圆果黄麻纤维素合成酶基因CcCesA1的克隆及利用反义载体转化拟南芥

以圆果黄麻(Corchorus capsularis L.)"179"茎部韧皮为材料,利用同源克隆和RACE技术,克隆黄麻纤维素合成酶基因CcCesA1 5′端500 bp序列外的全部cDNA。其序列长度为2529 bp,编码627氨基酸残基,经Blast基因比对和蛋白质结构分析,确定是黄麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析表明,CcCesA1在植株不同部位表达量具组织差异性,依次为茎部韧皮根叶顶芽麻骨。利用CcCesA1基因部分cDNA序列和3′UTR区,构建黄麻CcCesA1基因反义载体,用测序验证的阳性质粒转化模式植物拟南芥。Southern杂交结果表明,外源基因以单拷贝方式整合进入基因组,转基因拟南芥生长严重受阻,植株变得矮小且茎部易弯曲倒伏,角果数量变少,长度变短,纤维素含量有不同程度的降低,本研究结果表明,所克隆的黄麻CcCesA1基因除了参与植物其他生理代谢过程外,还参与纤维素的生物合成。     

结球甘蓝花粉类钙调素蛋白基因BoCML49的克隆及表达分析

以结球甘蓝E1为材料,提取花粉萌发前和萌发后的混合花粉总蛋白,总蛋白双向电泳后通过MALDI-TOF-MS鉴定分析差异点,根据差异点分析结果,利用同源克隆得到甘蓝BoCML49基因707 bp的cDNA片段。通过对BoCML49基因的qPCR分析表明其表达量在花粉萌发前约为萌发后的2.73倍,表明BoCML49基因在花粉萌发后表达下调。通过5¢-Race和3¢-Race分别得到550 bp和721 bp大小cDNA片段,最终得到结球甘蓝BoCML49全长cDNA序列,开放阅读框位于125~
1 078 bp处,加尾信号(AATAAA)位于第1 222 bp处。通过cDNA推导得到的氨基酸序列分析表明,BoCML49编码317个氨基酸残基,预测分子量为33.51 kD,pI为6.93,经Smart-embl预测其含2个重要的EF-hand结构,分别位于序列第150~178和第216~244位氨基酸残基处,预测结果显示其含有7个α-螺旋和10个β-折叠结构。系统发育树表明结球甘蓝BoCML49与拟南芥AtCML49和AtCML50的亲缘关系较近。BoCML49基因的原核表达得到37.55 kD的融合蛋白。     

棉属野生种旱地棉苏氨酸醛缩酶基因GarTHA的克隆及功能验证

盐胁迫是影响作物生长和发育的重要因素之一。一些棉属野生种具有较好的耐盐性, 是开展棉花耐盐性机制研究以及改良陆地棉耐盐性的重要资源。本研究基于cDNA-AFLP技术分离获得的旱地棉(Gossypium aridum)盐胁迫下差异表达片段序列信息, 经电子克隆技术和RT-PCR方法克隆了旱地棉苏氨酸醛缩酶基因cDNA全长, 命名为GarTHA (GenBank登录号为KC167360)。该cDNA全长为1 018 bp, 包含一个822 bp的完整ORF, 编码273个氨基酸残基, 蛋白质分子量为82.57 kD, 等电点为4.89。GarTHA基因与杨树PtTHA基因同源性最高, 为84.6%。为进一步验证其功能, 利用拟南芥逆境胁迫启动子rd29A构建植物表达载体, 将GarTHA基因的完整ORF转入拟南芥中, 获得转基因植株并进行了耐盐性鉴定。结果表明, 在盐胁迫下转基因拟南芥种子的发芽率明显高于野生型, 且转基因植株的根长显著高于野生型。说明GarTHA基因可能参与植物的盐胁迫反应, 从而提高植物抗逆性。     

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的克隆及表达分析

以苎麻 [Boehmeria nivea (Linn.) Gaud.] 栽培种湘苎3号为材料, 通过简并引物RT-PCR结合RACE技术首次成功克隆苎麻纤维素合成酶基因BnCesA1 5′端450 bp序列以外的全部cDNA 序列, 序列长3 276 bp, 编码一段938个氨基酸的蛋白质。经基因比对及蛋白质结构分析确证是苎麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析显示：BnCesA1在苎麻根、茎、叶和芽组织中均有表达, 其表达量为茎＞叶＞芽＞根, 相对表达量依次为 0.791、0.381、0.319和0.183。从其表达模式可以推测该基因同时参与了苎麻细胞初生和次生细胞壁纤维素的合成。     

大豆苹果酸脱氢酶基因的电子克隆与生物信息学分析

利用电子克隆技术获得大豆中的苹果酸脱氢酶基因cDNA序列,并对基因及其编码蛋白进行生物信息学分析和预测,为进一步克隆该基因、解决植物磷高效基因数量缺乏等问题提供依据。结果表明,大豆中的苹果酸脱氢酶基因(GmMDH1)cDNA序列长度为1 574 bp,开放阅读框1 230 bp,编码409个氨基酸残基;编码蛋白含有NAD bindingsite,Dimerization interface,Substrate binding site,MDH_glyoxysomal_mitochondrial结合位点和保守域,属于LDH_MDH_like Superfamily家族;亚细胞定位分析显示,编码蛋白位于植物细胞的叶绿体中。     

花生几丁质酶基因的克隆及抗病性验证

为了探讨花生几丁质酶在抵御真菌性病害中的作用,克隆了花生几丁质酶基因并通过遗传转化验证了该基因的功能。以花生品种花育23号基因组DNA和RNA为模板,通过PCR及RT-PCR扩增分别获得长度为1 779 bp的花生几丁质酶基因DNA序列及795 bp的全长cDNA序列。DNA及cDNA序列比对结果表明,该基因包含3个外显子和2个内含子,内含子剪切符合"GT……AG"规则,其cDNA序列被命名为Ah-Chi,编码265个氨基酸,Gen Bank注册号为HQ439775。利用NCBI在线Blast进行序列比对,结果表明,该蛋白产物与水稻、玉米、紫花苜蓿、大豆、拟南芥的相关蛋白的同源性分别达到83%,83%,72%,58%,49%。用Ah-Chi替换掉植物表达载体pCAMBIA1301上的Gus基因,成功构建了植物过表达载体pCAMBIA1301-Ah-Chi。利用农杆菌介导法将pCAMBIA1301-Ah-Chi转化花生胚小叶外植体,获得再生小苗,经嫁接移栽获得再生植株。利用PCR扩增筛选获得转基因阳性植株,RT-PCR扩增结果表明,转基因植株中Ah-Chi基因表达量增加。用黑斑病菌接种转基因植株和非转基因对照植株离体叶片7 d后,发现非转基因植株叶片褐化及坏死程度较为严重,而转基因植株叶片褐化及坏死程度相对较轻,初步说明转基因植株抗病性增强。     

茉莉花香气相关基因JsGDS启动子的克隆及功能分析

大根香叶烯合成酶在植物萜类化合物合成中具有重要作用。前期从茉莉花cDNA文库中克隆获得香气相关基因Js GDS基因,但是其表达调控机制还不是很清楚,本研究拟采用染色体步移法从茉莉花基因组中克隆了Js GDS上游1 646 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子片段中包含启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box以及光调控元件、赤霉素应答元件、ABA应答元件、MeJA应答元件等多个与生长发育或者逆境胁迫相关的顺式作用元件。利用Gateway技术构建Js GDS启动子的GUS融合载体及其系列缺失体,并获得拟南芥遗传转化植株。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色。结果表明,Js GDS启动子及缺失体均具有驱动下游基因转录的活性。本研究为进一步探究Js GDS基因的调控和表达机制提供理论依据。     

刺槐纤维素合酶基因(RpCesA2)克隆、表达及SNP分析

利用同源克隆及RACE结合方法,首次从刺槐(Robinia pseudoacacia)茎部cDNA中获得纤维素合酶基因RpCesA2并获取基因组DNA序列。通过生物信息学分析,发现该基因内部含有3 291 bp完整编码区,编码1 097个氨基酸残基的蛋白;包含纤维素合成酶蛋白典型结构域:如1个锌指结构(zinc finger)及8个跨膜区(Transmembrane domain),与拟南芥纤维素合成酶基因CesA1至CesA10蛋白序列相似性达56.27%(At CesA8)~79.67%(AtCesA2)。通过构建系统进化树,发现RpCesA2基因与CesA5、CesA6、CesA9基因亲缘关系较近。组织特异性Realtime-PCR结果表明,RpCesA2基因在刺槐根、茎、叶片、叶柄4个组织部位具有不同的表达模式:第一时期、第三时期均在叶片中表达量最高,第二个时期茎中表达量最高。在此基础上,对10个刺槐无性系单株RpCesA2序列进行测序比对分析,检测到50个单核苷酸多态性(SNP)位点,其出现频率为1/130。CDS区域共有22个SNPs,其中15个是同义突变,7个为错义突变,非同义突变与同义突变比率为0.47。该研究结果为RpCesA2基因进一步连锁不平衡作图与关联研究提供理论依据,并最终有助于刺槐纤维素合成途径研究、标记辅助分子育种。     

北美海蓬子Na+/H+逆向运输蛋白基因的克隆及拟南芥转化分析

Na /H 逆向运输蛋白在植物耐盐性方面起着极为重要的作用.根据在不同植物中功能相同的同源基因保守序列设计引物,通过RT-PCR方法从真盐生植物北美海蓬子(Salicornia Bigelovii Torr.)中克隆出包括有1683bp的完整编码区在内的2 591 bp(GenBank登陆号为DQ157454)的Na /H 逆向运输蛋白基因(SbNHX1)cDNA序列.将该基因编码区序列构建到植物表达载体pVKH-35S-pA上,并通过农杆菌介导转化到模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中,得到T3代转入单基因种子.200 mmol/L的NaCl胁迫培养结果显示,转基因拟南芥在200 mmol/L的NaCl胁迫条件下生长状况好于野生型植株,植物表现有一定的耐盐性.     

两个陆地棉过氧化物酶cDNA的克隆和鉴定

从陆地棉优质材料7235不同发育时期的棉纤维混合cDNA文库中分离出2个与过氧化物酶相关的cDNA克隆GhPOD1和GhPOD2。GhPOD1是利用5’RACE技术得到的长度为1 489 bp的完整cDNA序列,开放读码框长度为816 bp,编码271个氨基酸,BLAST结果表明,该基因和拟南芥中已报道的过氧化物酶基因同源性最高。GhPOD2是通过对cDNA克隆直接测序获得,其插入片段长度为1 355 bp,开放读码框长度为999 bp,编码332个氨基酸,BLAST结果表明,该cDNA序列与已报道的1个陆地棉纤维过氧化物酶基因（pod8, L08199）氨基酸相似性达99％。RT－PCR分析表明GhPOD1是一个组成性表达的基因,而GhPOD2在根中不表达,而在茎、叶、胚珠和纤维细胞中表达,并从开花后14 d起,在纤维细胞中表达量逐渐减弱。进化树分析显示GhPOD1与已知的11个过氧化物酶基因距离都较远,是1个新的陆地棉过氧化物酶基因;GhPOD2与相似性高的pod8在同一分支,但与其余的第3类过氧化物酶也有较大的差异。Southern杂交结果表明这两个基因在陆地棉基因组中都存在2个拷贝,推测A、D亚组中各有1个拷贝。GhPOD1和GhPOD2的棉花转基因功能验证正在进行。     

两种苎麻纤维素合酶基因cDNA序列的克隆及表达

从苎麻转录组数据出发, 利用Blast工具从中分析出与多种植物纤维素合酶高度相似的片段CL789和Unigene20360。根据片段信息设计特异性引物, 从苎麻[Boehmeria nivea (Linn.)Gaud.]栽培种湘苎3号中克隆纤维素合酶核心片段, 并利用5'及3'RACE技术获得2个片段的全长cDNA。两者都具有典型的纤维素合酶特征结构域, 表明为2个苎麻纤维素合酶基因CesA的cDNA序列, 分别命名为BnCesA2和BnCesA3。BnCesA2基因编码区全长度3240 bp, 编码1 079氨基酸多肽; BnCesA3基因编码区全长3120 bp, 编码1039氨基酸多肽。对BnCesA2和BnCesA3基因在湘苎1号、湘苎3号、湘潭大叶白和城步青麻苎麻品种木质部和韧皮部荧光定量PCR分析显示, 2个基因在不同品种苎麻的木质部及韧皮部都有表达, 但表达量存在着一定差异, 整体而言BnCesA2具有更高的表达水平, 其木质部和韧皮部的表达都为BnCesA3的2~5倍。推测BnCesA2和BnCesA3都参与了苎麻细胞壁的次生合成。     

甘蓝型油菜防御素基因的克隆与表达分析

植物防御素具有广谱抗菌活性,不仅具有抗真菌、抗细菌、蛋白酶抑制和昆虫淀粉酶抑制等活性,而且参与调节植物的生长和发育。本研究根据白菜防御素基因序列设计引物,从甘蓝型油菜中克隆获得5个防御素基因,其c DNA全长325~461 bp,含有177~243 bp开放阅读框,编码58~80个氨基酸,含有8个保守Cys残基,具备Knot1功能域。系统进化分析表明,Bn PDF2.1、Bn PDF2.3、Bn PDF2.5与拟南芥PDF2亲缘关系较近,可能具有蛋白酶抑制活性。荧光定量分析表明,防御素基因具有组织表达特异性,在花蕾和叶中表达量较高,角果中次之;经1 mmol L–1水杨酸处理开花期油菜2 h后,防御素基因在茎、花蕾、角果中的表达量均有不同程度的上调,但在叶中表达有所下调,在根中表达无明显变化。     

甘蓝型油菜Cu/ZnSOD和FeSOD基因的克隆及菌核病菌诱导表达

依据拟南芥、芥菜型油菜和白菜已知超氧化物歧化酶(SOD)保守序列设计引物,用同源序列法和RT-RACE技术克隆甘蓝型油菜Cu/ZnSOD和FeSOD基因,经序列分析和基因片段拼接,得到Cu/ZnSOD和FeSOD基因的全长cDNA,分别为756 bp (GenBank登录号AY970822)和1 037 bp (GenBank登录号EF634058)。以cDNA序列设计引物,获得1 322 bp的Cu/ZnSOD基因组DNA (GenBank登录号DQ431853)和1 659 bp的FeSOD基因组DNA (GenBank登录号EF634057)。生物信息学分析表明,Cu/ZnSOD基因ORF框长459 bp,编码152个氨基酸残基的蛋白质,在基因组序列结构上具有7个外显子和6个内含子。而FeSOD基因ORF框长792 bp,编码263个氨基酸残基的蛋白质,在基因组序列结构上具有8个外显子和7个内含子。二者外显子和内含子交接处完全符合GT/AG规则。利用获得的Cu/ZnSOD的cDNA片段作探针,对菌核病菌诱导甘蓝型油菜叶片的mRNA进行Northern blotting分析,结果显示在同一品种(系)中菌核病菌诱导后Cu/ZnSOD mRNA表达量比诱导前升高,抗(耐)型油菜Cu/ZnSOD mRNA表达量明显高于感病型。油菜叶片SOD酶活性分析结果也获得了完全一致的结果。以上结果表明,甘蓝型油菜SOD基因与菌核病抗性相关。     

花生Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因启动子的克隆及功能分析

Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶(SAD)是决定植物体内饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比值的关键酶。以花生品种豫花9326基因组DNA为模板,通过基因组步移技术,克隆到花生Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因(Ah SAD)起始密码子ATG上游720 bp片段,利用5'RACE方法获得了该基因的5'UTR序列,通过序列比对确定720 bp片段为Ah SAD启动子区域。PLACE在线启动子预测分析表明,该序列具有真核生物启动子必需的核心元件TATA-box和CAAT-box,含有多个与光诱导和激素响应相关顺式序列元件。将Ah SAD启动子片段替换pBI121质粒中的CaMV35S启动子驱动下游GUS基因表达,构建植物表达载体pBI-PAh SAD。通过农杆菌介导法转化拟南芥和在花生不同组织中瞬时表达,利用GUS组织化学染色研究其表达特性。表明在拟南芥和花生受体中,AhSAD启动子主要调控下游基因在根、茎、叶片和子叶中表达,在花生的果针中也检测到GUS活性;拟南芥的茎生叶只有叶脉中具有GUS活性,而花生整个叶片中都具有GUS活性。     

茶树生长素外运载体基因CsPIN3的克隆与表达分析

从实验室前期茶树冷驯化转录组测序结果中筛选拼接得到1条与其他植物PIN蛋白高度相似的EST序列,采用反转录PCR结合RACE技术从茶树中克隆到生长素外运载体基因PIN3的全长cDNA序列,命名为CsPIN3 (GenBank登录号为KP896474)。CsPIN3全长2654 bp,包含1926 bp的完整开放阅读框(ORF),编码641个氨基酸;生物信息学分析显示,CsPIN3编码的蛋白质分子量为70.15 kD,理论等电点为8.42,是一种非分泌性蛋白;亚细胞定位显示,CsPIN3主要分布于质膜上,在内质网中有少量分布,是典型的膜蛋白;氨基酸序列分析表明CsPIN3编码蛋白由两端的疏水区和中间的亲水区构成。疏水区内有多个跨膜螺旋,其中N端疏水区有5个跨膜螺旋,C端有4个,与水稻的PIN蛋白结构相似。亲水区存在2个可变结构域,还存在着糖基化位点和磷酸化位点以及调控PIN蛋白内吞作用的NPNXY保守内在构型(Inner Motif, IM),如PIN蛋白特有的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PID/PINOID)磷酸化活性位点--TPRXS(N/S)结构域;相似性及系统进化分析表明,该基因编码的氨基酸序列具有较高的保守性,与杨树、葡萄、柑橘、烟草、番茄、马铃薯、和芝麻等植物的PIN序列相似性在80%以上,与茄科植物的亲缘关系最近。在拟南芥PINs蛋白中,AtPIN3与茶树CsPIN3的亲缘关系较近。组织表达特异性分析表明 CsPIN3在茶树根、茎、叶、花中均有表达,在花中的表达量较高,在茎、叶中的表达量略高于根部。实时定量PCR分析显示,CsPIN3在龙井43茶树越冬芽萌发阶段的表达量高于休眠阶段(休眠初期到膨大期之间),在茶芽萌动过程中表达上调的速度明显。推测该基因可能与茶树越冬芽休眠的维持和解除相关。     

甘蓝KAPP编码基因的克隆与序列分析

采用PCR、RT-PCR及其他分子生物学方法,以甘蓝基因组DNA、花蕾RNA和叶片RNA为模板,分别对甘蓝KAPP gDNA和KAPP cDNA进行扩增,分别获得3247bp的KAPP gDNA片段、1699bp的KAPP cDNA片段、1578bp的花蕾KAPP2 cDNA片段和1581bp的叶片KAPP2cDNA片段。对克隆的甘蓝KAPP gDNA和cDNA(结合报道的KAPPcDNA)进行比对表明,甘蓝KAPP基因包含11个内含子,均符合"GU-AG"剪接规则,并且克隆得到的KAPP cDNA序列与报道的KAPP cDNA序列有6处单个碱基的差异,但两者的氨基酸序列完全一致。然而花蕾KAPP2 cDNA、叶片KAPP2 cDNA片段与报道的KAPP cDNA序列相似性分别为85.2%和85.0%。这两个序列分别在590bp和593bp处较早出现一个无义突变引起的终止密码子。Blast分析表明,两基因编码的氨基酸序列与拟南芥KAPP氨基酸序列相似性最高,其次为甘蓝KAPP氨基酸序列。以已报道的8种植物KAPP的CDS及本实验所克隆的两个KAPP2序列构建分子进化树,获得序列与甘蓝KAPP序列聚为一支。结合比较作图及分子进化树,推测KAPP基因在甘蓝基因组上有两个拷贝,而笔者克隆到的KAPP2 cDNA序列是其中一个拷贝,是KAPP进化过程中突变失活的拟基因。     

津田芜菁BrSIZ1基因克隆、定位及表达

SIZ1是植物细胞蛋白质翻译后修饰SUMO化的E3连接酶,参与植物蛋白相互作用、定位和抗逆反应等。为研究BrSIZ1在津田芜菁中的表达特性,本研究克隆了津田芜菁SIZ1基因全长cDNA序列,命名为BrSIZ1 (GenBank登录号为KY441465),该基因全长2754 bp,其ORF全长2571 bp,编码856个氨基酸残基的多肽。构建了BrSIZ1-GFP表达载体进行亚细胞定位研究,结果显示BrSIZ1-GFP定位于细胞核内,可能在细胞核中发挥其功能。利用荧光定量PCR检测表明,该基因表达量在叶子中最高,幼苗和红色根皮中次之,表达具有组织特异性。而且BrSIZ1在芜菁根皮中的表达受长波紫外线(UV-A)诱导,在4°C、37°C胁迫的幼苗中,表达量增加。     

一个棉花类受体蛋白激酶基因的克隆与表达分析

 利用简并引物扩增、染色体步移以及RT-PCR的方法,分离了棉花的一个类受体蛋白激酶基因的全长序列。序列分析表明,该基因没有内含子,开放读码框的长度为2964 bp,编码的多肽序列含有988个氨基酸并与拟南芥控制花器官脱落的基因HAESA-like2具有60%左右的相似性,将该基因命名为GRLK5。半定量RT-PCR分析发现GRLK5在种子、茎皮、根和纤维中的表达量较高,并且受ABA的诱导表达。将GRLK5整合到植物表达载体pCAMBIA2301中,构建植物过量表达载体,通过农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草,PCR检测证明目的基因已经整合到烟草基因组中。