百香果低温胁迫转录组及茉莉酸代谢基因分析

为研究百香果低温胁迫响应机制,以紫果百香果(Passiflora edulia Sims)为试验材料在0℃下低温胁迫处理,以常温处理为对照组(CK),采用Illumina HiSeq测序平台进行转录组测序,并对茉莉酸代谢相关基因进行挖掘。结果显示,共获得百香果转录组数据45.30 Gb,组装得到39 521条Unigene和5 311 个差异基因;GO分类显示注释的Unigene分为细胞组件、分子功能及生物过程三大类,其中差异基因数量最多为生物过程大类的代谢过程,包括甾醇生物合成、类黄酮糖脂化、酪氨酸代谢、L-苯丙氨酸生物合成、软木脂生物合成、芥子油苷代谢及长链脂肪-酰基辅酶A代谢等。KEGG途径富集分析结果显示,核糖体途径、淀粉与蔗糖代谢途径、植物激素信号转导途径及植物与病原体互作途径为百香果响应低温胁迫的重要代谢途径。实时定量PCR(qRT-PCR)分析表明,百香果低温胁迫后其茉莉酸代谢途径相关基因AOC、AOS、JAR1、MYC2、PYL和JAZ均上调表达,该结果与测序获得FPKM值变化趋势较为相似,说明测序结果较为准确。但低温胁迫后,COI1的表达水平呈下调趋势。研究发现,在百香果中茉莉酸对低温胁迫的响应机制大体上与模式植物一致,关于COI1和MYC2等基因的调控方式还有待进一步功能验证。本研究结果为进一步明确百香果抗寒机制提供了科学参考。     

温度胁迫对幼体大海马基因转录表达的影响

为探究大海马幼体在高温和低温胁迫条件下基因表达水平的变化规律,采用Illumina平台的PE150测序功能对大海马幼体肝脏进行了转录组测序。对照组、高温胁迫组和低温胁迫组测序数据组装后获得22 513个单基因簇(Unigene),N50为2 223 bp,平均长度为1 122.71 bp。与对照组相比,高温胁迫组共获得14 009个差异表达基因,其中5 543个差异表达基因上调,8 466个差异表达基因下调;低温胁迫组共获得20 030个差异基因,14 016个差异表达基因上调,6 014个差异表达基因下调。差异表达基因经KEGG数据库富集发现,高/低温胁迫均导致大海马体内抗氧化途径相关基因表达(HSP70、HSP90、SOD等)发生显著改变;另外,高温胁迫还造成大海马免疫系统相关基因(PIK3R、Akt、IL-10、TLR等)以及细胞凋亡相关基因(CYCS、CASP9、CASP3等)表达显著改变;低温胁迫造成DNA损伤修复(MSH、DDB2、XRCC2、RAD52、Ogg1、PMS2等)、脂肪酸代谢(StARD7、ApoA4、CYP51、Fadsd6等)和细胞凋亡(P21、P53、BAX等)相关基因显著上调。选择HSP70、Fadsd 6与IL-10等13个差异基因验证,RT-qPCR结果与RNA-Seq测序结果基本一致。本研究结果为深入探究大海马温度应激的调控机制奠定了一定的理论基础,而且有助于预防极端温度对大海马造成损伤。     

大麦白化颖壳突变体的转录组学分析

为了探究大麦白化颖壳突变体形成机理,以白化颖壳突变体(AL)和野生型植株(WT)为试验材料,对2份材料抽穗期的颖壳进行转录组测序分析,通过Illumina Hi SeqTM2500高通量转录组测序技术分别从WT和AL中获得2.7 Gb和4.1 Gb有效数据,拼接组装后得到64 634条通用基因(unigenes),其中长度大于1 kb的有23 696条。通过对2份材料间差异基因的筛选,共得到672个差异表达基因(DEGs),其中139个上调表达,533个下调表达。GO功能富集分析发现,在分子功能类型中注释的差异基因主要与叶绿体相关;KEGG显著富集分析发现差异基因广泛涉及碳代谢、光合作用等调控途径。对其中6个相关基因进行了RT-qPCR验证,表达趋势与RNA-Seq测序结果一致。表明AL的形成可能是由于叶绿体形成和发育相关基因的表达受到抑制,进一步导致了光合作用的下降,该研究结果对深入探究大麦的白化形成机理具有重要的参考价值。     

春兰与大花蕙兰杂交种红花呈色机理初探

为探究兰属杂交种红花的呈色机理,选择绿花春兰和黄花大花蕙兰的红花杂交种黄金梅为试验材料,通过小花蕾期和始花期花瓣的转录组测序分析,筛选影响花色的关键结构基因及调节基因,实时荧光定量PCR(qPCR)验证基因的差异表达,分光光度计法检测花瓣色素(类黄酮、叶绿素A、叶绿素B、花青苷)的含量。结果表明,通过测序共获得113 780条单基因(Unigene),其中200~300 bp的Unigene占比42.68%;44 088 个Unigene获得注释信息;与小花蕾期花瓣比较,始花期花瓣上调基因有1 855个,下调基因有2 494 个;差异表达基因(DEGs)被GO数据库注释划分为47个功能组;1 219个DEGs被KEGG数据库注释,涉及166条代谢途径;根据KEGG代谢通路及基因注释结果,筛选出与花色相关的54个关键结构基因和21个转录因子;花青苷合成基因DFR、ANS、3,5GT及转录因子Zm1、Hv1、MYB305表达量在始花期上调, 在NCBI库BLAST同源基因发现黄金梅DFR、ANS、3GT基因与大花蕙兰的基因同源性最高,5,3GT、3,5GT、Zm1基因与蝴蝶兰和石斛兰的基因同源性最高,转录因子Hv1、MYB305与建兰的基因同源性最高。qPCR参试基因表达量变化与转录组测序结果趋势一致。各阶段花瓣总黄酮的含量显著高于类胡萝卜素和叶绿素含量;始花期花瓣中花青苷含量升高。本研究结果为兰属杂交种花色基因的功能分析提供了参考。     

转GhB301基因棉花响应枯萎病菌侵染的转录组分析

乙烯响应因子(ethylene responsive factor, ERF)可以激活或者抑制下游病程相关蛋白基因的表达,在植物抗病信号转导途径中发挥着重要作用。为探究ERF-B3亚组基因GhB301在棉花抗枯萎病中的分子调控机制,本研究利用已获得的转GhB301基因棉花株系,通过孢子悬浮液蘸根的方法对转GhB301基因棉花株系(N)和野生型对照(WT)进行接菌处理,抗病性鉴定结果表明,过表达GhB301的N株系增强了对枯萎病的抗病性,其病情指数为14.77,显著低于WT(病情指数为37.50);枯萎病菌侵染0、6、12、24、48 h后,利用RNA-seq技术对N和WT的根部组织进行测序分析,共得到273 111 170个clean reads,其Q30均大于87.64%,将clean reads与陆地棉参考基因组TM-1比对,获得了14 021个差异表达基因(DEGs)。与WT相比,转基因株系能够在病原菌侵染后更快速地做出响应。GO及KEGG富集分析发现共有135个DEGs参与氧化还原过程,67个DEGs参与防御反应,31个DEGs参与苯丙烷类生物合成,推测这些DEGs可能与转基因棉花的枯萎病抗性增强存在密切关系。本研究结果为阐明GhB301基因响应棉花枯萎病菌侵染规律奠定了基础。     

盐胁迫下双峰驼结肠组织环境适应能力研究

我国北方中西部畜牧地区的水源多为高含盐量水源,普通家畜不能适应这样的水源,从而影响了北方地区畜牧业的发展。双峰驼(Camelidae bactrianus)作为适应北方高盐水源的物种,其盐适应机制尚不清楚。本研究针对双峰驼盐适应能力,对大量进食食盐与正常条件下双峰驼的结肠组织进行转录组测序及数据分析,从转录组学角度了解大量进盐环境下骆驼结肠组织对盐环境的适应机制。结果显示,进盐组测得reads 52 882 246条,对照组测得51 533 346条;进盐组reads总比对率为86.41%,唯一比对率为84.61%;对照组总比对率为92.48%,唯一比对率为91.62%;进盐组与对照组共获得差异表达基因2 450个,其中上调表达基因1 136个,下调表达基因1 314个。基因本体(Gene Ontology, GO)分析显示,进盐组下调表达基因显著富集的term共17条,上调表达基因显著富集的term共28条。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析显示,下调表达基因显著富集到的包括剪接体、RNA转运、基础转录因子、真核生物中核糖体的生物合成、RNA降解、氧化磷酸化和蛋白输出功能通路。上述结果表明,在盐胁迫条件下,结肠组织下调表达的基因多于上调表达基因,具有统计意义的生物功能分析显示,下调表达基因多参与RNA过程和蛋白质合成通路。这些基因有利于骆驼在高盐环境下减少RNA的合成,降低结肠组织的代谢速率。本研究对区域特色畜牧品种的盐适应机制进行解析,为高含盐水源畜牧地区育种、提高区域资源利用率提供分子理论依据。     

菜心BrAGL24基因mRNA在嫁接体中的长距离运输分析

为研究结球甘蓝/菜心嫁接体中开花调控基因的mRNA是否从砧木向接穗进行了运输,本试验以参与开花调控的菜心AGL24基因为研究对象,构建结球甘蓝菜心异源嫁接体,并从接穗结球甘蓝中鉴定菜心AGL24的序列。结果表明,利用结球甘蓝和菜心的转录组测序数据,拼接获得了结球甘蓝和菜心的AGL24基因序列(BoAGL24和BrAGL24)。利用菜心BrAGL24基因中的种间差异序列(C1~C7),在异源嫁接(结球甘蓝/菜心嫁接)的接穗结球甘蓝茎尖的转录组测序文库(T2)中筛选得到2条来自砧木菜心BrAGL24的reads。利用结球甘蓝BoAGL24的种间差异序列(G1~G7),分析结球甘蓝内源BoAGL24基因的转录表达量,发现异源嫁接的结球甘蓝茎尖中AGL24的表达量总体上高于同源嫁接的结球甘蓝茎尖中AGL24的表达量。异源嫁接使砧木菜心BrAGL24基因的mRNA运输到接穗结球甘蓝中,且增加了接穗结球甘蓝茎尖中内源BoAGL24基因的转录表达水平。本研究鉴定了菜心BrAGL24基因的mRNA运输特性,为进一步研究AGL24基因的mRNA运输与结球甘蓝/菜心嫁接启动接穗结球甘蓝开花机制奠定了一定的理论基础。     

月季MYB转录因子基因RcWER-like的克隆及表达分析

MYB转录因子在植物响应盐胁迫过程中起着重要的调控作用。为明确MYB类转录因子RcWER-like生物学功能,本研究以月季月月粉为材料,利用生物信息学分析及实时荧光定量PCR技术研究RcWER-like基因在盐处理、激素处理、盐与激素综合处理下不同组织不同时间点的表达特性。结果表明,依据转录组测序获得的序列信息和月季全基因组信息克隆得到了RcWER-like,该基因全长为882 bp,开放阅读框(ORF)为669 bp,编码223个氨基酸。序列比对发现,RcWER-like在N端具有保守的R2R3-MYB结构域。系统进化树分析结果显示,RcWER-like与桃PpWER-like、梅花PmWER-like、苹果MdWER-like处于同一分支,属于R2R3-MYB类转录因子。实时荧光定量PCR结果表明,RcWER-like基因在盐胁迫处理24 h后表达明显上调,且外施水杨酸和茉莉酸甲酯均可诱导RcWER-like的表达;在盐胁迫下,外施水杨酸和茉莉酸甲酯可诱导RcWER-like的表达,且均高于单独盐或激素处理。此外,月季RcWER-like在盐处理、激素处理、盐与激素综合处理下不同组织不同时间点的表达模式存在显著差异,R2R3-MYB类转录因子RcWER-like参与了月季盐胁迫响应和对水杨酸和茉莉酸甲酯的应答过程,可能在月季高盐胁迫应答中具有重要的作用。本研究结果为月季耐盐分子育种提供了候选基因资源和理论依据。     

低温胁迫下苦瓜叶片转录组差异基因分析及生理响应特征

苦瓜在生长季节遇到低温会影响其生长发育和产量,限制了种植分布区域。为了研究苦瓜耐寒性的分子机制,本研究以苦瓜自交系43为试验材料,在8℃低温胁迫处理后观察其表型并测定相关生理生化指标,再利用转录组测序技术从生理角度结合分子水平对苦瓜低温胁迫机制进行生物信息学分析。结果表明,在8℃低温胁迫下,苦瓜表现出耐低温适应性,在低温胁迫下丙二醛(MDA)含量、脯氨酸含量及电解质渗透率均呈现显著变化。分析了低温胁迫0和12 h后的转录组变化,结果发现低温胁迫处理后有916个基因上调,369个基因下调。对差异表达基因进行通路注释分析,发现大量与低温胁迫相关的代谢途径。进一步筛选到10个在其他物种报道过可能与冷胁迫相关的基因,包括MYB、WRKY以及NAC转录因子等。对植物耐低温相关的候选基因进行了实时荧光定量PCR(qRT-PCR)表达谱分析,结果与生理表型变化相吻合,同时进一步证实了RNA-seq数据的准确性。本研究基于全基因组水平分析苦瓜在低温胁迫下的转录组变化,以及耐低温相关基因动态变化和生理反应的分子机制,为揭示苦瓜中的耐寒性机理和筛选遗传改良候选基因提供了一定基础。     

西瓜CGMMV胁迫下MIR319家族成员及靶基因的鉴定分析

为明确MIR319家族成员(miR319、miR319a及miR319a-3p)在黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)胁迫应答中的作用,本研究将MIR319的成熟序列与西瓜基因组进行Blast比对获得其前体基因,利用MEGA对前体基因进行系统进化分析,PlantCARE对前体基因启动子区的顺式作用元件进行分析,降解组测序对MIR319的靶基因进行分析,转录组测序及qRT-PCR分析MIR319靶基因的表达模式。研究结果获得MIR319家族成员共同前体基因Pre-MIR319,其长度为170 bp,含有完整的茎环结构;序列比对显示,MIR319家族成熟序列在5'端第2~第14位碱基高度保守;西瓜Pre-MIR319与35个物种的116条miR319前体序列经系统进化分析后分为四个分支,其中西瓜Pre-MIR319与马铃薯miR319a前体基因(MI0025952)距离最近;Pre-MIR319启动子区含有光响应元件、赤霉素响应元件、乙烯响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、MYB和MYC等多个顺式作用元件;降解组测序获得MIR319家族成员的5个靶基因,其中Cla019567、Cla013523、Cla023342和Cla002428注释为TCP转录因子,Cla013668注释为MYB转录因子,剪切位点位于MIR319家族成员成熟序列5'端的第10位碱基;靶基因编码氨基酸数目为319~554 aa、分子量为34.94~61.21 kDa、理论等电点为5.29~7.80,定位于细胞核/细胞质中,均不含跨膜结构域;转录组测序及qRT-PCR分析表明miR319a负调控靶基因Cla013523(TCP)的表达。本研究结果进一步明确了MIR319家族成员在CGMMV胁迫应答中的作用及其对靶基因的调控作用。     

三角褐指藻GPAT生物信息学及表达差异分析

三羧酸甘油酯(TAG)是植物细胞中油脂的主要储存形式,甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)是TAG生物合成过程中的第1个限速酶。为探明三角褐指藻油脂含量变化与GPAT基因表达量之间的关系,本研究利用转录组测序结果设计引物,采用RT-PCR技术克隆了三角褐指藻GPAT的cDNA全长,并对其进行生物信息学分析;通过RT- qPCR研究不同光照强度和温度下三角褐指藻GPAT的表达差异及总脂含量。结果表明,三角褐指藻GPAT的cDNA全长序列为1 743 bp,含有1个长度为1 305 bp的ORF,编码434个氨基酸,含有3个保守序列区。保守结构域分析表明, 三角褐指藻GPAT属于LPLATs超家族,且具有GPAT特征性的酰基结合位点。系统进化分析表明,三角褐指藻GPAT与大洋洲海链藻的亲缘关系最近。RT- qPCR结果显示,随着光照强度和温度的提高,三角褐指藻GPAT表达量均呈先上升后下降的趋势,且在25℃、37.5 μmol·m^-2·s^-1时达到最大值,与藻体内总脂含量变化趋势一致;此外,GPAT表达量与总脂含量随着温度的变化呈显著正相关(r=0.980, P<0.05),推测三角褐指藻GPAT可能是三角褐指藻脂类代谢途径的关键基因。本研究为今后利用基因工程手段提高植物体内油脂含量提供了优质的基因资源,同时为进一步揭示三角褐指藻脂类物质合成的分子调控机制奠定了一定的理论基础。     

2种雀稗属牧草对低磷胁迫的生长、生理应激响应

为比较宽叶雀稗(Paspalum wettsteinii)和巴哈雀稗(Paspalum notatum)适应低磷胁迫的能力,揭示其对低磷胁迫的形态及生理响应机理,试验以石英砂为基质,定期浇灌200 μmol·L^-1(常磷)、20 μmol·L^-1、 2 μmol·L^-1的Hoagland营养液模拟低磷胁迫处理,分别在磷处理10、20、30 d时测定供试材料的幼苗形态及生理特性。结果表明,低磷处理30 d时,2种雀稗属牧草地上部生物量、株高、叶面积、叶长呈降低趋势,根干重、根冠比、总根长、根尖数、根毛数量较常磷处理增加,超氧化物歧化酶(SOD)(除巴哈雀稗)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)活性较常磷处理显著增加(P<0.05),根部电导率、叶片电导率较常磷处理显著提高(P<0.05)。当磷水平降低至2 μmol·L^-1时,宽叶雀稗地上部生物量降幅最大,为41.67%,根冠比、SOD活性增幅最大,分别为86.36%、113.19%;巴哈雀稗叶长降幅最大,为90.43%,根冠比、根毛数量增幅最大,分别为108.47%和74.91%。综上,低磷胁迫抑制了2种雀稗属牧草地上部的生长,促进了地下部的生长,提高了保护酶活性,且宽叶雀稗的低磷适应能力高于巴哈雀稗。本研究为2种雀稗属牧草在低磷环境下的栽培提供了理论依据。     

武夷红樱分类地位的修订

为了重新确定武夷红樱的分类地位,以16个野生樱属种为材料,利用SSR分子标记技术进行聚类分析,结合形态观测和DNA条形码分子鉴定技术进行辅助分类学研究。为了获得3个种间的亲缘关系,利用4个叶绿体基因序列(trnH-psbA、rpl32-trnL、petA-psbJ和trnL-trnF)进行DNA条形码分析,结果表明,武夷红樱(PcW1和PcW2)与华中樱4个基因序列差异明显,小于与钟花樱之间的差异。其中,武夷红樱(PcW2)的trnH-psbA和rpl32-trnL序列与华中樱完全一致,尤其是trnL-trnF序列,武夷红樱与华中樱仅有3个位点差异,而与钟花樱有75(77)个位点差异。基于trnH-psbA+rpl32-trnL+petA-psbJ+trnL-trnF构建的进化树表明,武夷红樱与华中樱聚在一起,而与钟花樱关系较远。结合SSR和形态观测结果,确定武夷红樱为华中樱与钟花樱的杂交种。由于叶绿体基因呈母系遗传,可确定华中樱为母本,钟花樱为父本。本试验利用分子生物学、遗传学结合形态观测的方法,确立了武夷红樱新的分类地位,武夷红樱形态上虽与钟花樱较为相似,但基因水平上却与华中樱更为接近,因此,建议将武夷红樱由钟花樱下的一个变种升级为一个独立的种。此外,本试验方法也可为其他樱属植物的分类学修订、新种的发现以及为新品种的选育提供重要的参考。     

氮元素对三角褐指藻岩藻黄素和油脂合成关键酶基因表达与代谢合成的影响

为阐明氮元素对微藻次生代谢积累和调控的影响,以三角褐指藻为试验材料,研究不同氮浓度[896(CK)、448、112、28和0 μmol·L^-1]处理对三角褐指藻细胞生长、岩藻黄素含量、油脂含量以及叶绿素a含量的影响,并对岩藻黄素-叶绿素蛋白复合体基因(FCPb)和酰基-酰基载体蛋白去饱和酶基因(FAB2)的表达进行实时荧光定量PCR分析。结果表明,氮限制极显著抑制了三角褐指藻细胞的生长和岩藻黄素的合成,但促进了油脂的合成。当氮浓度为112 μmol·L^-1时,三角褐指藻岩藻黄素含量最低(0.084 mg·g^-1DW),而油脂含量最高,较CK提高了1.36倍。叶绿素a与岩藻黄素含量变化趋势一致。相关性分析表明,氮限制条件下,三角褐指藻岩藻黄素含量与油脂含量显著相关(R²=0.998 8)。实时荧光定量PCR分析表明,氮限制抑制了三角褐指藻中FCPb的表达,促进了FAB2的表达。综上,氮限制通过调控三角褐指藻岩藻黄素、油脂生物合成途径相关基因的表达影响了岩藻黄素和油脂的积累。本研究为进一步探究岩藻黄素与脂类物质代谢合成的关联性提供了一定的理论参考。     

4种梨实生苗硝态氮和铵态氮利用特性研究

为探讨不同梨实生苗对硝态氮和铵态氮的利用特性,以一年生杜梨、豆梨、川梨、木梨为试验材料,采用¹⁵NH₄NO₃和$NH_{4}^{15}$NO₃分别标记的方法,研究不同氮素形态对4种梨实生苗生长发育、根系形态及氮素吸收的影响。结果表明,木梨的地上部干重和总干重均最大,分别为20.56和29.21 g,其次是川梨和豆梨,杜梨最小。川梨根系干重最大,为8.80 g,其次是木梨,二者均显著高于豆梨和杜梨。根系总表面积、总根长、根尖数均以川梨最大,杜梨最小;根系活力以木梨最大,为2.04 mg·g^-1·h^-1,杜梨最小。4种实生苗标记硝态氮处理各器官吸收分配到的¹⁵N量对该器官全氮量的贡献(Ndff)均高于标记铵态氮处理;不管是标记硝态氮还是铵态氮,¹⁵N分配率均以叶最高,其次是根和茎。4种实生苗对硝态氮的利用率均高于铵态氮,其中木梨对硝态氮的利用率最高,为16.37%,且显著高于其他3种实生苗;川梨对铵态氮的利用率最高,为7.92%,但与木梨差异不显著,显著高于杜梨和豆梨。本研究为不同梨实生苗的氮素吸收特性和氮素营养管理的深入研究提供了科学依据。     

高温胁迫下坛紫菜中红藻糖苷及其异构体的含量变化

为了解热激应答下坛紫菜中红藻糖苷和异红藻糖苷含量的变化,以及两者与坛紫菜高温耐受性之间的联系,以ME-05坛紫菜为样品,采用高效液相色谱三重四级杆质谱联用技术(HPLC-MS)分析35℃高温胁迫和20℃恢复培养条件下,坛紫菜中红藻糖苷及其异构体含量的变化趋势,通过两者的含量波动,探讨其与坛紫菜耐受性之间的关系。结果表明,相同品种、相同日龄但生长地点不同的坛紫菜中,红藻糖苷含量稳定;不同生长阶段的坛紫菜经35℃高温胁迫后,红藻糖苷和异红藻糖苷含量减少,经恢复培养3 h后发现红藻糖苷和异红藻糖苷含量逐渐回升并超过对照组;红藻糖苷和异红藻糖苷的变化率为:Ⅲ组(生长期第75天)>Ⅳ组(生长期第135天)>Ⅱ组(生长期第45天)>Ⅰ组(丝状体),红藻糖苷的变化更为敏感且具有规律。综上,红藻糖苷与坛紫菜的生长状况和抗逆能力相关,可作为紫菜选育的指标物。本研究结果为进一步探讨坛紫菜在高温胁迫下的生理响应及健康养殖奠定了理论基础。