百香果低温胁迫转录组及茉莉酸代谢基因分析

为研究百香果低温胁迫响应机制,以紫果百香果(Passiflora edulia Sims)为试验材料在0℃下低温胁迫处理,以常温处理为对照组(CK),采用Illumina HiSeq测序平台进行转录组测序,并对茉莉酸代谢相关基因进行挖掘。结果显示,共获得百香果转录组数据45.30 Gb,组装得到39 521条Unigene和5 311 个差异基因;GO分类显示注释的Unigene分为细胞组件、分子功能及生物过程三大类,其中差异基因数量最多为生物过程大类的代谢过程,包括甾醇生物合成、类黄酮糖脂化、酪氨酸代谢、L-苯丙氨酸生物合成、软木脂生物合成、芥子油苷代谢及长链脂肪-酰基辅酶A代谢等。KEGG途径富集分析结果显示,核糖体途径、淀粉与蔗糖代谢途径、植物激素信号转导途径及植物与病原体互作途径为百香果响应低温胁迫的重要代谢途径。实时定量PCR(qRT-PCR)分析表明,百香果低温胁迫后其茉莉酸代谢途径相关基因AOC、AOS、JAR1、MYC2、PYL和JAZ均上调表达,该结果与测序获得FPKM值变化趋势较为相似,说明测序结果较为准确。但低温胁迫后,COI1的表达水平呈下调趋势。研究发现,在百香果中茉莉酸对低温胁迫的响应机制大体上与模式植物一致,关于COI1和MYC2等基因的调控方式还有待进一步功能验证。本研究结果为进一步明确百香果抗寒机制提供了科学参考。     

应用Solexa测序技术分析棉花不同抗病品种的数字表达谱

棉花枯萎病是一种危害严重的世界性病害,构建棉花枯萎病不同抗病品种的基因表达谱将为进一步研究棉花抗枯萎病的分子调控机制及筛选抗枯萎病相关基因奠定基础.本研究选用高抗枯萎病的陆地棉品种中棉所12和高感枯萎病的陆地棉品种新陆早7号为材料,利用Solexa高通量测序技术分析棉花幼苗根部组织中的基因表达情况.Solexa高通量测序后构建了多达350万个reads的标签文库,根据已知序列信息,显著差异表达基因1 080个,其中上调基因302个,下调基因778个.基因功能分析表明,已注释的显著差异表达基因可划分为分子功能、生物过程和细胞组件3个功能注释本体,并进一步细分为37个功能类别.鉴定出112条代谢通路,注释了1 238个显著差异表达基因,共涉及氨基酸代谢、多糖的生物合成和代谢、脂类代谢、能量代谢及信号转导等方面.在植物激素信号转导通路分析中,涉及到26个已知功能基因,4个基因编码AP2/ERF转录因子,4个基因与LRR类受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶或蛋白激酶有关,5个基因与蛋白磷酸酶2C有关,而这些基因都参与植物的抗病反应.随机抽取5个基因进行实时荧光定量PCR验证,其结果与测序结果一致.本研究初步揭示了棉花枯萎病抗感品种在转录组水平上的表达差异,获得了大量差异表达基因.     

利用转录组测序技术鉴定紫花苜蓿根系盐胁迫应答基因

盐害是影响紫花苜蓿生产力的主要非生物因素之一,鉴定控制这一复杂性状的基因将为苜蓿育种计划提供关键信息。为揭示紫花苜蓿在盐胁迫下基因表达谱的变化,以紫花苜蓿Millennium为材料,对正常培养(WT_CK1)和盐胁迫(WT_N1)条件下的2个样品根系进行转录组分析,同时利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对部分关键基因的表达特点进行验证。结果表明,紫花苜蓿根系在250 m M Na Cl胁迫72 h时,共检测到31 907个基因表达量发生了改变,2 758个基因的表达量差异达到2倍以上,包括199个转录因子,其中1 338个表达量上调,1 420个表达量下调,这些差异表达基因功能主要涉及次生代谢、代谢途径、激素代谢及信号转导和植物病原菌互作等。qRT-PCR分析表明,6个随机选择的基因在胁迫前后的表达特点与表达谱测序结果一致。综上,紫花苜蓿根系对盐胁迫响应是一个多基因参与、多个生物代谢过程反应协同调控的过程,基因表达量的变化可能是调控的主要方式。此外,本研究候选了一系列胆汁酸:Na+共转运蛋白、晚期胚胎发生富集蛋白、谷胱甘肽-s-转移酶基因和转录因子等与紫花苜蓿盐胁迫相关的应答关键基因,为揭示紫花苜蓿耐盐分子机制奠定了基础。     

低温胁迫下苦瓜叶片转录组差异基因分析及生理响应特征

苦瓜在生长季节遇到低温会影响其生长发育和产量,限制了种植分布区域。为了研究苦瓜耐寒性的分子机制,本研究以苦瓜自交系43为试验材料,在8℃低温胁迫处理后观察其表型并测定相关生理生化指标,再利用转录组测序技术从生理角度结合分子水平对苦瓜低温胁迫机制进行生物信息学分析。结果表明,在8℃低温胁迫下,苦瓜表现出耐低温适应性,在低温胁迫下丙二醛(MDA)含量、脯氨酸含量及电解质渗透率均呈现显著变化。分析了低温胁迫0和12 h后的转录组变化,结果发现低温胁迫处理后有916个基因上调,369个基因下调。对差异表达基因进行通路注释分析,发现大量与低温胁迫相关的代谢途径。进一步筛选到10个在其他物种报道过可能与冷胁迫相关的基因,包括MYB、WRKY以及NAC转录因子等。对植物耐低温相关的候选基因进行了实时荧光定量PCR(qRT-PCR)表达谱分析,结果与生理表型变化相吻合,同时进一步证实了RNA-seq数据的准确性。本研究基于全基因组水平分析苦瓜在低温胁迫下的转录组变化,以及耐低温相关基因动态变化和生理反应的分子机制,为揭示苦瓜中的耐寒性机理和筛选遗传改良候选基因提供了一定基础。     

大豆孢囊线虫大豆和烟草群体的转录组比较分析

大豆孢囊线虫(Heterodera glycines,soybean cyst nematode,SCN)为植物专性内寄生线虫,主要危害大豆(Glycine max)等豆科植物,烟草(Nicotiana tabacum)是其非寄主。但近年来,本课题组在山东地区发现一个特殊的SCN群体(简称SCN_T),其可以寄生烟草,但对大豆的致病性很差。为揭示SCN_T与普通大豆孢囊线虫群体(SCN)对同一寄主致病性存在显著差异的分子机制,本研究采用Illumina平台Hi Seq~(TM)2500高通量测序技术对两个群体的2龄幼虫(second stage juvenile,J2)进行转录组测序和生物信息学分析,并采用q RT-PCR对转录组测序结果进行验证。结果表明,SCN和SCN_T共检测出1 628个差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),其中1 347个基因在SCN_T中上调表达,281个下调表达。对DEGs进行基因本体(Gene Ontology,GO)分析发现,被注释到分子功能的核糖体结构组成的DEGs数目最多,高达284个;其次是生物学进程的翻译过程,为211个;京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析表明,639个DEGs定位到277个代谢途径分支,其中参与到核糖体和氧化磷酸化途径的差异基因最多。另外,与线虫生长发育和寄生相关的代谢途径以及一些编码食道腺细胞分泌蛋白的DEGs同样被显著富集。q RT-PCR分析数据与转录组测序结果相关性较好(R~2=0.98),说明转录组测序数据可靠。本研究首次研究了不同致病力群体SCN和SCN_T在转录水平上的差异,为进一步解析SCN致病性差异形成的分子机制提供科学依据。     

基于iTRAQ技术的不同耐热性水稻花药差异蛋白分析

为从蛋白质水平揭示耐热与热敏感水稻花药响应高温胁迫的分子机制,本研究以耐热水稻品系996和热敏感水稻品系4628为材料,采用iTRAQ技术对高温和适温条件下水稻花药进行差异蛋白质组学分析。结果表明,在996高温-996适温、4628高温-4628适温、996高温-4628高温和996适温-4628适温4个比较组中,共筛选到957个差异表达蛋白,其中上调表达蛋白398个,覆盖率达20%以上的蛋白占鉴定总蛋白的50.96%。GO分析显示,抽穗开花期花药差异蛋白主要集中于代谢过程和细胞过程,在细胞组成方面主要分布于胞内部分、细胞器和细胞,分子功能主要涉及催化活性、绑定等。花药差异蛋白通路分析显示,来源于bZIP和DOF家族的2个转录因子差异表达,DOF家族基因上调,bZIP家族基因下调;18个HSPs基因中大部分表达上调;与植物激素和信号传导相关基因大部分表达下调;10个活性氧(ROS)相关基因中5个表现为上调;与次生代谢相关基因大部分下调。本研究结果为揭示水稻花药高温胁迫的应答分子调控机制提供了一定的理论基础。     

高羊茅FaGI基因在拟南芥中异源表达及蛋白互作分析

为探究高羊茅FaGI基因的生物学功能,本研究利用酵母双杂交、双分子荧光互补和免疫共沉淀探究与FaGI互作的蛋白;通过农杆菌介导法将过表达载体p1300-FaGI遗传转化拟南芥,获得转FaGI基因拟南芥株系,以拟南芥野生型Col-0、过表达FaGI基因株系和gi突变体为材料进行转录组学测序并观察其开花表型。结果表明,利用酵母双杂交方法筛选出与FaGI互作的FaCO蛋白,并通过双分子荧光互补和免疫共沉淀证明了FaGI和FaCO在体内和体外存在互作关系;过表达FaGI基因拟南芥植株的开花时间比野生型Col-0提前约1.24 d;将FaGI-OE、gi与野生型比对,分别筛选出1 963和92个差异表达基因（DEGs）,与野生型植株相比,过表达FaGI基因株系的差异基因富集在与生长发育、光周期途径、激素合成和信号传导、碳代谢等相关生物过程和代谢通路。综上,FaGI影响光周期途径相关基因的表达,在长日照条件下过表达FaGI基因促进了拟南芥开花,同时该基因的功能具有多样性与复杂性,可作为高羊茅调控分子育种的目标基因。本研究结果为揭示FaGI基因的功能及其调控网络奠定了基础。     

碱胁迫下榆叶梅差异基因表达分析

为了解榆叶梅(Prumus triloba Lindl.)在短期碱胁迫下的分子响应机制,本研究采用Illumina HiSeq^TM2500高通量测序技术对其在0、1、3、6、12 h碱胁迫下的叶片进行了de novo转录组测序,以此鉴定与碱胁迫相关的差异表达基因(DEGs)。结果表明,从5 960万条raw reads中获得了约5 300万条高质量clean reads,经从头组装后获得了124 786条榆叶梅unigenes。基于8 948个 unigenes差异表达(DEGs), GO富集分析发现,其中有28个基因可能在早期碱胁迫响应机制中起着重要作用; KEGG富集分析发现,不同碱处理时间下的KEGG途径(pathways)具有显著差异。对7个碱性胁迫反应相关基因进行RT-qPCR验证,所得基因的表达模式与RNA-Seq数据结果一致,证实了RNA-Seq结果的可靠性。本研究首次对碱胁迫下的榆叶梅叶片进行了转录组分析,获得的序列数据极大地丰富了榆叶梅可利用的基因资源,深入了解了榆叶梅碱胁迫的分子响应机制,同时为研究以榆叶梅为砧木的中国李(Prunus salicina)在碱胁迫下的适应机制奠定了分子研究基础。     

基于转录组金银花AP2基因家族的生物信息学及表达分析

为研究金银花AP2转录因子参与低温的应答机制,本研究基于低温下金银花转录组测序数据,利用在线生物信息学工具对金银花AP2转录因子的理化性质、亚细胞定位、磷酸化位点、蛋白基序以及进化分析进行鉴定和分析;利用实时荧光定量PCR检测3个DREB基因和1个RAV基因在低温胁迫下的表达情况。结果表明,在金银花中共筛选了34个AP2转录因子,不同转录因子之间的理化性质存在差异,表明其在不同的微环境中发挥不同的功能;亚细胞定位结果显示,仅有2个AP2定位于叶绿体,其余均定位于细胞核,符合其作为转录因子调控下游基因的表达特性;所有AP2的磷酸化位点均依次表现为丝氨酸>苏氨酸>酪氨酸;根据AP2中所含有的AP2数量以及序列同源性,可将34个AP2分为四个大类,20个AP2属于ERF亚家族,3个属于DREB亚家族,RAV亚家族仅有1个,其余10个属于AP2亚家族。实时荧光定量PCR检测结果表明,DREB和RAV基因均能响应低温胁迫,且不同低温处理时间的不同组织的表达量存在差异。本研究为阐明金银花AP2转录因子响应低温胁迫的机制奠定了一定的理论基础。     

干旱、高盐及低温胁迫下植物生理及转录因子的应答调控

干旱、高盐及低温等非生物胁迫是限制植物生长发育的主要环境因子。这些环境胁迫因子通常导致植物体内生理代谢改变,并参与非生物胁迫调控转录因子的差异表达。植物抵御上述非生物逆境的能力与转录因子调控逆境相关功能基因的表达密不可分。近年来,发掘植物非生物胁迫相关转录因子的功能及揭示转录因子介导植物非生物胁迫响应的调控机制,已成为植物营养分子生物学关注的热点之一。因此,了解植物非生物胁迫下的生理应答及转录因子参与的调控机制,对建立植物适应性改良途径具有重要科学意义。本文从干旱、高盐和低温三方面阐述了非生物胁迫下植物生理生化的适应性变化,概述了MYB、bZIP、AP2/EREBP、WRKY和NAC五类与植物抗逆相关的转录因子的结构与功能特征,着重论述了转录因子介导植物抵御非生物胁迫的分子调控机制。植物遭遇非生物胁迫时,通常表现为生长速率、叶面积和叶片数量下降,蒸腾及光合速率降低。同时,植物体内活性氧逐渐累积,使细胞膜脂过氧化程度加剧,造成细胞损伤。为适应不利环境,在生理上植物表现为体内抗氧化酶活性增强,渗透调节物数量增多;在分子水平上,植物对非生物胁迫适应性的增强,通常与转录因子识别抗逆基因启动子特异性元件及调控逆境防御基因的转录有关。本文对于深入阐明干旱、高盐及低温胁迫下植物生理生化应答与转录因子的分子调控机制提供了全新的科学启示。     

与甜瓜性别分化相关植物激素生物合成途径分析

甜瓜性别分化是由多因素构成的一个复杂的网络系统调控,受到多种环境因素及激素水平的影响。本研究利用甜瓜(Cucumis melo L.)WI 998×TopMark 构建重组自交系群体,通过第二代高通量测序技术对F2S6群体中雌雄异花同株及全雌系植株的转录组测序,比较差异表达基因,分析与性别差异表达相关的植物激素合成途径。结果显示,雌雄异花同株获得77376 条 Unigenes,平均长度为 435 bp;全雌系转录组测序获得 80 825 条 unigenes,平均长度为 509 bp。比较雌雄异花同株与全雌系转录组,发现共有 8966个基因差异表达,4 296 个基因下调,4 670 个基因上调。对差异基因进行基因本体论(GO)功能分类,发现2 352 条 Unigenes 归入到生物学过程,4 107 条 Unigenes 归入到细胞学过程,2 507 条 Unigenes 归入到分子功能。差异表达基因共参与 121 个 Pathway,发现赤霉素(gibberellin, GA)合成途径中 GA3 - 氧合成酶(GA3-ox)(MU3674)、GA7- 氧化酶(GA7-ox)(MU36987)、GA2- 氧化酶(GA2-ox)(MU13098/MU13099)、GA20-氧化酶(GA20-ox)和 GA2- 氧化酶(GA2-ox)(MU33020)等基因差异表达;共有 38 个基因在脱落酸(abscisicacid, ABA)合成途径中差异表达,其中 19 个上调,19 个下调;油菜素内酯(brassinolide, BR)合成途径中,MU22012 (cytochrome P450),MU26893 (cytochrome P450) 基因上调 ,MU56098 (cytochrome P450,CYP724B3),MU76596(CYP724A1)下调。本研究还发现参与甜瓜性别表达,分别与赤霉素、脱落酸、油菜素内酯及玉米素等多种激素合成、信号传导等代谢途径相关。研究结果为分析甜瓜决定性别分化的可能机理,为下一步研究甜瓜性别修饰基因的克隆,提供重要依据。     

基于Label-free组学研究南极磷虾油对脂代谢的影响

为了研究南极磷虾油对脂代谢的调节作用,利用非标记(Label-free)蛋白质定量技术,比较分析灌胃南极磷虾油对高脂模型小鼠肝脏蛋白的表达影响。结果表明,与模型组相比,灌胃磷虾油后,试验组和正常组中差异蛋白表达上调的分别有125个和109个,下调表达的分别有99个和95个。进一步分析脂代谢差异蛋白发现,在试验组和正常组中表达上调的分别是棕榈酰蛋白硫酯酶1 (PPT1)、载脂蛋白B100(APOB100)、短支链酰基辅酶A脱氢酶(ACADSB)、3-羟基酰基-CoA脱水酶3(HACD3)和磺基转移酶1A1(SULT1A1);表达下调的分别为酰基辅酶A合成酶中链家族成员3(ACSM3)和酰基辅酶A合成酶家族成员2(线粒体)(ACSF2)。结合脂代谢通路分析和蛋白质相互作用网络图进一步推测,ACADSB、ACSM3和ACSF2等蛋白质在南极磷虾油调节脂代谢中起着重要的调控作用。本研究结果为深入解析南极磷虾油的作用机理和调节脂代谢的分子机制提供了依据。     

小麦穗型突变体表型及其转录组分析

为了明确突变体小麦穗型变化的分子机制,对源自扬辐麦4号的穗型突变体sui1进行表型分析,并在不同的穗生长阶段（孕穗期T1、灌浆期T2）,对突变体sui1与野生型的穗轴节和穗下节进行转录组分析。结果发现,相较于野生型,突变体的穗轴节、穗下节长度变短,株高降低,赤霉病发病程度加重。转录组分析结果表明,相同时期穗下节差异表达基因多于穗轴节,相同组织孕穗期差异表达基因多于灌浆期,筛选出差异表达基因2 526个,其中上调基因890个,下调基因1 636个;对差异表达基因进行基因本体论（GO）分类发现,不同组织的分子功能注释基因在两个时期富集相同,大部分集中在三磷酸腺苷（ATP）结合上;差异表达基因京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析结果发现,植物-病原体互作通路富集基因最多,不同时期生物中的碳固定通路富集因子最高,不同组织光合作用-天线蛋白通路富集因子最高;对差异表达基因进行植物-病原体互作通路基因筛选,筛选出相关基因160个,其中防御反应基因63个（39%）,蛋白激酶活性基因21个（13%）,二磷酸腺苷（ADP）结合基因18个（11%）,推测这些基因可能对小麦突变体sui1穗轴节及穗型...     

用水稻基因芯片筛选小麦耐旱相关基因的研究

小麦耐旱机理的研究具有重要意义，为了了解小麦在干旱逆境条件下的基因转录规律，本研究采用PEG6000对耐旱小麦品种旱选10号进行拟旱处理，分别提取0、1、6和24小时植株的总RNA，经反转录荧光标记制备cDNA探针，并将其与水稻全基因组芯片进行杂交，扫描采集数据后并进行分析。结果表明，随着处理时间的延长，差异表达基因的数量增加，对差异基因进行功能分类，能量代谢途径相关基因所占比例随处理时间的延长而逐渐增加，大部分为光合作用相关基因，其总体表达趋势为上调，但Psbr和Rubisco编码基因的转录水平为下调,暗示它们在耐旱反应中发挥着一定作用。     

草菇菌丝体与原基差异表达基因分析

采用Solexa测序技术,对草菇菌丝体和原基进行了数字基因表达谱（DGE）测序,在菌丝体和原基文库中分别得到5701781个和5659262个高质量测序标签（cleantags）,对应的标签种数（distinct clean tags）分别为85626和95363。将所有高质量测序标签与参考基因库进行比对,在菌丝体和原基文库中,占标签种数的43.32%和52.57%的标签可以唯一定位（map）到参考序列上,占标签种数的21.65%和21.47%的标签可以被定位到基因组序列上。最终,被菌丝体和原基标签唯一定位的基因数（unambiguous tag-mapped genes）分别为14794和15534。差异基因分析显示,两个文库中共有显著性差异表达的基因4163个,其中在原基中上调、下调的基因数分别为2486和1677,只在原基中表达的基因321个。经过Blastnr比对,在原基中特异表达的基因,涉及蛋白质（氨基酸）合成与代谢、糖代谢、脂类代谢和抗逆反应等多个代谢途径。GO功能富集分析结果表明,葡萄糖、己糖和乙醇等代谢途径大部分基因下调表达。Pathway功能富集分析结果表明,合成核糖体蛋白的基因均下调表达,表明原基形成时细胞代谢减弱,蛋白质合成量减小。     

氮素敏感时期水稻分蘖芽的转录分析

  【目的】  氮素影响水稻分蘖芽的发育,从而影响水稻株型和产量。探究水稻分蘖芽在氮素敏感时期的基因表达情况,揭示氮素对水稻分蘖芽调控的可能途径。  【方法】  以水稻品种‘日本晴’为试验材料,萌发后用1/2MS培养基培养一周,之后用2.5 mmol/L的氮素溶液培养,待幼苗长至三叶期,进行0和2.5 mmol/L氮素溶液处理,培养至五叶期。对不同氮素浓度下分蘖芽的生长进行分析,确认水稻材料的氮素敏感时期,并于根茎结合处取样,提取RNA,进行氮素敏感时期水稻分蘖芽的转录组分析,包括差异表达基因的挖掘以及GO功能富集分析、KEGG通路分析、蛋白互作网络分析。  【结果】  缺氮条件下,水稻分蘖芽生长受到抑制,转录分析结果显示,不同供氮条件下842个基因存在显著的表达差异,其中586个基因缺氮时上调,256个基因缺氮时下调。GO功能富集分析发现绝大多数差异表达基因属于胞内 (cell)、胞内成分 (cell part) 和细胞器 (organelle) 的类别。在差异表达基因的KEGG通路分析中,植物激素信号传导途径是最显著富集的通路,氮代谢途径次之,说明植物激素通路和氮代谢通路在水稻分蘖芽的生长过程中具有重要作用。差异表达基因主要涉及生长素、细胞分裂素、脱落酸、水杨酸、茉莉酸等相关激素的合成代谢途径以及参与氮代谢的硝酸还原酶。蛋白互作分析推测硝酸还原酶可能会与植物激素相互作用。  【结论】  通过对氮素敏感时期水稻分蘖芽相关基因的转录分析,发现缺氮条件下,激素信号传导途径和氮代谢途径中相关基因的表达量均受到影响。其中,与硝酸还原酶和植物激素脱落酸合成相关的基因表达量上调,而影响分蘖芽生长的细胞分裂素和生长素基因表达均下调。     

猪肺泡巨噬细胞感染PRRSV进程中差异表达基因及基因功能富集分析

猪呼吸和繁殖综合症病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）感染猪后会引起妊娠母猪严重繁殖障碍和仔猪呼吸困难及高死亡率,给养猪产业造成了巨大经济损失,因此挖掘PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞进程中差异表达的基因及机理有重要意义。本研究对来自GEO数据库的PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞sage表达谱数据GSE10346进行后续挖掘。先用sage软件处理,经sagemap注释得到上调已知基因49个,下调已知基因41个。利用AgBase网站上的GORetriever工具和GOSlim Viewer工具进行细胞组分（cellular component）、分子功能（molecular function）及参与的生物过程（biological process）分类后发现有4个基因与病毒的复制相关：其中IL8已有报道认为与抗PRRSV相关;TNF-α能够抑制PRRSV复制;PPIA可能与GP5蛋白胞外区中和决定簇与抗体发生作用的24位脯氨酸有关;ICAM-1在嗜中性粒细胞的产生中起关键作用,与病毒吸附相关。这4个基因与PRRSV的致病机制相关,可望用于抗PRRSV研究。进一步利用David在线工具进行基因功能富集分析后,发现几个免疫通路,如趋化因子通路,Toll-like受体信号通路和NOD-like受体信号通路具有检验显著性,这些免疫通路在PRRSV感染过程中起着一定作用,有望成为抗PRRSV的靶通路。