制提供帮助。     

普通烟草VQ家族基因的鉴定及表达

VQ家族是一类植物特有的家族,被报道参与生长发育、生物和非生物逆境胁迫响应等过程。本研究利用生物信息学和比较基因组学的方法,在烟草基因组中对VQ家族成员进行鉴定,并进行进化分析、共线性分析、复制分析以及表达模式等分析。本研究从烟草基因组中鉴定出57个VQ家族成员编码基因,其中33个普通烟草VQ基因被锚定到染色体上。系统发育分析发现,普通烟草和拟南芥的VQ家族成员被分成了9个亚家族。共线性分析表明,普通烟草NtVQ23与拟南芥中的AtVQ16形成共线性基因对。同时,对烟草基因组中的复制事件分析表明,全基因组重复事件在VQ家族成员的扩张中发挥着重要作用。此外,还对部分VQ家族成员的表达模式进行了分析,结果表明VQ基因的表达具有组织特异性,NtVQ9、NtVQ26等基因能够被青枯病接种和盐胁迫处理显著诱导。本研究对普通烟草VQ家族成员进行了鉴定与分析,为其后续研究VQ家族成员的功能提供了一定基础。     

拟南芥LBD15互作蛋白的筛选和鉴定

为了进一步挖掘拟南芥LBD逆境胁迫响应基因在植物非生物逆境胁迫应答中的作用,探究拟南芥逆境胁迫响应机理,将前期筛选到的LBD15基因构建到pGBKT7酵母表达载体上,筛选与LBD15互作的蛋白。利用酵母双杂交技术筛选了拟南芥全长均一化的酵母文库,在本次筛库试验中,146个样有107个测出序列,通过NCBI Blast分析,其中有96个获得了基因号,占总数的87.9%。根据基因号进行分类,得到了48个蛋白,在筛选到的48个蛋白中有59%的蛋白都是有重复的。然后把基因号通过网站TAIR(www.arabidopsis.org/index.jsp)查找其蛋白序列,通过亚细胞定位预测网站(http://cello.life.nctu.edu.tw/)分析其亚细胞定位,定位分析结果表明,这些蛋白主要定位于叶绿体、细胞质和细胞核。利用Blast2GO进行Gene Ontology注释显示互作蛋白共参与了14个生物过程,包括细胞过程、代谢过程、刺激响应、生物过程的调控、单组织和多组织过程及发育进程调控等。对得到的可能互作蛋白随机挑选了5个进行了互作蛋白的分离和回复验证,结果发现,AP19蛋白及其他一些蛋白的菌落能够在营养缺陷型的平板上正常生长,进一步证实了其为互作蛋白。酵母双杂交文库的成功筛选为进一步研究拟南芥LBD15的分子作用机制奠定了基础。