橡胶草基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化

为探索适合橡胶草基因组DNA的提取方法和RAPD反应体系。采用改良CTAB法提取橡胶草叶片总DNA,得到的DNA能满足RAPD分析需要。通过单因子实验法分析DNA浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Taq聚合酶以及Mg2+浓度对RAPD扩增结果的影响,建立了适合于橡胶草RAPD分子标记的最佳反应体系,即20 μL体系中包括：模板DNA30 ng、Taq DNA聚合酶1.75 U、dNTPs浓度0.25 mmol/L、Mg2+浓度2.0 mmol/L、引物浓度0.5 μmol/L、10×PCR Buffer 2.0 μL。RAPD扩增反应程序为：94℃预变性5 min,94℃ 30 s,37℃ 30 s,72℃ 70 s,45个循环,最后72℃延伸10 min。该反应体系具有较好的稳定性及可重复性。     

杨梅SRAP-PCR反应体系的建立与优化

为了建立适宜杨梅基因组DNA的SRAP-PCR扩增体系。以杨梅基因组DNA为模板,通过正交试验设计,从Mg2+、模板DNA、dNTPs、Tap DNA聚合酶和引物5种因素4个水平对杨梅SRAP-PCR反应体系进行优化。各因素对杨梅SRAP-PCR反应的影响程度从大到小依次为：Mg2+,模板DNA,dNTP,引物和Taq DNA聚合酶;建立的杨梅SRAP-PCR最佳反应体系为25μL反应体系中含2.5 mmol/L Mg2+、50 ng DNA模板、0.25 mmol/L dNTPs、0.15 μmol/L引物和1.5 U Taq DNA聚合酶。这一体系的建立为今后利用SRAP-PCR技术开展杨梅分子遗传学研究打下了基础。     

红叶石楠RAPD反应体系的优化

建立并研究适合红叶石楠的RAPD的最佳反应体系,为以后开展红叶石楠的遗传多样性研究、物种资源研究和亲缘关系鉴定等提供重要的参考。采用改进后的CTAB法,成功地提取了红叶石楠基因组DNA,通过单因素试验,研究了Mg2+、dNTP、引物的浓度和模板DNA,Taq酶的用量对RAPD反应的影响,建立适合于红叶石楠的RAPD反应体系。结果表明,在25 μL的RAPD反应体系中最佳反应条件分别是10×PCR Buffer 2.5 μL、Mg2+ (25 mmol/L) 2.0 μL、引物(20 μmol/L) 2.0 μL、dNTPs (2.5 mmol/L) 1.8 μL、DNA模板(49.5 μg/mL) 2.0 μL、Taq聚合酶0.3 μL (5 U/μL)。适宜的PCR循环程序为94℃预变性4 min,然后44个循环（94℃变性30 s,36℃退火30 s,72℃延伸2 min）后,72℃延伸10 min,最后16℃保存。改进的CTAB法能成功地提取红叶石楠基因组DNA,利用单因素试验设计所建立的RAPD反应体系,通过重复试验证明了该体系稳定可靠,可应用于红叶石楠遗传多样性、亲缘关系等方面的研究中,为红叶石楠在分子生物学研究奠定了基础。     

龙眼SRAP反应体系的建立和优化

采用分步优化的方法对影响龙眼SRAP-PCR反应的模板DNA用量、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、TagDNA聚合酶用量等进行了研究。确立了适合龙眼SRAP分析的反应体系,即体系总体积25μl,包含1×PCR Buffer ,Mg2+ 2.0mmol/L,dNTPs 0.5 mmol/L,引物0.3μmol/L,模板DNA 10ng, TaqDNA聚合酶1.5 U。结果表明,该体系能很好地满足龙眼基因组SRAP扩增的要求,SRAP标记应用于龙眼遗传研究是可行的。     

长柄石杉ISSR-PCR反应体系的建立与正交优化

长柄石杉ISSR反应体系的建立能为利用ISSR标记技术进行长柄石杉品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定良好基础。利用正交试验设计的方法,从dNTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度和Mg2+浓度4种因素,对长柄石杉ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度进行梯度检测。结果表明,20 μL ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度为1×PCR buffer、300 μmol/L dNTP、0.2 μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg2+、1.75 U Taq DNA聚合酶、40 ng模板DNA。该优化体系的建立为下一步进行长柄石杉ISSR分子标记奠定了基础。     

黄皮ISSR－PCR反应体系的优化

摘 要：采用单因素和正交试验对ISSR-PCR扩增黄皮基因组DNA的主要影响因子进行筛选和分析,建立了适宜于黄皮ISSR分析的扩增体系：20 μL的反应体系中含30 ng的模板DNA、1.5 U TaqDNA聚合酶、0.4 μmol/L引物、0.3mmol/L dNTPs以及引物(gA)8C的最佳退火温度为52.4℃。     

甜瓜ISSR-PCR反应体系的正交优化研究

为在最短时间内找到甜瓜ISSR-PCR反应四个主要因素的最优水平,确定甜瓜ISSR-PCR最优反应体系进行本研究。采用CTAB法提取甜瓜基因组DNA,获得完整性好且纯度较高的DNA样品。利用统计软件MINTAB创建4因素3水平的正交试验设计,PCR结果用MINITAB进行方差分析。结果显示引物浓度对PCR反应结果影响最大,Taq DNA聚合酶对PCR结果影响最小,并对各因素水平间进行因素内多重比较分析,最终建立最优化的反应体系（20 μL）：1×buffer,100 ng DNA模板,Taq DNA聚合酶1 U,引物0.4 mmol/L,dNTP为0.1 mmol/L。     

冬虫夏草RAPD反应体系的建立及优化

为建立并优化冬虫夏草RAPD反应体系,通过改变RAPD反应体系中Mg2+、dNTP、引物、模板等主要成分的浓度,结合RAPD扩增效果,建立冬虫夏草RAPD反应体系,然后通过改变主要热循环参数,优化冬虫夏草RAPD反应体系。结果表明：适合冬虫夏草的RAPD反应体系为25 μL体系中内含1×PCR缓冲液、1.5 μmol/μL Mg2+、320 μmol/L dNTP、24 ng引物、20 ng模板、1 U Taq酶;扩增程序的优化结果为：95℃预变性5 min,然后35个循环（94℃变性45 s,36℃复性1 min,72℃延伸2 min）,循环结束后72℃延伸7 min。综上,RAPD技术可用于冬虫夏草的鉴定、评价分析。     

谷蠹RAPD反应体系与程序的优化

以谷蠹为研究对象,采用L16（45）正交组合实验和单因素梯度实验对MgCl2、dNTP、随机引物、Taq酶、模板DNA浓度和退火温度、循环次数等影响RAPD扩增的重要因素进行优化,以期建立最优的RAPD反应体系与程序。实验结果表明：各因素最适条件为：25μL PCR反应体系中,10×Buffer 2.5μL,MgCl22.5 mmol/L,dNTP0.4 mmol/L,随机引物960 pmol/L,Taq酶0.5 U,模板DNA 20ng;退火温度为37℃,循环次数为45次。在对谷蠹进行RAPD分析时,采用优化的反应条件,规范实验操作,使用同厂家同批次的试剂,实验结果就会具有很好的重复性和稳定性。     

新疆贝母DNA提取及ISSR-PCR体系的建立与优化

目的:从新疆贝母干叶片中提取高质量的DNA,建立ISSR-PCR体系并进行优化。方法:通过改进的CTAB法提取基因组DNA;综合利用单因素实验和L9(34)正交实验2种方法,对镁离子、dNTP、模板DNA含量、TaqDNA聚合酶量、引物浓度等因素进行优化,并采用温度梯度筛选引物的退火温度。结果:新疆贝母20μL ISSR-PCR最适反应体系dNTP为0.3 mmol/L,Mg2+为2.0 mmol/L,模板浓度为40～100 ng/(20μL),引物为1.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶为1.0 U/20μL,引物UBC 859的最适退火温度为50.7℃。结论:此提取方法得到的DNA纯度高,ISSR-PCR扩增效果显著,为新疆贝母种质资源鉴定、遗传多样性分析奠定研究基础。     

莲雾SRAP反应体系的优化及其应用

以莲雾DNA为模板,应用正交设计法对SRAP反应体系中的各个主要影响因素进行了优化筛选。结果表明,20 μL反应体系中各组分的最适浓度或用量分别为：1×Buffer,3.0 mmol/L Mg2+,0.3 mmol/L dNTPs,0.4 μmol/L引物,0.5 U Taq DNA聚合酶和40 ng模板DNA。利用该优化体系通过64对SRAP引物组合对7份连雾进行了SRAP-PCR扩增,证实了该体系具有稳定可靠、重复性好、多态性较强等特点。     

西番莲科龙珠果ISSR-PCR体系的建立和优化

为了获得适于龙珠果ISSR-PCR的反应体系,本研究以龙珠果叶片为试验材料,提取基因组DNA,采用L16(45)正交设计试验,对影响龙珠果ISSR-PCR扩增结果的Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度和模板DNA量进行优化,并筛选了最适退火温度。试验结果分析表明,各因素影响显著性为dNTPs浓度>Taq DNA聚合酶用量>Mg²⁺浓度>模板DNA量>引物浓度。在20μL反应体系中,dNTPs浓度0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、Mg²⁺浓度2.0 mmol/L、模板DNA 25 ng、引物浓度0.4μmol/L为最佳用量。实验从100条UBC引物中筛选得到22条多态性较好的引物。本研究为龙珠果ISSR标记开发、种质资源鉴定、遗传多样性分析和分子标记辅助选择育种等提供科学依据。     

砂梨的ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以砂梨基因组为材料,通过单因素试脸,对ISSR-PCR反应体系中各种影响因子如dNTPs浓度,DNA模板含量,Taq DNA聚合酶量,引物用量以及最适退火温度等进行了优化和筛选,建立了适合砂梨的ISSR-PCR反应体系和应用程序为为: 20 μl PCR体系中,1 x Taq 酶配套缓冲液,0.5 U Taq DNA 聚合酶,0.7μmol / L引物,100μmol / L dNTPs,2.25 mmol/LMgCl2,40ng模板DNA。最佳扩增程序为：预变性：94°C 5min; 94°C变性45sec,52°C退火45sec,72°C延伸1min;共40个循环后,最后72°C延伸10min,4°C保存。用引物836可以将这16份砂梨材料区分开。砂梨ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行砂梨品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析莫定了良好基础。     

芹菜RAPD反应体系的优化研究

本试验以一般RAPD反应程序为基础,采用单因素递进筛选方法,针对Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、随机引物和DNA模板5个主要影响因素,分别设置5个不同浓度梯度,对芹菜进行RAPD-PCR扩增,建立了芹菜RAPD技术最优体系。结果表明：25 μL反应体系中含Taq DNA聚合酶1.0 U、Mg2+ 3.0 mM、dNTPs 0.2 mM、引物28 ng、模板DNA 70 ng,10×PCR Buffer 2.5 μL;扩增程序为：94℃预变性5 min,94℃变性1 min,36℃退火1 min,72℃延伸1 min,进行42个循环,最后72℃延伸10 min。     

苹果SSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立苹果属植物SSR-PCR反应优化体系,采用L₁₆(4⁵)正交实验和退火温度梯度实验,分析反应体系中使用的模板、引物、Mg²⁺、dNTPs以及Top Taq酶浓度对扩增产物的影响,并对这5个因素进行4个水平不同浓度梯度的筛选和优化。结果表明,引物浓度对SSR-PCR反应体系的影响最大,通过综合分析最终确定SSR-PCR的25 μL最佳反应体系为：30~60 ng DNA模板,1.2 μL正反向引物(5 μmol/L),0.5 μL dNTPs(2.5 mmol/L),0.5 μL Top Taq酶(2.5 U/μL)以及2.5 μL 10× Top Taq buffer（含Mg²⁺）。利用优化后的反应体系对蔷薇科苹果属的21种植物材料进行检测,实验结果表明扩增产物均在100~200 bp左右,可扩增出2~3个有效等位基因。通过优化反应体系中的各影响因素,建立了最佳的SSR-PCR反应体系,可为苹果属植物不同种群的遗传变异研究及亲缘关系的分子鉴定提供前期研究基础。     

正交设计优化青蒿SRAP-PCR反应体系及引物筛选

为了建立青蒿的SRAP最佳扩增体系,并筛选出SRAP多态性引物,本研究以青蒿叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以Mg^2+、dNTP Mix、Taq DNA聚合酶、引物和DNA模板5种因素5个水平,对青蒿SRAP反应体系进行研究。结果表明,青蒿SRAP-PCR最佳反应体系为:引物0.6μmol/L、Mg^2+2.0 mmol/L、模板DNA 5.1 ng、Taq DNA聚合酶2.0 U、dNTPs 0.25 mmol/L,总体积为25μL。各因素对扩增反应均有不同影响,其中引物浓度的影响最大,dNTPs的影响最小。运用该体系对不同种质资源的青蒿进行验证,证明该体系稳定可靠,并在30个引物组合中筛选出了25对扩增条带清晰,多态性丰富的引物组合。这一结论为今后利用SRAP标记技术进行青蒿分子遗传学研究提供了科学依据。     

油葵SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为了获得适合油葵的SSR-PCR反应体系,通过采用控制变量法对影响SSR反应体系的主要因素进行优化,研究Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度等因素。结果表明各因素的终浓度分别在Mg²⁺浓度2.5 mmol/L、dNTPs浓度0.2 mmol/L、Taq酶量0.5 U、引物浓度0.4 μmol/L及退火温度为53.9℃时最为适合。通过试验优化后的体系筛选引物,最终从50对引物筛得19对多态性好的引物可进行下一步的研究。     

花椰菜的ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以花椰菜基因组为材料,通过单因素试验,对ISSR-PCR反应体系中各种影响因子如dNTPs浓度,DNA模板含量,Taq DNA聚合酶量,引物用量以及最适退火温度等进行了优化和筛选,建立了适合花椰菜的ISSR-PCR反应体系:25μL反应体积:内含10×PCR反应缓冲液(含Mg~(2+))2.5μL、0.5U TaqDNA聚合酶、0.2mmol/L dNTPs、0.5μmol/L引物、60ng模板DNA。确定了适宜的退火温度为48.6℃。扩增程序为94℃预变性5 min;然后94℃变性30s,46.9℃退火45 s,65℃延伸1.5min,35个循环;最后65℃延伸7min,4℃保存。用120条引物对花椰菜基因组进行标记,筛选出引物TI-13可以将这6份花椰菜材料区分开。花椰菜ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行花椰菜品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定了良好基础。     

番石榴SRAP反应体系的建立与正交优化

采用正交设计方法,对影响番石榴SRAP反应体系的Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶和模板DNA浓度等进行了优化,建立了适用于番石榴的SRAP反应体系。该优化的20 μL反应体系中包含2.5 mmol/L Mg2+,0.15 mmol/L dNTPs,0.4 μmol/L引物,1.5 U Taq DNA聚合酶和20 ng模板DNA。利用该优化体系通过64对SRAP引物组合对5份番石榴材料进行了SRAP-PCR扩增,结果表明SRAP引物及优化后的反应体系能够有效地用于番石榴种质资源鉴定及遗传多样性分析等研究。