隐花色素CRY2基因片段克隆及RNAi植物表达载体的构建

隐花色素是植物向光反应的主要的光受体，介导蓝光／近紫外光调控的反应。在拟南芥中CRY2调节去黄化反应并控制开化时间。我们根据在GenBank中已经发表的拟南芥（NM_100320）、中国大白菜（AY176689）、油菜（AJ889779）CRY2基因的cDNA保守序列设计并合成同源引物。通过RT—PCR方法从“津田”芜菁（Brassica rapa L．subsp．rapa“Tsuda”）总RNA中扩增出CRY2基因的cDNA部分片段，采用gateway技术中的BP反应将其克隆到pDONR221中。测序表明，该片段与拟南芥具有87％的同源性，与油菜和中国大白菜的同源性达97％以上。采用gateway技术中的LR反应，以植物表达载体pH7GWIWG2（I）为基础，构建了由组成型启动子35S调控的CRY2基因的ihpRNAi植物表达载体。     

Gateway技术快速构建百合双价抗病毒RNAi表达载体

为获得适合转化百合的双价RNAi表达载体,以感病百合叶片的总RNA为模板,分别扩增400 bp左右的LSV和LMoV CP基因。通过重叠延伸PCR技术获得长约800 bp的LSV-LMoV融合基因。利用Gateway技术,通过BP反应及LR反应将LSV-LMoV融合基因克隆到双元载体pH7GWIWG2(Ⅱ),成功构建了含两种病毒基因的RNAi表达载体pH7GWIWG2(Ⅱ)-LSV-LMoV。将构建好的双价表达载体导入农杆菌EHA105,PCR和测序表明所构建的载体及获得的工程菌与预期的完全一致。     

应用Gateway技术构建水稻OsDAD1基因的RNA干涉载体

近年来,RNA干涉广泛应用于植物基因功能研究.Gateway技术是通过采用多重载体高效构建目标基因及任何DNA片段克隆和表达载体的研究平台,该技术以λ噬菌体的位点特异性重组体系为基础,两端具有重组位点的DNA片段或目标基因可以非常容易地被重组克隆到含同源重组位点的载体上.这种以重组为基础的克隆体系目前已被广泛应用于分子生物学中来分析基因的功能.本文应用Gateway技术体系替代传统载体构建方法,构建了水稻基因OsDAD1的RNA干涉载体,从而证明了Gateway技术的可行性.     

津田芜菁BrSIZ1基因克隆、定位及表达

SIZ1是植物细胞蛋白质翻译后修饰SUMO化的E3连接酶,参与植物蛋白相互作用、定位和抗逆反应等。为研究BrSIZ1在津田芜菁中的表达特性,本研究克隆了津田芜菁SIZ1基因全长cDNA序列,命名为BrSIZ1 (GenBank登录号为KY441465),该基因全长2754 bp,其ORF全长2571 bp,编码856个氨基酸残基的多肽。构建了BrSIZ1-GFP表达载体进行亚细胞定位研究,结果显示BrSIZ1-GFP定位于细胞核内,可能在细胞核中发挥其功能。利用荧光定量PCR检测表明,该基因表达量在叶子中最高,幼苗和红色根皮中次之,表达具有组织特异性。而且BrSIZ1在芜菁根皮中的表达受长波紫外线(UV-A)诱导,在4°C、37°C胁迫的幼苗中,表达量增加。     

同源重组快速构建百合LCHS2基因RNAi表达载体及其鉴定

为探讨CHS基因的下调表达对花朵着色的影响以及为百合观赏性状遗传改良提供技术支持,利用基于同源重组原理的Gateway技术,根据课题组从东方百合‘索邦’分离的LCHS2基因序列(Genbank登录号:GQ483376)和pENTR/D-TOPO载体要求,设计上游5'端添加'CACC'的一对特异引物,PCR扩增获得636 bp的干扰片段。通过TOPO克隆,将该片段克隆入载体pENTR/D-TOPO构建入门克隆载体pENTR/D-CHS,测序结果显示,与原序列同源性为100%。再经过LR反应使pENTR/D-CHS上的干扰片段替换掉目标载体pHellsgate12上的ccdB片段,快速构建了包含LCHS2基因干扰片段的RNAi表达载体pH12-CHSi,经限制性内切酶XhoI、XbaI酶切鉴定获得724 bp和722 bp的片段,与预期结果一致。pH12-CHSi电击法转化农杆菌GV3101,菌液PCR鉴定,出现636 bp的目的条带,表明RNAi表达载体pH12-CHSi已成功转入农杆菌。     

芜菁黄烷酮3-羟化酶基因的克隆、序列分析及表达

花青素是一类重要的植物次生代谢产物,黄烷酮3-羟化酶（F3H）是花青素生物合成早期阶段的重要催化酶。利用UV-A处理津田芜菁（Tsuda turnip）和赤丸芜菁（Yurugi Akamaru turnip）块根24h后提取总RNA,通过RT-PCR方法克隆了BrF3H基因。津田芜菁和赤丸芜菁的F3H基因完全相同。BrF3H的开放读码框为1077bp,编码358个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BrF3H与甘蓝型油菜（Brassica napus）F3H-1的同源性为99%。Northern杂交结果显示,UV-A可以诱导BrF3H表达,基因的表达量与处理时间呈相关。     

利用Gateway克隆技术大规模克隆拟南芥转录因子

随着越来越多基因组全序列的测定完成,基因组的研究进入了功能研究阶段。功能基因组的研究需要把大量基因连入不同载体,传统的酶切连接构建载体的方法不能满足这种大规模克隆的需要。Gateway技术是一种高效的大规模克隆系统,而且对载体和宿主没有依赖性。本文利用Gateway大规模克隆技术将16个拟南芥转录因子的ORF克隆入植物表达载pPTV和酵母表达载体pYTV中,酵母融合表达实验和Westem-blot检测证明了该克隆途径的可行性,并且得到的His-Tag融合蛋白,为拟南芥转录因子的大规模蛋白质组学研究奠定了良好的基础,同时基因序列的聚类分析为将来进一步的功能研究提供了有利信息。     

GFLVCP 基因 RNAi 载体构建及其在转基因烟草中的干涉效果

为探讨RNAi策略在抗GFLV基因工程中的效果,通过RT-PCR克隆获得了310 bp的GFLV外壳蛋白基因保守片段,采用Gateway技术将该基因片段连入目标载体pHELLSGATE12构建了RNAi植物表达载体,并通过农杆菌介导法转入烟草中,RT-PCR检测表明目的基因片段已整合到烟草基因组中并在RNA 水平上得到表达,病毒接种结果显示阳性植株的发病率明显低于对照,说明在转基因植株中dsRNA表达可干涉GFLV侵染过程。     

津田芜菁泛素化相关蛋白基因BrRUB1的克隆及表达分析

RUB1(related to ubiquitin 1)是植物和酵母中一种泛素类似蛋白质,是Cullin家族的一个成员。为阐释津田芜菁Br RUB1基因的表达特性,本研究克隆了津田芜菁RUB1基因的全长c DNA序列,命名为Br RUB1,Gen Bank登录号为KF501173。其ORF全长471 bp,编码156个氨基酸;亚细胞定位结果显示,Br RUB1-GFP定位于细胞核,表明Br RUB1蛋白可能在细胞核中发挥其功能。q RT-PCR检测Br RUB1的表达表明,该基因表达量在花蕾中最高,花瓣中次之,具有组织特异性。而且Br RUB1在芜菁根皮中的表达受长波紫外线(UV-A)诱导。     

津田芜菁泛素结合酶BrUBC11基因的克隆及表达分析

为阐释津田芜菁Br UBC11基因的表达特性,克隆了津田芜菁UBC11基因的全长c DNA序列,命名为Br UBC11,Gen Bank登录号为KM396887。其c DNA全长685 bp,ORF区全长447 bp,编码148个氨基酸的开放阅读框;亚细胞定位结果显示,Br UBC11-GFP定位于细胞核内,表明Br UBC11蛋白可能在细胞核中发挥其功能。荧光定量PCR检测Br UBC11在芜菁不同组织中的表达结果表明,该基因在花瓣中表达量最高,花蕾中次之,具有组织特异性。而且Br UBC11在芜菁白色根皮中的表达受长波紫外线(UV-A)诱导。研究结果显示,在芜菁中,UBC11属于多功能基因,具有潜在的参与花发育和UV-A信号转导相关途径的功能。     

126份芜菁种质资源地上部表型的多样性分析

芜菁是十字花科芸薹属蔬菜作物,具有耐低温、耐贫瘠等优良特征,能够在海拔4 000 m的高原地区种植。为了明晰芜菁种质资源地上部表型的特征特性,本研究以126份芜菁种质资源为材料,分析了其地上部性状的多样性。结果显示芜菁叶片呈现出比较丰富的多样性,其中叶片长度分布范围为20.8~63.17 cm,叶宽分布在6.7~23.5 cm之间,叶片形状、裂片数量、叶片绒毛和叶柄形状均表现出丰富的表型性状。多样性分析显示叶柄宽的变异系数最大,达91.26%,多样性指数最高的性状是叶片绒毛;相关性分析表明叶长与株高的相关性最高;主成分分析结果显示8个主成分因子的贡献率达73.255%;聚类分析结果将126份芜菁种质分为3大类,其中第一类包括1份资源,第二类包括21份资源,第三类包括104份资源;采用隶属函数对126份芜菁种质进行了资源分析,最终筛选出15份具有明显优势的种质,其中7份材料适于作为食用芜菁种植,8份种质材料适于作为冬储牧草的饲用材料,为后续研究、加工利用提供可选优质材料。本研究结果将为芜菁种质资源的利用和鉴定提供有效信息。     

SSR作为锚定标记构建白菜×芜菁分子遗传图谱

为了将已有的大白菜分子遗传图谱和已发表的A基因组参考图谱对应起来,本研究利用国际上发表的大白菜和甘蓝型油菜A基因组特异SSR标记作为锚定标记,重新构建了白菜×芜菁分子遗传图谱。利用双亲和F1对326个SSR标记进行了筛选,共获得86个多态性分子标记。在此基础上整合了已有的400个标记,最终构建了一张由10个连锁群组成,包含了347个标记的分子连锁图谱,图谱总长度为1008.7cM,标记间的平均图距为2.91cM。此图谱上包含了已在A基因组参考图谱上定位的56个SSR标记,分布于10个连锁群上,从而将各个连锁群与参考图谱的连锁群对应起来。每个连锁群上的标记数在25～58个之间,连锁群长度在60.6～177.0cM范围内,平均图距在1.33～4.92cM之间。该图谱为白菜重要性状的遗传定位奠定了良好基础。     

西藏油菜种质资源的RAPD分子标记分析

采用RAPD分子标记, 对西藏地区部分白菜型和芥菜型油菜资源的遗传多样性进行了分析, 结果显示, 22条引物在106份白菜型油菜中共扩增出236条带, 多态性位点比率为89%; 24条引物在50份芥菜型油菜中共扩增出276条带, 多态性位点比率为94%. 通过UPGMA聚类分析, 将西藏白菜型油菜分为Ⅰ和Ⅱ类群; 芥菜型油菜分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ类群     

Establishment of reliable methods of in vitro pollen germination and pollen preservation of Brassica rapa (syn. B. campestris)

A simple and reliable method for evaluating the viability of Brassica pollen was established in which the in vitro germination rate of pollen was adopted as the index of the viability of pollen grains. Pollen grains were preincubated in an atmosphere in which the relative humidity (RH) was fixed to 52% or 66% at 20 °C for 5 hours. They were cultured for 16 hours at 25 °C in a liquid Kwack's medium (1964) supplemented with 20% sucrose, and the pH was adjusted to 8.0. They were then observed under a microscope and the number of germinating and unchanged pollen grains were counted. The germination rate of pollen was improved and stabilized by preincubation and the use of a high pH medium. More than 90% of the freshly harvested pollen grains of Brassica rapa (syn. B. campestris) germinated constantly in these conditions Undehisced anthers were collected from flowers at anthesis and dehydrated by incubation at 20 °C for 16–24 hours in an atmosphere where the RH was fixed to 15% or 32%. They were put into a plastic vial and preserved in a freezer at -20 °C. The germination percentage of the preserved pollen was scored at intervals during preservation. The germination rate of the pollen grains preserved at -20°C for 1 year was higher than 50% and the pollen proved to be efficient for seed set. Most of the seeds germinated normally. This revised version was published online in August 2006 with corrections to the Cover Date.     

大白菜受环境胁迫影响的研究进展

大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)是中国种植面积较大的蔬菜作物之一,其不仅可以为人体补充维生素C和维生素E,对预防心血管疾病也有很大的帮助。大白菜在生长发育过程中受许多不利环境的影响,包括盐碱胁迫、水涝胁迫、重金属胁迫、温度胁迫等非生物胁迫,以及病虫害等生物胁迫。这些胁迫会引起大白菜发生一系列的变化,不仅会影响大白菜体内相关基因的表达,还会影响细胞的代谢和生长发育等过程。在这些胁迫下,大白菜自身能产生一定的抗逆性,但随着胁迫的增加,其自身产生的抗逆性不足以抵抗环境中较严重的非生物胁迫和生物胁迫,胁迫的影响使得大白菜不能正常生长甚至死亡,从而导致大白菜减产,造成市场供应不足的现象发生。本综述总结了近年来非生物胁迫和生物胁迫对大白菜生长的影响,并对大白菜应对胁迫而产生的抗逆性进行了概括,以期为后续的大白菜抗逆性研究提供参考。     

人工合成甘蓝型油菜抗旱性及DNA甲基化水平分析

甘蓝型油菜是具有重要经济价值的多倍体物种,是优质食用植物油和饲料蛋白质的重要来源之一。但是其驯化历史较短,遗传背景狭窄,且在整个生命周期中都对干旱胁迫敏感,因此培育高产耐旱品种是甘蓝型油菜的重要育种目标之一。本文用15%PEG-6000模拟干旱胁迫,对人工合成甘蓝型油菜不同世代(S1～S4)及其二倍体亲本进行不同时间的胁迫处理,并结合表型观察,以及叶片中丙二醛(MDA)、可溶性蛋白含量、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等生理指标的测定,初步了解上述材料的抗旱性差异。结合表型观察和叶片中相对含水量分析,发现人工合成甘蓝型油菜S1～S4及其亲本的抗旱性表现为甘蓝 Bn-S3 Bn-S4 Bn-S1 Bn-S2白菜型油菜。干旱胁迫后Bn-S3、Bn-S4的POD及SOD活性较高,MDA含量较低,表明Bn-S3和Bn-S4能更加有效地清除活性氧(ROS),对过氧化损伤的防御能力更强。通过HPLC分析发现所有材料的甲基化水平在胁迫12 h时最高,其中亲本白菜型油菜Br的甲基化水平最高, Bn-S1和Bn-S4介于两亲本之间,而Bn-S2和Bn-S3低于两亲本。甲基化敏感多态性分析也显示人工合成甘蓝型油菜在干旱胁迫后,甲基化和去甲基化水平均发生了明显的变化,表明植物的甲基化变化可能有利于提高其抗旱能力。     

不结球白菜Ogura雄性不育花器官形态及败育细胞学的研究

对不结球白菜细胞质雄性不育系S2108A和Y3611A及其相应的保持系S2108B和Y3611B进行了花器官形态比较和花药发育细胞学观察,结果表明:两套不育系和保持系之间在花器官的多个性状上差异极显著,而两个不育系S2108A和Y3611A之间除花蕾大小、雌蕊长和花瓣长有差异外,其他均不显著,说明从不同不育源转育来的两个不育系在花器官外形上差异不大;两个不育系花药败育表现均起始于四分体时期,且由于绒毡层的液泡化和径向膨大,挤压四分体小孢子导致败育,表明败育与绒毡层的不正常发育有关.此外,与Y3611A不同,在不育系S2108A中还存在另一种败育形式,绒毡层细胞壁发生融合,成为紧贴药室壁的类似于变形型绒毡层的周原质团,部分细胞质流人药室腔,包裹粘连四分体小孢子,成为染色很深的不连续团块状物,花药败育;两不育系花药发育存在花粉囊数目的变异,且花粉囊发育时期不同步,个别花粉囊较正常花粉囊发育推迟,在不育系Y3611A中还有巨型花粉囊的现象.     

白菜类蔬菜种子纯度SSR分子标记鉴定

种子纯度是种子质量的核心指标,是保障优良品种增产的关键因素。为了鉴定白菜种子纯度,本研究利用72对SSR分子标记检测种子纯度并结合田间植株形态观察,鉴定了5个白菜类优势品种的种子纯度,分别是‘珍绿6号’‘、津夏3号’‘、津研快绿1号’‘、速俊228’‘、速俊316’。结果表明,从72对SSR引物中筛选出5对具有多态性的引物,能够将父母本与杂交种区分开。试验中SSR分子鉴定结果虽略低于田间形态学鉴定结果,但利用统计学进行显著性分析,发现两者间无显著性差异。说明SSR分子标记可以用于白菜种子纯度的鉴定并通过本研究建立了一套准确、有效的品种纯度鉴定体系。     

抑制消减杂交法研究复等位基因遗传的

AB01是本课题组培育的复等位基因遗传的核雄性不育大白菜甲型“两用系”,目前已建立了一套该材料的应用技术体系,但其不育分子机制尚不明确。本研究以AB01的不育株和可育株为材料,利用抑制差减杂交技术构建了正反抑制差减cDNA文库,并通过测序及生物信息学手段寻找育性相关基因,以此来推断该材料的不育分子机制。研究中共找到27个差异表达基因,其中25个基因在NCBI数据库中均有同源序列,这些基因中7个与花发育相关,5个与脂类代谢相关,3个与活性氧及能量代谢相关,3个与光合作用及叶绿体合成相关,其余7个为功能未知基因。由此推测复等位基因遗传的核雄性不育大白菜不育的发生与脂类、能量代谢及光合作用有关。     

Synthesis and cytogenetic characterization of intergeneric hybrids of Diplotaxis siifolia with Brassica rapa and B. juncea

Intergeneric hybrids involving a wild crucifer, Diplotaxis siifolia (2n = 20; D^sD^s), and two crop Brassica species, namely Brassica rapa (2n = 20; AA) and B. juncea (2n = 36; AABB), were developed through sequential ovary/ovule culture. Hybridization was successful only when D. siifolia was used as the female parent, indicating unilateral cross incompatibility. Hybrids were intermediate between the parents for morphological characteristics but had low male as well as female fertility. Meiotic studies of hybrids revealed partial homoeology between D^s and A/B genomes.