棉花幼苗对低温胁迫的响应及抗冷机制初步研究

【目的】探讨棉花不同组织对低温胁迫的响应,初步探讨研究抗冷的生理生化和分子机制。【方法】测定了4个抗冷性差异显著的材料在低温处理后的生物量、抗氧化酶活力和可溶性蛋白含量,同时分析了抗冷相关基因在豫2067根、茎、叶的表达情况。【结果】4℃低温处理24 h对冷敏感材料生长抑制最大,对根系生长的抑制大于地上部分;细胞膜透性测定结果表明,受低温胁迫后4个材料根系细胞膜能保持相对稳定的结构,而叶片细胞膜对低温胁迫敏感,抗冷材料叶片细胞膜稳定性大于冷敏感材料,低温胁迫后叶片细胞膜透性与棉花的抗冷性呈负相关,可以作为棉花抗冷性的鉴定指标;棉花在受到低温胁迫24 h后,抗冷材料根中SOD的活力基本不变,冷敏感材料根中SOD的活力却极显著下降,2个材料的根系中POD、CAT的活力均下降,但抗冷材料豫2067下降的幅度小于冷敏感材料,可溶性蛋白含量在抗冷材料叶茎中基本不变,在冷敏材料的叶片和茎中均下降。低温胁迫后5个与抗冷相关的基因在豫2067叶片中上调表达的多于下调表达的,上调表达的基因分别是脂肪酸脱氢酶基因、胁迫诱导蛋白基因、假定R2R3-MYB转录因子基因、b HLH1转录因子基因;在根中下调表达的多于上调表达的,下调的基因分别为b HLH1转录因子基因、胁迫诱导蛋白基因、伸展蛋白基因2,这与根系的生长受抑制的结果是一致的。【结论】推测这些抗冷相关基因在叶片中的上调表达与叶片生长受低温抑制程度低有一定的关系。     

紫苏FAD3基因的克隆与表达分析

ω-3脂肪酸脱氢酶(ω-3 FAD)是植物脂肪酸合成途径的关键限速酶,通过调节该酶的过量表达,可以使植物中的α-亚麻酸(ALA)含量增加。本研究采用RT-PCR的方法,以紫苏L1品系为材料,克隆得到一个ω-3脂肪酸脱氢酶基因PfFAD3。生物信息学分析结果显示PfFAD3开放阅读框为1 176 bp,编码319个氨基酸,推测其蛋白分子量为44.7 k D,等电点为9.19;PfFAD3较为保守,具有四个富含组氨酸的保守区域。q RT-PCR结果表明,PfFAD3基因具有组织表达特异性,在种子中的表达量远高于其它器官。同时,研究了外源Me JA和温度对紫苏茎和叶中PfFAD3基因表达的影响,结果显示外源Me JA能够快速诱导叶片中PfFAD3基因表达量的上调,而抑制PfFAD3基因在茎中的表达;低温能够诱导叶片中PfFAD3基因表达量上调,而高温则抑制叶与茎中PfFAD3基因的表达,表明PfFAD3基因可能参与紫苏的防御反应。     

油棕脂肪酸脱饱和酶基因ω3启动子区的克隆及其表达组织特异性分析

本研究是以油棕叶片基因组DNA为模板,通过数据库预测的油棕脱饱和酶基因ω3的启动子序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增及TA克隆的方法得到了长度为1 144 bp油棕脱饱和酶基因ω3启动子序列。通过Plant CARE软件分析该序列的顺式作用元件,发现该启动子不仅含有转录必备的CAAT-box和TATA box,还有大量相关的光反应元件和激素响应元件。通过构建含gus的植物表达载体,农杆菌介导转化转基因拟南芥,对转基因拟南芥进行活性表达分析。结果表明:克隆获得的启动子序列和下游gus基因已经稳定的整合到获得的转基因拟南芥基因组当中;同时,gus基因在拟南芥不同组织中体现出明显的组织特异性,其中,茎干处表达量最高,在叶片的叶脉处表达次之。说明ω3启动子具有活性,可以启动目的基因的转录,本研究为进一步研究启动子的功能及基因表达调控奠定了基础。     

转录因子BcWRKY22在低温促进菜心抽薹开花中的功能分析

WRKY类转录因子参与植物生长发育调控及低温逆境应答。然而低温条件下WRKY参与菜心提前抽薹开花的分子机制尚不明确。本研究采用15℃低温处理菜心幼苗24 h、48 h,结果表明低温能使菜心叶片和茎尖中BcSOC1基因的表达量升高,菜心提前抽薹开花。低温处理对菜心茎尖和叶片中13个WRKY转录因子基因表达都有不同程度的影响,菜心BcWRKY22基因受低温上调表达。在拟南芥中异源表达菜心BcWRKY22基因可以使拟南芥提前抽薹开花,转基因植株叶片中AtSOC1的表达量显著高于野生型。酵母单杂交实验表明BcWRKY22转录因子可以结合BcSOC1基因的启动子。本试验说明BcWRKY22转录因子响应低温胁迫,可能通过对开花相关基因BcSOC1的启动子直接结合作用来调控菜心提前开花。     

低温胁迫对番茄幼苗叶片中脯氨酸降解酶的活性及其基因表达量的影响

为了探讨脯氨酸代谢与番茄抗寒性之间的关系,采用常规方法测定了低温胁迫不同时间下番茄幼苗叶片中游离脯氨酸含量和脯氨酸脱氢酶活性,采用实时荧光定量PCR法检测了不同处理时间下脯氨酸脱氢酶基因的表达量,并分析了各项指标的动态变化。结果表明,在低温逆境下,耐寒性品种O-33-1中脯氨酸积累量总体呈增加的趋势,而冷敏感品种‘耐运2000’游离脯氨酸积累量下降,说明脯氨酸积累量的变化在一定程度上可以体现番茄抗寒性的强弱;ProDH活性在O-33-1中呈上升趋势,在‘耐运2000’中呈下降趋势,说明脯氨酸的积累受P5CS与ProDH相反方向的共同调节,使植物体内脯氨酸含量保持在适当的水平;2个品种在低温胁迫下ProDH基因表达量都显著降低,说明低温逆境抑制了该基因的表达,使脯氨酸的降解在转录水平上受到调节。     

茄子耐低温性差异材料的筛选及其转录组分析

茄子受低温胁迫后植株生长和果实品质受到严重影响。为了筛选茄子耐低温种质并从分子水平上揭示其与耐低温的相关性。本研究在前期预试验的基础上筛选出2份不同基因型的茄子自交系材料,研究了低温胁迫对其种子萌发和幼苗伤害的影响。并以幼苗在4℃低温处理下的叶片为材料进行转录组测序,对差异表达基因进行功能分类和富集分析。结果发现,‘CHEN18’在种子萌发和幼苗低温耐受性上远强于‘819’。转录组数据分析表明两个茄子材料在遗传背景上存在一定的差异,低温处理使得二者在生物调节过程、细胞过程、代谢过程和单有机体过程中存在着较多的差异表达基因。上调差异表达基因主要富集在细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理和新陈代谢中。本研究结果为茄子耐低温种质筛选和相关耐寒基因的挖掘提供一定的参考。     

转cry1C基因抗虫超级粳稻田间目的基因表达及抗螟虫性

为了研究转基因抗虫超级粳稻田间目的基因表达及抗螟虫性,将10个来自于不同独立抗性愈伤组织的转cry1C*基因抗虫超级粳稻品系种植于田间,利用实时荧光定量PCR方法检测孕穗期叶片、茎鞘和幼穗等器官目的基因mRNA,利用酶联免疫吸附(ELISA)法检测孕穗期叶片、茎鞘和幼穗及收获后糙米的Cry1C蛋白,利用田间目测调查二化螟危害的白穗率。结果及分析显示,转基因超级粳稻不同品系及不同器官cry1C*基因田间表达量明显不同,cry1C*基因mRNA表达量叶片＞茎鞘＞幼穗,蛋白质表达量叶片＞茎鞘＞幼穗＞糙米。转基因超级粳稻田间目的基因表达,在mRNA水平和蛋白质水平,不同器官间存在正相关关系,各器官Cry1C蛋白质含量和糙米Bt蛋白质含量呈正相关。在本研究范围内,不论转基因粳稻植株Cry1C蛋白质含量高或低的品系,田间均表现为高抗二化螟。培育转基因抗虫粳稻品种时,注意对目的基因适量表达的抗虫基因型的选择。     

油用牡丹PsFAD6基因的克隆与表达分析

本研究以油用牡丹(Paeonia suffruticosa)叶片为试验材料,采用RACE和RT-PCR的方法克隆得到油用牡丹ω-6脂肪酸脱氢酶(ω-6 FAD)基因cDNA全长,命名为PsFAD6(GenBank登录号:KY233120)。序列分析表明,该基因cDNA序列全长1 819 bp,其中开放阅读框1 326 bp,编码441个氨基酸,3'端非编码区长271 bp,5'末端非编码区长192 bp;多序列比对表明,油用牡丹PsFAD6氨基酸序列含有3个保守结构域,系统发育分析显示油用牡丹与葡萄处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和TargetP亚细胞定位分析得知,PsFAD6蛋白无信号肽,具有3个跨膜域,可能定位于叶绿体中发挥功能。组织特异性分析表明,PsFAD6在油用牡丹的根、茎、叶、花瓣、雌蕊、雄蕊、种子中均有表达,其中,在叶片中表达量最高,雄蕊次之,在雌蕊中表达量最低;不同发育时期种子中,80 d表达量最高,60 d次之,在20 d中表达量最低     

陆地棉叶片发育相关基因GhRH39克隆与功能分析

【目的】研究陆地棉DEAD-box RNA解旋酶基因GhRH39在叶片发育中的功能。【方法】借助生物信息学方法分析GhRH39的基因结构和进化关系,利用实时定量聚合酶链反应PCR (Quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)分析该基因在棉花不同组织和叶片不同发育时期的表达情况,利用病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)技术对该基因进行沉默。观察阳性植株表型,检测其光合色素含量变化,对阳性植株中叶绿体发育和光合色素合成相关基因进行表达量检测。【结果】Gh RH39编码620个氨基酸,且序列较为保守。qRT-PCR分析表明,该基因在根、茎、叶片、顶芽、花瓣、纤维中均有表达,在叶片中表达量较高,且在叶片中的表达量随着叶片发育进程而变化。利用VIGS技术成功降低了GhRH39的表达水平,基因沉默的阳性棉株出现失绿表型,叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素3种光合色素含量均降低。阳性沉默棉株的叶绿体发育和光合色素合成相关基因表达量出现一定程度的下降。【结论】GhRH39基因影响棉花叶绿素和类胡萝卜素合成,同时影响叶绿体发育过程。     

棉花4个脂肪酸合成相关基因的克隆和表达特征分析

脂肪酸合成相关代谢在控制油的合成和抗非生物胁迫中均起着重要作用。其脂肪酸合成相关基因的时空表达水平直接影响油的含量和脂肪酸合成相关酶的活性。本研究克隆了4个脂肪酸合成相关基因,分别命名为GhKASII、GhKASIII、GhFAD和GhGPAT,其中GhKASIII、GhFAD和GhGPAT基因cDNA全长通过电子克隆和同源克隆得到。而GhKASII通过筛库和5'-RACE途径得到。组织表达分析表明, 上述4个基因在根、茎、叶及纤维发育不同时期均有表达,属于组成性表达基因。其中GhKASII、GhKASIII在25 DPA种子中表达量最高,GhGPAT在0 DPA胚珠和15 DPA纤维中表达量很高,GhFAD在0DPA胚珠, 15 DPA种子,20 DPA纤维中表达量均很高。不同非生物胁迫的诱导表达分析表明,上述4个基因均不同程度被茉莉酸甲酯,ABA,创伤和冷害等逆境诱导表达。     

黄瓜离体雌核发育早期相关基因的转录组初步分析

研究黄瓜离体雌核发育早期相关基因的表达,为进一步大幅提高黄瓜未受精子房培养胚胎诱导率奠定理论基础。采用基因表达谱芯片和qPCR技术,提取黄瓜未受精子房培养早期胚珠部位总RNA,从转录组水平分析了高频基因型和低频基因型黄瓜未受精子房培养早期差异基因表达。筛选出与胚胎发育相关的基因47个,经qPCR验证,获得8个候选基因,在高频型材料培养的前6 d均呈现高水平表达,在低频型材料培养中呈现低水平表达或总体变化下降的趋势。其中3个基因与响应水杨酸、茉莉酸防御系统,响应脱落酸刺激,生长素诱导结合蛋白以及玉米素合成途径中细胞分裂素脱氢酶的表达相关;2个基因参与POD酶活性表达;3个基因分别与苏氨酸-丝氨酸蛋白激酶、水通道蛋白以及机械敏感性离子通道蛋白相关。初步认为上述8个基因是与黄瓜离体雌核发育早期过程相关的重要基因。     

生长前期甘蔗叶片糖分含量及蔗糖磷酸合成酶基因表达分析

本研究比较高糖(GT28, ROC22)、中糖(YT71-210)和低糖(GT86-877)基因型甘蔗生长前期叶片中的糖分含量、叶绿素含量、蔗糖代谢相关酶活性及SPS家族基因的表达水平,以探究不同甘蔗基因型生长前期的蔗糖代谢情况,为全面了解甘蔗整个生命周期的蔗糖代谢机制提供依据。结果表明,各甘蔗基因型蔗糖代谢指标与茎中糖分含量有一致性,均呈现高糖品种中糖品种低糖品种趋势。SofSPSA基因家族在甘蔗苗期的叶片蔗糖积累过程中mRNA水平的表达量较低,B、C、D家族基因相对表达水平较高。甘蔗的高、低糖基因型与叶片蔗糖代谢相关酶活性有着密切关系,并影响糖分积累。与低糖品种相比,高糖品种甘蔗叶片的叶绿素含量、SP家族基因的表达水平、糖分含量及蔗糖代谢相关酶活性相对较高,表明高糖品种甘蔗叶片蔗糖代谢水平更加活跃。     

外源ABA对低温胁迫下玉米幼苗内源激素含量及Asr1基因表达的调节

脱落酸(ABA)是低温逆境下的重要信号因子,为了探讨外源ABA对低温胁迫下玉米幼苗的生长调节作用,以耐低温玉米品种久龙5号为试验材料,采用不同浓度(5、15、25、35 mg L–1)ABA于玉米三叶一心时喷雾于叶片,并进行低温梯次处理。分析处理后玉米叶片相对电导率、抗氧化酶活性及内源激素ABA、IAA的含量变化,并采用Real-time PCR明确Asr1基因表达水平变化。结果表明,低温胁迫下不同浓度外源ABA处理的玉米叶片相对电导率整体呈上升趋势,SOD和POD活性加强,15 mg L–1和25 mg L–1ABA处理的SOD活性均显著高于未应用ABA处理,玉米內源ABA和IAA合成水平上升,应用ABA后Asr1基因相对表达水平上调,其中5、15和25 mg L–1浓度处理基因表达上调显著。相关分析表明,ABA含量与Asrl基因相对表达量、SOD活性均表现为极显著正相关,与POD活性显著正相关。说明Asr1基因表达受ABA的介导调控,Asr1基因表达量的提升,也促进了内源ABA的合成,抗氧化酶活性加强,提升了应用ABA后玉米的抗低温能力。但外源ABA的介导调控具有一定浓度效应,表现为低促高抑。     

不同施氮水平下甘蓝型油菜发育种子中基因表达谱差异分析

氮肥是油菜生长发育需要的重要营养元素之一, 增施氮肥可提高油菜籽产量和蛋白含量, 但降低种子含油量。筛选氮肥不敏感油菜基因型、发掘氮肥响应基因及调控网络研究尚不多见。本研究以油菜中双11和德国品种Parter为材料, 设置4个氮水平(施用尿素0、90、180和270 kg/hm^–2), 随机区组试验, 利用Agilent油菜基因芯片在全基因组水平分析施氮(180 kg/hm^–2)和未施氮(对照)处理授粉25 d种子的基因表达谱。结果显示, 随着施氮量的增加, 种子含油量降低, 而蛋白含量增加, 且在2个品种中的变化程度不同, Parter含油量的下降水平比中双11显著。处理与对照相比, 中双11和Parter分别有827个和3 676个差异表达基因, 明显存在基因型的差异; 2个品种中共同的差异表达基因有278个, 其中上调表达的151个, 下调表达的80个, 差异表达在10倍以上的基因有4个。根据基因功能注释, 2个品种中的差异表达基因分子功能主要为催化、结合和转录调节活性, 参与细胞、代谢和应激等生物过程, 约50%的差异基因未得到功能注释。选择8个差异表达基因进行实时荧光定量PCR分析, 结果显示2种方法的检测结果吻合率为94%, 表明检测结果具有一定的生物重复性。本结果为进一步筛选油菜氮肥敏感基因型、开展氮应答机制研究提供了有用信息。     

黄瓜Cs-ppc基因的组织表达分析及光强对其在叶片中转录水平的影响

为了解黄瓜中ppc基因在各组织的转录水平及不同光强对叶片中该家族基因转录水平的影响,本研究对已克隆得到的Cs-ppc1、Cs-ppc2和Cs -ppc3基因的转录水平进行荧光定量PCR分析.Cs-ppc1和Cs-ppc3在多个组织中的表达量均较高,Cs-ppc2基因的组织表达差异性较大,花中的表达量高而在其他组织中的表...     

红花(Carthamus tinctorius)热激转录因子CtHSFA9的克隆及表达分析

根据课题组前期转录组文库信息获得的红花热胁迫相关转录因子Unigene的全长序列,设计引物并克隆该基因,采用生物信息学方法对其氨基酸序列的理化性质、系统发育、蛋白质亚细胞定位、结构域及跨膜区域等进行预测和分析。此外,试验还采用RT-qPCR方法分析该基因在红花各组织包括根、茎、叶、花及4个不同发育时期的种子中的表达情况。结果发现,所获序列全长1 326 bp,可编码441个氨基酸,相对分子质量50.41 k D。其中,最丰富的氨基酸为亮氨酸(Leu),带正电残基64个,带负电残基75个。信号肽及亚细胞定位揭示该基因不存在明显信号肽且该基因属细胞核定位。SMART分析表明该基因具有典型HSF结构域。进化树分析表明,该序列与热激转录因子HSFA9基因相似度较高,与刺菜蓟的亲缘关系最近,因此可将其命名为CtHSFA9。荧光定量PCR分析表明CtHSFA9基因在红花根组织中相对表达量最高,叶次之,花中最低。在不同发育时期种子中,以花后18 DAF (Day after flower)中表达量最高,22 DAF次之,在14 DAF表达量最低。本研究初步明确了红花CtHSFA9基因的结构特点和进化关系,其属于HSF热激转录因子家族,可为后续开展红花逆境相关转录因子的机理研究做铺垫,同时也为植物抗逆性状的改良提供研究基础。     

钾素对马铃薯钾转运体KUP6和KUP7基因表达量的调节

为了研究不同钾素浓度对钾转运体KUP6和KUP7基因表达量的影响,通过水培法培养马铃薯幼苗,通过提取马铃薯总RNA,经检测合格后用反转录试剂盒合成其c DNA的第一链。运用实时荧光定量核酸扩增检测技术对幼苗叶片进行基因转录水平的检测。在马铃薯幼苗种植后的第10,20,30天分别测定马铃薯幼苗根、茎和叶中钾的含量,并进行统计分析。结果表明:钾素浓度为1.00 mmol/L时,KUP6和KUP7基因表达量最高,且与其他处理有显著差异;钾素浓度低于0.10 mmol/L时,表达量较低,钾素浓度为10.00 mmol/L时该基因表达量也降低。表明较高和较低的钾离子浓度都不利于KUP6和KUP7基因的表达。通过对根、茎和叶内钾素含量测定表明:对于根系来说,钾素浓度在1.0 mmol/L时已到达其吸收饱和值;在钾素浓度为1.00,10.00 mmol/L的高钾水培中,马铃薯根、茎和叶钾素含量大于水培钾素浓度为0.01,0.10 mmol/L的低钾处理;在低钾水培条件下,茎叶随着培养时间的延长,其钾素含量之间的差异逐渐减小,而在高钾条件下,其差异逐渐增大。     

基于FAE1和FAD2基因的油菜种子脂肪酸生物合成遗传调控

脂肪酸延伸酶1基因FAE1和Δ~(12)-脂肪酸脱饱和酶基因FAD2是植物脂肪酸生物合成途径中的两个关键酶基因,在同一甘蓝型油菜品种CY2中对这两个关键酶基因进行单表达和双表达遗传调控获得五种不同类型的具有相同遗传背景的转基因株系。本研究分析比较了种植于相同环境条件下的五类转基因株系及野生型对照的种子脂肪酸组成和含油量,结果表明,两基因单独和双重调控可显著改变油酸、亚油酸、亚麻酸、花生烯酸和芥酸等多种脂肪酸含量,其中两个内源目标基因同时沉默种子中的油酸含量从20.5%提高到了82.8%,拟南芥FAE1基因籽粒特异表达种子中的芥酸含量由43.9%增加到了60.2%。与野生型对照相比,五类转基因种子中的十八碳不饱和脂肪酸相对比率和油酸脱饱和比例均发生了显著变化。此外,增强FAE1基因表达后种子含油量有所提高,而沉默两个目标基因的表达则使种子含油量降低,表明两个关键酶基因调控对油脂合成与积累也产生一定影响。     

大豆基因组和转录组的核基因密码子使用偏好性分析

研究大豆核基因密码子的使用模式,探讨影响其密码子组成和编码特点的因素,为运用基因工程技术提高改良大豆提供理论依据。以大豆基因组的46 430个高置信编码基因和2 071条大豆全长转录本序列为数据来源,应用CodonW软件对大豆全基因组密码子组成、同义密码子使用频率和全长转录组编码区密码子使用各项参数的计算和统计分析发现,基因的表达水平与编码区G+C和GC3s含量均呈极显著正相关,且G+C和GC3s含量越高的基因密码子使用偏好性越高,并确定了UCC和GCC为大豆最优密码子。编码区长度分组分析表明,密码子使用偏好性随编码区长度的增加而降低,编码区较长的基因则趋向于随机使用密码子,且在转录组数据范围内,编码区长度介于400~600 bp的基因表达水平最高。大豆叶片和种子中特异表达基因的密码子使用偏好性和基因表达水平较为接近,但种子特异表达基因的G+C和GC3s含量均显著高于叶片特异表达基因,而其芳香族氨基酸含量则极显著低于叶片特异表达基因。     

象草叶片和茎秆木质素合成相关基因的表达模式分析

为了系统地研究象草茎叶中木质素合成相关基因的表达模式,以N51象草为试验材料,测定了象草茎秆倒数第一、第三、第五节间以及倒数第一、第三、第五、第七和第九叶片的木质素含量及相关合成基因的表达量。结果表明,在成熟象草中,木质素含量在茎和叶垂直的空间结构中由上到下逐级递增。实时荧光定量PCR表达分析显示,不同木质素合成基因的表达表现出了组织特异性,叶组织的COMT、C3H和HCT4基因表达量显著低于茎组织,如COMT在倒五节间的表达量最高,约为叶片中表达量的6倍,而4CL和F5H基因在叶组织中却显著高于茎组织,如4CL在倒九叶的表达量最高,约为倒一节间表达量的14倍。关联分析结果表明,茎秆中的木质素含量与F5H、HCT4以及CCoAOMT基因的表达呈正相关,与C3H基因的表达呈负相关,而叶片中的木质素含量与4CL基因的表达呈正相关,C4H、COMT、HCT4以及CCR基因的表达呈负相关。该结果可以说明不同的木质素合成酶在不同的组织中呈现表达差异,并且在不同组织中,合成的主要木质素也不同。