小麦Mlo反义基因的转化及转基因植株的白粉病抗性分析

采用基因枪法将小麦反义Mlo基因导入扬麦158和济麦20的幼胚愈伤组织中,在含除草剂的分化培养基上经两轮筛选,获得抗性再生植株。PCR检测、PCR-Southern杂交、基因组DNA斑点杂交和除草剂BASTA抗性分析结果证实已获得转基因扬麦158和济麦20阳性植株,荧光定量表达分析亦证明Mlo基因发生沉默。对T₀和T₁代转基因植株的白粉病抗性鉴定表明,有6个转基因株系高抗白粉病。对T₁代转基因小麦接种白粉菌后孢子发育的显微观察结果显示,Mlo反义基因的导入明显加快了乳突的形成和维持时间,有效抑制了吸器的发育,因而使转Mlo反义基因材料表现抗病性。     

用核基质结合区(SAR)序列提高小麦最小表达框转基因表达的稳定性

采用最小表达框技术转化植物可以规避由骨架序列引起的安全风险。核基质结合区序列SAR (scaffold attachment region)可作为边界元件与核基质结合阻挡转基因片段邻近染色质区的作用与影响, 提高外源基因稳定性。本研究在最小表达框序列两端添加SAR序列, 提高小麦最小表达框转基因表达的稳定性, 提高转化基因的表达效率。首先, 以GUS为目的基因构建带有SAR序列的最小表达框, 以科农199为受体进行基因枪转化, 同时以不加SAR序列的最小表达框片段为对照。带有SAR序列的最小表达框片段共轰击857个幼胚, T₀代获得40株再生植株, PCR检测到16株阳性植株, 转化效率为1.87%; 对这16个阳性单株进行GUS染色, 15株显色; 从来自4个T₀阳性植株的18个T₁代植株中随机选取18株进行PCR和GUS染色检测, 有15株表现为阳性。不带SAR序列的对照片段轰击1012个幼胚, 获得31株再生植株, 其中5株PCR阳性, 转化效率0.49%, 这5个阳性植株中仅2株为GUS染色阳性; 来自于5个T₀代PCR阳性株系的10个T₁代单株中没有发现PCR和GUS染色阳性株。表明SAR序列可以提高基因枪转基因效率和目的基因表达稳定性。为了创制抗旱转基因小麦, 以来自大豆的抗旱相关转录因子基因GmDREB3为目的基因, Bar基因为筛选标记基因, 转化受体小麦济麦22, 共轰击6045个幼胚, 获得再生植株130株, PCR检测阳性植株30株, 转化效率为0.50%; 随机选取6株PCR阳性植株进行RT-PCR分析, 其中5株可检测到外源基因的转录。进一步对这5株RT-PCR阳性植株插入片段完整性进行分析, 其中4株插入片段基本完整。通过real-time PCR分析, 发现T₀代6个RT-PCR阳性植株的外源GmDREB3的拷贝数为1~3个。以上结果证明, 在最小表达框两端加上SAR序列后可以提高小麦最小表达框转基因表达的稳定性。     

基于CRISPR/Cas9技术的水稻温敏不育基因tms5突变体的构建

为创新优良温敏不育系, 促进两系杂交稻育种的发展, 我们以水稻温敏不育基因TMS5为编辑对象, 设计了由水稻U3启动子驱动、长20 bp的guide RNA (gRNA)靶点以靶向编辑 TMS5 基因的第1个外显子, 将靶点与表达载体pCAMBIA1301连接, 再用农杆菌介导法获得水稻转基因株系。提取T₀代转基因株系的基因组DNA, 并对TMS5编辑位点附近的DNA片段进行PCR检测及测序分析。结果表明, T₀代植株的突变率为63.89%, 其中纯合缺失突变率为34.78%。对T₁代纯合缺失突变体的不育起点温度和农艺性状调查分析结果表明, 28℃是tms5突变体花粉育性的转换温度。大田试验结果表明, 与野生型相比, tms5突变体的结实率和单株重均显著降低。粳稻tms5突变体的获得为培育粳稻不育系奠定了材料基础。     

结球甘蓝BoLH01和BoLH02基因的克隆与表达

bHLH类转录因子在植物叶片形态建成和发育过程中发挥重要的生理功能。本文通过结球甘蓝转录组数据分析,筛选出莲座期和结球期的茎尖间与叶片间均显著差异表达的2个bHLH类转录因子,命名为BoLH01和BoLH02基因,获得了2个基因的编码序列,其中BoLH01基因CDS全长为966 bp、编码321个氨基酸;BoLH02基因CDS全长870 bp、编码289个氨基酸;序列分析表明BoLH01和BoLH02分别与拟南芥AtbHLH18和AtbHLH19氨基酸同源相似性最高,达81%和74%,均具典型bHLH结构域特点和完全保守的13E-16R和9H-13E-17R以及Leu23对应的关键氨基酸位点;分子进化上BoLH01、BoLH02与AtTCP2/3/4/10/24亲缘关系较近,与AtTCP9/11/14/15较远;转录组和荧光定量PCR分析表明BoLH01和BoLH02在平展的莲座叶中表达量较低,在卷曲的球叶中高量表达;序列分析BoHB7、BoHB12和BoILL6的ATG上游均包含能被bHLH功能域识别的E-box序列,对BoHB7、BoHB12和BoILL6荧光定量PCR分析表明, 三者与BoLH01和BoLH02在不同时期叶片中表达量的变化趋势完全一致;说明BoLH01和BoLH02可能通过正向调控BoHB7、BoHB12、BoILL6基因的表达来参与甘蓝叶片卷曲的调控。     

农杆菌介导的RNAi CP基因在大豆中的转化

花叶病毒(soybean mosaic virus, SMV)病是大豆主要病害之一,生产上常采用种植抗性品种方法来防治。本研究以RNA干扰花叶病毒衣壳蛋白(coat protein, CP)基因为表达载体,Bar基因作为筛选标记基因,成熟子叶节为外植体,采用农杆菌介导法获得了22株T₀代转基因大豆生根苗,经草丁膦涂抹、Bar试纸条和PCR法鉴定,获得RNAi CP转基因植株18株;对转基因植株T₁代的遗传分析表明,外源基因能够稳定遗传到下一代且符合孟德尔遗传规律;T₁代Southern杂交表明,导入的干扰片段为单拷贝;花叶病毒摩擦接种表明RNAi CP转基因大豆植株具有抗花叶病毒特性;摩擦接种后3周,DAS-ELISA检测进一步表明,RNAi CP转基因植株花叶病毒检出率仅为7.69%,而非转基因植株为100%。这表明RNAi花叶病毒CP基因可用于抗大豆花叶病毒的研究。     

甘蓝锌指蛋白转录因子BoC2H2的克隆、定位与表达分析

C2H2型锌指蛋白是植物中最重要的转录调节子之一, 主要调控植物的生长发育和胁迫应答反应。本研究通过分析自交不亲和甘蓝未授粉, 自花授粉15、30和60 min, 异花授粉15、30和60 min柱头转录组数据, 筛选到一个自花授粉诱导上调表达的C2H2型锌指蛋白基因, 命名为BoC2H2。BoC2H2开放阅读框756 bp, 编码251个氨基酸残基, 蛋白分子量为26.7 kDa, 等电点为4.62, 是一种亲水性蛋白, 不含信号肽和跨膜域, 含有C2H2型锌指蛋白家族高度保守的ZnF_C2H2结构域。BoC2H2起始密码子上游2000 bp的核苷酸序列中含有光响应、昼夜节律、茉莉酸响应、防御和应激反应等多种顺式作用元件。通过原生质体亚细胞定位和瞬时浸染烟草, 发现BoC2H2蛋白在细胞核和细胞质中表达。BoC2H2在下胚轴、叶片和花中均有表达, 柱头中的表达量随发育时间而变化, 开花当天后表达量降低。荧光定量PCR结果显示, BoC2H2在自花授粉和异花授粉0~60 min的表达量变化趋势与转录组分析结果基本一致。综上所述, 甘蓝BoC2H2属于C2H2型锌指蛋白家族, 可能参与了柱头响应花粉刺激的分子过程, 这有利于揭示BoC2H2在甘蓝自交不亲和过程中的作用机制, 为研究C2H2型转录因子在甘蓝自交不亲和过程中的调控机制提供依据。     

以抗除草剂Bar基因稳定转化谷子技术研究

农杆菌介导的谷子遗传转化效率一直是制约谷子功能基因研究及转基因育种效率的主要因素。本研究以冀谷11谷子幼穗为外植体, 选取0.5~1.0 cm的幼穗, 切成0.5 cm左右的小段, 置改良后的MS培养基上诱导15~20 d形成胚性愈伤组织3120块。愈伤组织侵染转化前用侵染液悬浮浸泡, 并经45°C热激预处理3 min, 可以有效提高26.1%的瞬时遗传转化效率。将转化后的愈伤组织经草丁膦(PPT)筛选后获得513块抗性愈伤组织, 抗性愈伤组织获得率为16.4%。抗性愈伤组织经分化、壮苗培养后获得7株抗性植株, 经PCR和Southern杂交检测得到6株T₀代转基因阳性株, 对T₃代转化植株叶片进行PPT抗性分析, 并结合Bar蛋白抗体试纸条鉴定, 表明Bar基因已稳定整合到谷子基因组中。本研究建立了农杆菌介导转化谷子优良品种的遗传转化体系, 对提高谷子转基因育种效率和谷子模式研究系统的建立有重要意义。     

脯氨酸羟化酶GhP4H2在棉花纤维发育中的功能研究

阿拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactan proteins,AGP)在棉花纤维发育过程中发挥重要作用。AGP由富含羟脯氨酸的主链蛋白和大量Ⅱ型阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan,AG)侧链组成,其合成过程要经历2次翻译后修饰,首先是氨基酸主链上的脯氨酸被脯氨酸羟化酶(prolyl-4-hydroxylases,P4H)羟基化,随后在糖基转移酶(glycosyltransferases,GT)催化作用下将阿拉伯半乳聚糖或寡糖添加到羟脯氨酸残基上。我们前期利用P4Hs的抑制剂处理棉花离体胚发现,棉纤维伸长受到抑制,暗示P4H参与棉纤维生长发育过程。为深入研究P4H在棉纤维发育中的功能,我们从棉花中分离鉴定了1个在棉纤维发育过程中高量表达的脯氨酸羟化酶基因GhP4H2。本研究分别构建了GhP4H2过表达和RNA interference(RNAi)载体,通过农杆菌介导法转化棉花,获得转基因植株,发现过表达转基因棉花株系T₁~T₃代成熟棉纤维变短,AGP含量增加,AG多糖侧链也发生变化。对过表达转基因植株和野生型植株棉纤维的转录组分析表明,GhP4H2正调控包括AGP在内的细胞壁糖蛋白基因的表达。基于以上研究,我们推测GhP4H2可能主要通过影响AGP糖链组分调控棉纤维生长发育。     

抗全蚀病、根腐病的转PgPGIP1基因小麦的获得与鉴定

全蚀病和根腐病是小麦(Triticum aestivum)重要的土传真菌病害。PgPGIP1是人参(Panax ginseng)的一种多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白,可以抑制部分病原真菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶的活性。本研究人工合成了PgPGIP1基因,并构建PgPGIP1基因的单子叶植物表达载体pA25-PgPGIP1,通过基因枪介导法将其转入小麦品种扬麦18中。对转PgPGIP1基因的T₀至T₄代植株进行PCR、RT-PCR和Q-RT-PCR分析,并对其全蚀病和根腐病抗性进行鉴定。结果表明,PgPGIP1基因能够在4个转基因小麦株系中遗传、转录与表达。与未转基因的小麦扬麦18相比,4个转基因小麦株系对全蚀病与根腐病的抗性明显提高,说明PgPGIP1表达增强了转基因小麦对全蚀病与根腐病的抗性。     

BnA7HSP70分子伴侣结合蛋白超表达能够提高甘蓝型油菜耐旱性

分子伴侣结合蛋白广泛参与植物生长发育过程, 在逆境下能够保护植物细胞免受胁迫。在甘蓝型油菜中超表达油菜含有HSP70热激蛋白结构域的分子伴侣基因BnA7HSP70, 所得到的转基因植株在缺水条件下延缓萎蔫。通过生理生化实验证明, 干旱条件下转基因植株有着更高的相对含水量、更强的渗透调节能力和较低的脂质膜过氧化性。另外, 转基因植株的幼苗在萌发期表现出对糖基化酶抑制剂衣霉素处理的耐受性。Evans blue染色实验证明, 转基因植株逆境下叶片死亡细胞数目比非转基因植株减少, 叶片衰老相关标记基因BnCNX1在转基因植株中下调表达证明, 超表达BnA7HSP70基因所介导的途径能够减轻逆境胁迫下的植株衰老, 保持叶片持绿性。在转基因植株中内质网和渗透胁迫产生的细胞死亡标记基因N-Rich蛋白BnNRP延迟表达证明, 在油菜中增强BnA7HSP70基因的表达能够缓解未折叠蛋白途径(unfold protein response, UPR)和NRP (N-rich pathway)途径介导的叶片黄萎, 并降低油菜叶片失绿的标记基因BnLSC222和BnLSC54的表达。研究结果表明, 在油菜中超表达BnA7HSP70基因能够提高植株在干旱条件下内质网胁迫的耐受性。     

白菜单株产量与主要农艺性状关系的分析

为揭示主要农艺性状对白菜单株产量的影响,以16份白菜新品系为试材,对其单株产量与8个农艺性状进行相关分析、偏相关分析、多元逐步回归分析和通径分析。结果表明,各性状中变异系数最大的为最大叶叶柄长,其次为单株产量;最大叶叶宽与单株产量达到极显著正相关,株幅与单株产量达到显著正相关;偏相关分析中单株产量与8个农艺性状均呈正相关,其中叶片数和最大叶叶宽与单株产量呈极显著正相关,其余偏相关系数较大的依次为最大叶叶柄厚和株幅;多元逐步回归分析表明Y（单株产量）=-1480.847+31.562X₅（最大叶叶宽）+26.028X₃（叶片数）+13.425X₂（株幅）+429.535X₈（最大叶叶柄厚）为单株产量性状的最优回归方程式,决定系数R²=0.930;8个农艺性状对单株产量性状的直接通径系数均为正值,排名前4的性状依次为最大叶叶宽>叶片数>最大叶叶柄厚>株幅。因此,在白菜丰产新品种选育中,应重点做好最大叶叶宽和叶片数性状的选择,同时兼顾最大叶叶柄厚和株幅等性状。     

大豆GmHDL57基因的克隆及抗盐功能鉴定

HD-Zip I类转录因子在植物抵御非生物胁迫过程中发挥重要功能, 本研究克隆得到1个大豆HD-Zip I类基因GmHDL57 (Glycine max homeodomain-leucine zipper protein 57)。序列分析表明, GmHDL57基因包含1个1038 bp的开放读码框, 编码345个氨基酸, 具有HD-Zip类家族蛋白典型的保守结构域。基因时空表达分析表明, 大豆GmHDL57基因在大豆植株的各个不同时期及不同器官中均有表达, 在花中表达量最高。采用实时荧光定量PCR技术分析了4种非生物胁迫(脱落酸、NaCl、PEG、冷)对幼苗期大豆根中GmHDL57基因表达的影响。结果表明, 该基因表达量受高盐胁迫诱导显著升高, 在脱落酸及干旱胁迫下上升幅度较小, 但在冷胁迫下呈下降趋势。盐胁迫前后GmHDL57基因在根中的表达量明显高于茎和叶, 在盐胁迫48 h时达到峰值, 72 h和96 h时表达量缓慢下降。此外, 构建GmHDL57基因的植物超表达载体, 利用根癌农杆菌转化法获得转基因百脉根, 200 mmol L ^-1 NaCl处理条件下, 转基因百脉根的株高、根长、叶绿素含量、根系活力以及阳离子K ⁺、Ca ²⁺含量显著高于野生型, 而丙二醛含量、相对质膜透性以及Na ⁺的含量明显低于野生型。以上研究结果表明, GmHDL57基因参与了大豆对非生物胁迫的应答过程, 过量表达GmHDL57基因能够显著提高百脉根的抗盐能力。     

amiRNA技术沉默C-3氧化酶编码基因StCPD对马铃薯抗旱性的影响

CPD (constitutive photomorphogenesis and dwarf)基因编码C-3氧化酶, 为油菜素内酯(brassinosteroid, BR)生物合成途径中的限速酶, 在植物响应逆境胁迫过程中具重要调控作用。本研究利用人工microRNA (artificial microRNA, amiRNA)技术, 构建马铃薯CPD基因(StCPD)的干扰表达载体pCPB121-amiRcpd, 通过根癌农杆菌介导法将其转入马铃薯栽培品种“紫花白”, 获得转基因植株(Ci1~Ci5), 其中Ci1和Ci3的StCPD基因干扰程度分别为78%和90%。基因组织表达特异性分析表明, StCPD在马铃薯试管苗叶片中表达量最高, 是茎和根中表达量的3.05倍和1.65倍。转基因植株株高、茎粗、根长、鲜重及薯的大小和鲜重等指标均较非转基因(NT)植株显著下降, 表明StCPD基因干扰表达后, 植株的长势明显受到抑制。模拟干旱胁迫处理下, 转基因植株叶片中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量显著高于NT植株, 而脯氨酸含量显著低于NT植株。转基因和NT马铃薯中, StCPD基因的表达量、MDA和脯氨酸含量均显著高于对照; 且随着胁迫处理时间延长, 基因表达量呈持续增强趋势, MDA和脯氨酸含量随之增加。结果表明, StCPD基因干扰表达能明显降低马铃薯对干旱胁迫的抵抗能力, 为进一步研究BR对马铃薯生长发育和对干旱胁迫的响应奠定了基础。     

玉米阳离子/质子逆向转运蛋白ZmNHX7的功能鉴定

植物阳离子/质子逆向转运蛋白可以维持细胞内的离子平衡,在抵御离子毒害过程中发挥重要作用。本研究克隆了一个编码玉米阳离子/质子逆向转运蛋白的基因,命名为ZmNHX7。该基因编码序列(codingsequence,CDS)全长3411 bp,编码一条含1136个氨基酸的多肽链。ZmNHX7基因在玉米各组织部位均有表达,在V7 (第7片叶完全展开)时期的根和茎中表达量较高。在NaCl与LiCl的胁迫条件下,该基因表达量上调。系统进化树分析将ZmNHX7与拟南芥质膜阳离子/质子逆向转运蛋白AtNHX7和AtNHX8归为一类,亚细胞定位结果表明该蛋白定位于细胞膜和核膜上。将ZmNHX7基因转入拟南芥T-DNA插入突变体中,转基因互补株系可以恢复该突变体对Li+的耐受性。这些结果表明, ZmNHX7编码一个玉米质膜阳离子/质子逆向转运蛋白,在缓解Li+对植物的毒害和维持细胞内的离子平衡等方面发挥重要作用。     

白菜的内多倍化现象

研究和了解植物内多倍化现象的发生规律和特点对于有效调控器官分化过程, 加速有用器官形成具有重要意义。本文分别以白菜及其近缘属种为材料, 运用流式DNA分析技术, 系统检测了不同发育阶段、不同组织器官以及不同种属植物叶片的内多倍化水平。结果表明, 白菜的内多倍化特点同样具有组织、发育阶段和种属特异性。一些木质化程度较高的输导组织如幼根、胚轴、茎和叶柄比其他非输导组织的叶片、子叶、苞叶具有更高的内多倍化程度; 在给定的组织器官中内多倍化水平随该器官的发育进程而提高, 当器官成熟时, 内多倍化水平也趋于稳定; 显微观察结果表明, 不同倍性的细胞核大小差异悬殊, 呈无规律状态散布于白菜表皮组织相邻的细胞内; 最高倍性水平的细胞核, 在白菜叶片中为64C, 而在甘蓝、芥菜和拟南芥中分别为32C、16C、16C, 在同科的不同植物中显示了不同的内多倍化水平。     

茶树己糖激酶基因CsHXK2的启动子克隆及表达特性分析

植物己糖激酶是双功能蛋白,具有磷酸化己糖和介导糖信号的关键性作用。前期研究中,我们从茶树中克隆获得4个己糖激酶基因,其中CsHXK2基因编码492个氨基酸残基,与拟南芥AtHXK3、番茄LeHXK4归为Type A类HXKs。利用RT-PCR技术,克隆获得长度为2029bp的CsHXK2基因启动子。CsHXK2基因可能受到光照、低温、病原菌、糖和多种激素等信号的调控,且可能特异性表达于叶、花、种子、根系、腋芽等组织。CsHXK2蛋白定位于叶绿体内。酵母突变体功能互补试验表明,去除叶绿体转运信号肽的CsHXK2成熟蛋白具有葡萄糖和果糖磷酸化活性。茶树组织特异性表达分析显示,CsHXK2基因在根和茎中表达量最高,而在老叶中表达量最低。CsHXK2基因的表达受低温胁迫而显著下调,经炭疽菌侵染的茶树叶片内CsHXK2基因的表达也受到显著抑制,而外源赤霉素(GA_3)处理的茶树叶片内CsHXK2基因表达显著上调。本研究结果表明,CsHXK2基因在茶树的生长发育过程和逆境胁迫响应中发挥重要的调控作用。     

不结球白菜单株产量与主要农艺性状的灰色关联度分析

为揭示不结球白菜单株产量与主要农艺性状间的关系，利用灰色关联度分析法，对18个不结球白菜品系的单株产量和8个主要农艺性状间的关联度进行分析。结果表明，不结球白菜各农艺性状与单株产量性状间的关联度排序为株幅＞最大叶叶宽＞最大叶叶柄宽＞最大叶叶柄厚＞叶片数＞最大叶叶长＞株高＞最大叶叶柄长。株幅、最大叶叶宽、最大叶叶柄宽对不结球白菜单株产量影响最大。在不结球白菜育种过程中，注重株幅、最大叶叶宽、最大叶叶柄宽性状的选择，同时兼顾其他性状的选择，可以获得单株产量较高的不结球白菜新品种。