茶树叶片和胚根原生质体的分离及PEG诱导融合

植物原生质体是细胞培养和体细胞融合等细胞水平研究及植物遗传育种的重要材料。本研究用福鼎大白茶茶树的幼嫩叶片及胚根, 分析了原生质体分离过程中的材料、酶解液组成及酶解时间、纯化方法等影响因子, 建立了最佳原生质体分离体系, 为茶树体细胞杂交等细胞水平的研究提供了高效获取大量高活力原生质体的方法。结果表明, 23°C恒温黑暗或遮光培养的茶树实生苗的5周叶龄以内的幼嫩叶片是茶树原生质体分离的最佳材料, 其次是茶树种子萌发后的幼嫩胚根; 而以茶园健康生长的5周叶龄以内的幼嫩叶片为材料时, 只能获得混有大量细胞碎片的少量具有活力的原生质体。以茶树幼嫩叶片为分离材料的酶解液组成为1.5%纤维素酶+0.1%离析酶+0.5%果胶酶+0.4 mol L^-1甘露醇+20 mmol L^-1 MES; 以茶树幼嫩胚根为分离材料的酶解液组成为1.5%纤维素酶+0.3%离析酶+0.5%果胶酶+0.4 mol L^-1甘露醇+20 mmol L^-1 MES。分离茶树幼嫩叶和幼嫩胚根原生质体时, 宜采用低速(分别为55 r min^-1和50 r min^-1)恒温(23°C)摇床振荡酶解培养, 时间分别为7 h和8 h; 最适宜采用15×g的转速, 离心4 min可纯化获得高产量和活力的原生质体。用40% PEG-6000诱导20 min后可使茶树原生质体融合, 融合率达10%。     

酸枣幼根原生质体的制备

以生长6~9 d的酸枣种子幼根为试验材料,0.7 mol·L^-1甘露醇作为渗透压稳定剂、pH值5.5~6.0、28℃恒温水浴条件下,以光学显微镜观察的水解总时间、初始产生原生质体的时间、原生质体产量及细胞碎片量为指标,研究通过酶水解来制备酸枣幼根原生质体的方法。结果表明,在含1%果胶酶+4%纤维素酶R-10+3%纤维素酶RS组合的酶解液中,保温4 h可制得产量较高、细胞碎片量较少的原生质体。     

穿心莲叶片原生质体制备方法的建立与优化

为优化穿心莲叶片原生质体制备方法,本研究运用酶解法考察不同酶组合、渗透压、MES浓度、液料比、植物生长情况等因素对穿心莲原生质体制备的影响。结果表明,穿心莲叶片原生质体制备的适宜材料为长约3 cm的新鲜穿心莲叶片;酶解液组成为1.5%纤维素酶R-10+0.75%离析酶R-10+0.6 mol/L D-甘露醇为渗透压调节剂+20mmol/LMES+5mmol/LCaCl_2+0.1%BSA作为质膜稳定剂,液料比为50∶1。本研究获得的穿心莲叶片原生质体制备优化方法,可为后续原生质体培养提供参考依据和为穿心莲种质创新提供新途径。     

山丹丹原生质体的分离条件探究

[目的]本研究旨在建立山丹丹高效原生质体分离体系,为山丹丹种质资源的有效利用提供科学依据。[方法]以山丹丹鳞茎胚性愈伤组织为材料,通过酶解法获得山丹丹原生质体,进一步采用3因素4水平L16(3⁴)正交试验 。[结果]结果表明：(1)在预处理条件下(0.015 g/mL纤维素酶+0.005 g/mL果胶酶+0.65 mol/L甘露醇)得出最佳酶解时间为6 h,产量为3.47×10⁶个/ mL；(2)对正交试验结果进行极差分析,确定原生质体产量主次因素为：纤维素酶>果胶酶浓度>甘露醇浓度,同时得到最佳酶组合为0.02 g/mL的纤维素酶浓度、0.008g/mL的果胶酶浓度和最佳渗透压浓度为0.6 mol/L甘露醇,原生质体产量最高为3.47×10⁶个/ mL,活力为60.32%；(3)在最佳酶组合处理下,采用暗处理可将原生质体存活率提高到76.15 %；在15 min、1000 r/min时,原生质体产量最高,为3.51×10⁶/mL；在10 min、800 r/min时,原生质体活力最高,为61.2 %。 [结论] 该试验获得了山丹丹原生质体最佳分离条件,建立原生质体分离体系,为山丹丹种质资源的有效利用提供研究奠定基础。     

酿酒葡萄‘桂葡1号’幼叶原生质体分离研究

研究酿酒葡萄‘桂葡1号’幼叶原生质体的最佳分离条件。以‘桂葡1号’20~30日龄无菌苗幼叶为分离原生质体试材,对分离过程中酶液组合、酶解时间、稳定剂浓度、纯化时离心速度及离心时间进行比较分析。酶组合以2%纤维素酶+0.5%果胶酶为宜。随着酶解时间的延长,原生质体的产量逐渐增高,适合‘桂葡1号’幼叶原生质体的酶解时间以8 h为宜。在0.45~0.55 mol/L的甘露醇范围内,随浓度提高,原生质的产率明显上升,0.55 mol/L时达到最大2.48×106个/(g?FW),活力为79.78%。在悬浮纯化原生质体时,以1000 rpm离心6~8 min的效果较好。分离材料的适宜酶液组合为2% Celluasw Onozuka R-10+0.5% PectolyaseY-23+25 mmol/L MES+0.55 mol/L甘露醇,解离时间以8 h为宜。悬浮纯化时,蔗糖浓度以30%、1000 r/min离心6~8 min效果较好。     

小青杨叶肉原生质体分离条件的研究

为获得大量、有活力的原生质体,建立起高效的小青杨（Populus pseudo-simonii Kitag.）原生体分离体系,本研究以小青杨无菌苗叶片为材料进行原生质体分离条件的研究。结果表明：酶的种类和浓度、渗透压稳定剂浓度、酶解时间、叶龄是影响原生质体分离的重要因素;将叶龄35天的无菌苗第2~3片叶片置于酶液组成为CPW+3.0% 纤维素酶R-10+0.5% 离析酶 R-10+0.1% 果胶酶Y-23+0.6 mol/L甘露醇+0.6 g/L MES+1 g/L BSA中酶解8 h,原生质体产量和活力分别为2.44×107个/g和78.7%。通过该分离体系稳定的获得了高产量、高活力的原生质体,可以满足进一步的原生质体培养等技术的要求。     

辣根叶片原生质体分离条件的研究

分离优质原生质体是进行细胞功能性以及生物膜特性研究的基础,建立适宜的"酶液浓度与酶解时间以及酶液渗透压"组合是获得高产优质原生质体的重要条件.本实验以辣根叶片为材料,研究了不同酶液浓度、溶液渗透压以及酶解时间对其原生质体分离的影响.结果表明,用浓度为1%纤维素酶+0.1%果胶酶+0.9mol/L甘露醇组成的混合酶液,在28.5℃条件下,pH为5.8的酶液组合中酶解50min时,可获得较高的原生质体产量,且原生质体活力较高.     

洋葱愈伤原生质体分离和纯化研究

建立高效原生质体分离和植株再生体系是进行体细胞杂交的基础性工作。以洋葱多次继代的愈伤组织为研究试材,对原生质体分离纯化技术进行研究。结果表明：2.0%纤维素酶Onozuka R-10+0.1%果胶酶Y-23+0.5%离析酶 R-10+0.60 mol/L甘露醇+CPW+0.1% MES的酶液,酶解6 h,洋葱原生质体分离效果最好。纯化时,适当降低离心力的短时间离心有利于原生质体纯化过程中产量和活力的保持,以600 r/min离心5 min效果为好。     

二倍体野生种马铃薯Solanum pinnatisectmum原生质体分离纯化与培养的研究

为获得较好的原生质体分离和原生质体纯度,试验以野生种马铃薯(S.pinnatisectmum)试管苗叶片为材料,进行了原生质体分离和纯化的研究。结果表明:培养3周左右的试管苗叶片均在含有0.4%纤维素酶+0.7%果胶酶+0.1%离析酶,渗透压为0.3 mol/L的酶解液中解离效果最好,原生质体产量为1.93×106/g FW;在(25±1)℃酶解温度条件下静置14 h,可促进叶片原生质体的大量释放。而且,外源激素组合0.5 mg/L IAA+2.5 mg/L Zeatin有利于S.pinnatisectmum叶片原生质体的分裂,原生质体一次分裂频率达到6.32%。研究获得了稳定的原生质体分离体系以及较好的原生质体培养条件,为马铃薯野生种Solanum pinnatisectmum的体细胞融合提供了依据。     

NO与Ca2+对蚕豆保卫细胞气孔运动的互作调控

以蚕豆(Vicia faba L.)为材料研究NO和Ca²⁺对蚕豆气孔运动及质膜K⁺通道的影响。结果表明,10 mmol L^-1 Ca²⁺和100 µmol L^-1 NO供体SNP均有效抑制气孔开放,NO清除剂c-PTIO不能缓解Ca²⁺抑制气孔开放,相反胞外加入0.1 mmol L^-1 Ca²⁺可以明显加强NO对气孔开放的抑制程度,该现象可被La³⁺(Ca²⁺通道抑制剂)缓解。以膜片钳技术记录全细胞K⁺电流发现,胞外10 µmol L^-1或100 µmol L^-1 SNP均可选择性抑制蚕豆保卫细胞质膜内向K⁺通道,追加0.1 mmol L^-1 Ca²⁺可显著激活质膜外向K⁺通道,且可被La³⁺所缓解,然而0.1 mmol L^-1 Ca²⁺单独作用并不影响质膜外向K⁺通道活性。10 mmol L^-1 Ca²⁺单独处理可激活质膜外向K⁺通道,但不能被c-PTIO缓解。分别用Ca²⁺和NO专一的荧光探针Fluo-3-AM和DAF-2DA标记蚕豆保卫细胞原生质体,检测胞内Ca²⁺和NO的水平变化发现,100 µmol L^-1 SNP明显诱导胞内Ca²⁺积累,但10 mmol L^-1 Ca²⁺并不能诱导NO在细胞内积累。记录保卫细胞质膜Ca²⁺通道电流发现,NO可明显激活质膜Ca²⁺通道。表明NO有效抑制气孔开放,可能主要通过激活质膜Ca²⁺通道,提高胞内Ca²⁺,激活质膜外向K⁺通道促进K⁺外流,同时,可选择性抑制内向K⁺通道阻止K⁺内流,两种途径共同作用抑制气孔开放。然而,胞外10 mmol L^-1 Ca²⁺对气孔和质膜K⁺通道活性的调节并不依赖于NO。     

棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立

以棉花幼嫩子叶为外植体材料,分析影响棉花叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素,以棉花叶肉原生质体为受体,建立稳定、高效的目标基因瞬时表达与鉴定体系。技术体系包括,选择自然生长12 d的棉花幼嫩子叶为外植体材料,混合1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、0.5 mol L^–1甘露醇、20 mmol L^–1 KCl、20 mmol L^–1 MES、0.1 mol L^–1 CaCl₂和1.0 g L^–1 BSA等酶液,在28℃黑暗条件下振荡酶解8 h,可游离出浓度达1.0×10⁶ m L^–1以上的纯净棉花叶肉原生质体。利用该方法将棉花锌指蛋白基因GhZFP2整合到pJIT166-GFP质粒载体,构建了GhZFP2:GFP融合载体,采用40% PEG(4000)介导转化,获得高转化率的棉花叶肉原生质体。对目标基因瞬时表达产物检测表明,GhZFP2蛋白清晰定位在细胞核上。     

大蒜原生质体游离和纯化的研究

以大蒜胚性悬浮细胞系为研究试材,对原生质体分离纯化技术进行了研究。结果表明：2.0%纤维素酶Onozuka R-10+0.2%果胶酶Pectolgase+0.55 mol/L甘露醇+5mM Cacl2+5mM MES的酶液,酶解时间5h,大蒜原生质体分离效果最好。纯化时,适当提高离心力的短时间离心有利于原生质体纯化过程中产量和活力的保持,以1000 r/min离心5min,效果为好。     

酸枣花粉原生质体的分离条件研究

旨为酸枣倍性育种、细胞融合提供材料，为枣品种杂交培育、品种更新开辟新径。以酸枣四分体时期的花粉为材料，采用酶解法分离原生质体，血球计数器计算原生质体产量以及FDA测定原生质体的活力，探讨花粉原生质体的分离条件。试验结果表明，甘露醇作为渗透压调节剂，在１%蜗牛酶+0.5%纤维素酶的混合酶液中，静止酶解4 h，四分体时期的花粉原生质体分离率最高，达到4.8×105个/mL，且通过0.01%的FDA活力检测，四分体花粉原生质体的活力为21.1%；不同浓度的甘露醇影响花粉原生质体的分离，试验得出，在0.3mol/L的甘露醇中，四分体时期的花粉原生质体分离率达到3.8×105个/mL，且活力为27.3%。四分体时期花粉原生质体的成功分离为后续三倍体育种提供了材料，为酸枣花粉其它时期的原生质体分离提供了实践基础。     

博落回叶肉组织原生质体的分离条件筛选

博落回(Macleaya cordata)是一种罂粟科博落回属的多年生草本植物,其体内的血根碱(sanguinarine,SAN)具有抗炎、调控肠道菌群和促进动物生长的作用,因此长期以此作为饲用抗生素的天然源替代品在全世界70个国家和地区广泛销售。随着全世界越来越多的国家限用甚至禁止饲用抗生素,博落回资源的需求逐年增加。因此,通过育种等方法来提高博落回中血根碱的含量具有十分重要的意义。而利用原生质体技术进行品种改良是一个快速高效的方法,其中制备原生质体是第一步。本研究以博落回无菌苗叶片为材料,进行了原生质体分离和纯化。在一定条件下,通过比较不同的酶解渗透压、温度、时间和pH值,得到最适甘露醇浓度为0.6 mol/L,最适温度为30℃,最适时间为6 h,最适酶液pH值为5.8,在该条件下的产量可达到6.03×10^5个/mL,活力为87.3%。该研究为未来博落回的种质资源创新提供了前期研究依据。     

杏鲍菇原生质体制备条件初探

为了提高杏鲍菇原生质体产量,以杏鲍菇菌株为材料,通过单因素试验研究酶浓度、酶解时间、酶解温度、菌丝培养方式、菌龄以及稳渗剂种类对杏鲍菇原生质体制备的影响。结果表明：杏鲍菇原生质体制备的最佳条件为:酶浓度2%、酶解时间2.5 h、酶解温度29℃、菌丝液体静置培养5天,以甘露醇为稳渗剂,在此条件下原生质体产量为33.4×106个/mL,为杏鲍菇原生质体技术育种提供参考。     

苹果原生质体培养再生愈伤组织

以苹果试管苗叶片为原生质体分离材料,对影响原生质体分离和培养的因素进行了研究。结果表明适合叶片酶解的酶液组成是Cellulase-Onzuka R-10 0.8% + Pectinase 0.5% + PVP 1% + 甘露醇 0.65 mol/L + MES0.1%;以改良MT + BA 1.0 mg/L + 2,4-D 0.2 mg/L + 甘露醇0.65 mol/L + Vc 5.0 mg/L + Glu 500 mg/L + CH 100 mg/L + ME 500 mg/L + Arg 50 mg/L为培养基对原生质体进行培养,固液双层培养效果较好,最适培养密度为1×105 (个/ml),培养1-2 d原生质体变形,3-4 d第一次分裂,2 w分裂3-5次。平邑甜茶原生质体一个月后形成微细胞团,两个半月形成肉眼可见的微愈伤组织。鲁加5号和M7均只形成7-10个细胞的细胞团,嘎拉未见细胞分裂。