改变天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶调控活性提高玉米中游离赖氨酸含量

以烟草(Nicotiana tabacum var．samsum)叶片为材料，提取RNA，分离mRNA，进行RT-PCR扩增编码二氢吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)的cDNA片段。序列分析表明，得到971个核苷酸的片段。与发表的序列相比，成熟蛋白N-端编码区缺失了21个核苷酸，且第627位核苷酸发生了C到T的改变，但没有引起氨基酸的变化。将ahaps cDNA编码区的第410和411位核苷酸由AC突变为TT，这一突变使DHDPS成熟蛋白的第104位氨基酸由天冬酰胺变为异亮氨酸。以玉米(Zea mays L．)总DNA为模板，PCR扩增DHDPS叶绿体转运肽的编码序列，序列分析结果显示，扩增片段中含有DHDPS转运肽完整编码区162个核苷酸及成熟蛋白N-端编码区21个核苷酸。将突变后的础(天冬氨酸激酶)基因和dhdps cDNA与CaMV35S启动子、转运肽序列及潮霉素抗性基因连接，构建表达载体pRHAK和pRHDH，用基因枪轰击法将pRHAK和pRTDH转入玉米胚性愈伤组织，得到再生植株。经分子检测证明，目的片段已整合到玉米基因组中。T1代植株的游离氨基酸含量测定显示，部分转入础基因的植株中，叶片和种子中游离苏氨酸的含量提高3～5倍。部分转入dhdps cDNA的植株中，叶片和种子中游离赖氨酸含量分别提高了4倍和1倍。     

玉米尿卟啉原Ⅲ脱羧酶同功酶生物信息学分析、基因克隆和原核表达

尿卟啉原Ⅲ脱羧酶是生物卟啉类化合物分支合成的关键酶。从GenBank中搜寻到4种玉米尿卟啉原Ⅲ脱羧酶：Les22、UROD1、UROD2和截短UROD,氨基酸序列比对显示N端的同源性较差;玉米les22基因比urod1基因在开放阅读框的上游少3个碱基,导致阅读框移码。植物除玉米外存在高度同源的UROD1和UROD2,具有结构完整性。本文以玉米幼叶总RNA为模板,通过RT-PCR克隆了玉米les22和urod2基因,并对突变位点进行校正,同时通过定点突变获得urod1基因,它们都编码去除叶绿体导肽的尿卟啉原Ⅲ脱羧酶。再分别将les22、urod2和urod1基因插入大肠杆菌的不同表达载体,转化表达菌株BL21（DE3）,16℃诱导表达18h,SDS-PAGE分析显示,Les22的N端含有组氨酸标签或SUMO蛋白,重组蛋白表达为包涵体,UROD2的N端含有组氨酸标签或SUMO、TRX、GST或MBP蛋白,未检测到目的蛋白在上清液的特异表达,而UROD1和MBP融合为可溶性表达,表明玉米UROD的N端氨基酸残基可能参与蛋白在大肠杆菌的折叠。这为研究玉米UROD的种类和功能奠定基础。     

嗜水气单胞菌aer毒素基因的克隆及核苷酸序列分析

以自行分离的嗜水单胞菌分离株AHCS02为研究对象,分析其产生的aer毒素基因结构.根据GenBank中aer毒素的基因序列（M16495）,设计扩增编码aer毒素成熟蛋白基因的引物,以AHCS02的基因组DNA为模板,PCR扩增出长度为1 332 bp的核苷酸片段,进行pMD18-T载体克隆.酶切鉴定后进行序列测定和分析,结果表明扩增的片段与M16495的同源性达92%,将测得的序列登录GenBank数据库,所得的序列编号为AY136943.分析推导其核苷酸编码的氨基酸序列显示：其编码443个氨基酸,为aer毒素成熟蛋白的基因,与M16495相比,氨基酸差异主要集中在422氨基酸残基至436氨基酸残基的位置上,在这个位置上共有8个氨基酸残基发生变化,其中在435和437氨基酸残基之间有一个氨基酸密码子丢失,氨基酸的同源性达95.5%.证明aer毒素基因的5＇端保守,3＇端变异较大.     

家蚕消化液35K蛋白酶基因的克隆及序列同源性分析

根据纯化的家蚕35K蛋白酶N末端氨基酸序列设计简并引物，从家蚕中肠组织cDNA库中分离并克隆该蛋白酶基因,对由DNA推测的氨基酸序列进行同源性检索。结果表明：存在于家蚕消化液中的35K蛋白酶基因长939bp，可编码313残基的多肽链，其中信息肽为22aa，活性肽为22aa，成熟的蛋白酶由269aa组成。与其他昆虫消化液的类胰凝乳蛋白酶具有同源性，是存在于家蚕消化液中的一种新发现的蛋白酶。     

加州鲈卵泡抑素cDNA的克隆、分析和原核表达

卵泡抑素是TGF-β超家族中一些成员的抑制蛋白，具有促肌肉生长的作用。采用RT-PCR和RACE技术从加州鲈成鱼卵巢总RNA中扩增得到卵泡抑素cDNA，序列分析结果表明，加州鲈卵泡抑素cDNA全长1444bp，包括开放阅读框966bp，5¢非编码区82bp，3¢非编码区359bp。该基因编码321个氨基酸，其中信号肽31个氨基酸，成熟肽290个氨基酸，成熟蛋白由四个功能区组成，分别为：N-domain、Domain Ⅰ、Domain Ⅱ和Domain Ⅲ，其中N-domain具有与TGF-β超家族中一些成员特异性结合的结构，可抑制这些蛋白发挥作用。将加州鲈卵泡抑素氨基酸序列与红鳍东方鲀、草鱼、斑马鱼、大西洋鲑和斑点叉尾鮰比较，同源性分别为97％、89％、88％、88％和70％，其中N-domain氨基酸序列的保守性更高一些，与红鳍东方鲀、草鱼、斑马鱼、大西洋鲑、斑点叉尾鮰、非洲爪蟾、人、猪、大鼠、鸡的相比较，同源性为75%～100％。为获得重组卵泡抑素蛋白，将成熟肽cDNA插入表达载体pET-32a(+)，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，SDS-PAGE检测，结果检测到一分子量约52kD的特异蛋白带，与预期大小一致，Western blot检测到表达产物表明成功获得了卵泡抑素的融合蛋白。加州鲈卵泡抑素cDNA序列和重组蛋白的获得为进一步研究鱼类卵泡抑素的促肌肉生长奠定了基础。     

利用噬菌体随机肽库筛选NDV单克隆抗体识别的抗原表位

为了获得新城疫病毒（NDV）HN蛋白单克隆抗体1E5识别的抗原位点, 以NDV LaSota株HN蛋白的单克隆抗体（mAb）1E5为靶分子,采用噬菌体随机7肽库进行亲和筛选,并用间接ELISA和竞争ELISA鉴定阳性克隆。最终得到4组可用的7肽序列,同源性分析表明展示肽序列与HN蛋白的388~395氨基酸具有较高的同源性,所以它们的共有序列L * * * PNT是抗原表位的骨架结构。这个表位的位置与以往的文献报道不同,它很可能是新城疫病毒HN蛋白的另一个重要的抗原位点。     

黄颡鱼抗菌肽hepcidin基因的克隆和表达分析

用RT-PCR方法,从黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）肝脏中克隆获得了hepcidin cDNA序列,并对其进行序列测定,在此基础上分析了hepcidin基因在不同组织中的表达差异和不同细菌感染后对其表达的影响。结果表明,黄颡鱼hepcidin的cDNA片段（GenBank登陆号EU257703）长为282bp,编码93个氨基酸,由信号肽(23个氨基酸)、前肽（45个氨基酸）和成熟肽（25个氨基酸）组成,成熟肽含有8个保守的半胱氨酸（cys）残基,可形成4个链内二硫键。与已报道的其他鲶形目鱼类hepcidin核苷酸序列的同源性为80-82%,推导的氨基酸序列的同源性为69-71%。RT-PCR半定量分析显示黄颡鱼hepcidin基因在不同组织中普遍表达,其中肝脏表达水平最高,头肾、肠道、肌肉、脑、胃、鳃、心脏、卵巢表达次之,皮肤、脾脏、肾脏表达较低。感染嗜水单胞菌和腊样芽孢杆菌的黄颡鱼,肝脏hepcidin mRNA水平显著升高。     

团头鲂和广东鲂生长激素cDAN的分子克隆和序列分析

从团头鲂（Megalobrama amblycephala）和广东鲂（Megalobrama hoffmanni）的脑垂体组织提取总RNA,采用3′－RACE－PCR的方法,从中扩增出编码两种鲂生长激素（growth hormone,GH）成熟肽的cDNA序列,克隆到pGEM-T Easy Vector载体上。克隆的团头鲂和广东鲂GHcDNA均包括编码188个氨基酸残基的GH成熟肽序列和3′端的非翻译区,但不含信号肽序列和5′端非编码区。序列分析结果表明,团头鲂和广东鲂GH的碱基序列和推测的氨基酸序列的同源性分别为99％和100％。     

广西巴马小型猪肥胖基因（leptin）成熟肽序列的cDNA克隆、序列分析

以广西巴马小型猪的脂肪组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增出巴马小型猪的leptin基因成熟肽序列,经纯化回收后连接到pMD18-T载体上,经鉴定后测序。研究结果表明,本试验克隆到leptin基因成熟肽cDNA序列,其长度为441bp,与GenBank中报道的猪leptin成熟肽cDNA序列同源性高达99．06％,与奶牛、家鼠、马等物种的成熟肽cDNA序列间同源性可达到84．5％以上,证明leptin基因具有较高的保守性。同时发现,与普通猪相比,巴马小型猪leptin基因成熟肽cDNA序列有四处存在碱基突变,均为元义突变。     

陆地棉巯基蛋白酶抑制剂基因克隆及其氨基酸序列分析

通过对植物中已知巯基蛋白酶抑制剂(cystatin)的保守性分析,设计1对简并引物,从陆地棉栽培种中棉所29(GossypiumhirsutumL.cv.Zhongmiansuo29)cDNA中克隆出1条巯基蛋白酶抑制剂基因片断,经测序和对测序结果在有关数据库中检索分析,发现该片段与1条中棉(G.arboreumL.)EST及1条雷蒙德氏棉(G.raimondiiL.)cDNA同源性高达96%。三者编码蛋白的氨基酸同源性达100%,且完全符合CPI的特征;所克隆基因片段的氨基酸序列与NBCI蛋白质数据库中登录的豇豆、向日葵、玉米、水稻中CPI均有高度同源性,表明该片段包含编码陆地棉CPI的完整序列。     

Vacuolar invertases in sweet potato: molecular cloning, characterization, and analysis of gene expression

Two cDNAs (Ib beta fruct2 and Ib beta fruct3) encoding vacuolar invertases were cloned from sweet potato leaves, expressed in Pichia pastoris, and the recombinant proteins were purified by ammonium sulfate fractionation and chromatography on Ni-NTA agarose. The deduced amino acid sequences encoded by the cDNAs contained characteristic conserved elements of vacuolar invertases, including the sequence R[G/A/P]xxxGVS[E/D/M]K[S/T/A/R], located in the prepeptide region, Wxxx[M/I/V]LxWQ, located around the starting site of the mature protein, and an intact beta-fructosidase motif. The pH optimum, the substrate specificity, and the apparent K(m) values for sucrose exhibited by the recombinant proteins were similar to those of vacuolar invertases purified from sweet potato leaves and cell suspensions, thus confirming that the proteins encoded by Ib beta fruct2 and Ib beta fruct3 are vacuolar invertases. Moreover, northern analysis revealed that the expression of the two genes was differentially regulated. With the exception of mature leaves and sprouting storage roots, Ib beta fruct2 mRNA is widely expressed among the tissues of the sweet potato and is more abundant in young sink tissues. By contrast, Ib beta fruct3 mRNA was only detected in shoots and in young and mature leaves. It appears, therefore, that these two vacuolar invertases play different physiological roles during the development of the sweet potato plant.     

大气CO2浓度升高对绿豆生长发育与产量的影响

研究大气CO2浓度升高对绿豆影响,有助于人们了解未来气候变化后绿豆生产的变化,以提前采取必要的应对措施趋利避害.本研究利用FACE(Free Air CO2 Enrichment)系统在大田条件进行了绿豆生长发育及产量受CO2浓度升高影响的试验.结果表明:大气CO,浓度升高后,绿豆叶面积、株高、节数、茎粗增加;倒数第一...     

Lipid-based Fe- and Zn- nanoformulation is more effective in alleviating Fe- and Zn- deficiency in maize

Improving uptake, translocation, and utilization of foliar applied Fe and Zn is essential for increasing biomass and grain yield under deficient conditions. We compared the effect of foliar applied lipid-based Pheroid Fe- or Zn- nanoformulation, chelate and sulfate forms on biomass, nutrient uptake and mobilization in maize grown under Fe and Zn deficiency scenarios in hydroponic systems and field trials. Foliar spray of Fe-Pheroid nanoformulation resulted in complete re-greening. Partial and no re-greening of mature and young leaves, respectively, were observed under FeSO₄ and Fe-HEDTA treatments. Foliar spray of Zn-Pheroid nanoformulation increased the Zn concentration of young leaves. In field trials, foliar spray of Fe- or Zn- chelate did not improve leaf Fe and Zn concentration or grain yield. Fe- and Zn-Pheroid nanoformulation improved the mobility of Fe and Zn within the plant. Field trials indicated that non-lipid-based formulation was not effective in amelioration of Fe- and Zn deficiency.     

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF)基因的克隆与原核表达

通过RT-PCR方法,从经ConA刺激的猪外周血淋巴细胞中扩增出猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF）编码区的cDNA并将其克隆至pMD-19T载体,序列测定表明pGM-CSF基因的长度为435 bp,编码144个氨基酸。通过PCR方法获得缺失其N端17个氨基酸残基信号肽序列的成熟pGM-CSF蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a（+）,构建重组表达质粒pET-GM并转入大肠杆菌(Escherichia coli )BL21（DE3）中进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,表达的重组蛋白分子量约31 kD,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30.4% 。采用Ni2+-NTA亲和层析柱对经稀释复性的重组蛋白进行纯化,并采用MTT法以TF-1细胞检测纯化产物的生物学活性。结果表明,重组蛋白可有效刺激TF-1细胞增殖,其活性达到3.43×105 IU/mg。     

缺磷胁迫下草甘膦对抗草甘膦大豆幼苗光合作用和叶绿素荧光参数的影响1

为探明缺磷胁迫下草甘膦对抗草甘膦大豆（RR1）幼苗叶片光合作用和叶绿素荧光参数的影响,采用溶液培养方法,在大豆长出真叶时进行缺磷胁迫,第二复叶完全展开时进行草甘膦处理,5d后测定各生理指标。结果表明, 相对于正常供磷条件的清水处理,缺磷胁迫下4.98 mL/L草甘膦处理的大豆叶片净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）、最大荧光（Fm）、PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）、PSⅡ的有效量子产量［Y(Ⅱ)］、PSⅡ非调节性能量耗散的量子产量［Y(NO)］、最大电子传递速率（ETRmax）和半饱和光强（Ik）均呈下降趋势。而气孔限制值（Ls）、叶绿素a（Chl a）、叶绿素b（Chl b）、叶绿素a/b（Chl a/b）、类胡萝卜素（Car）、总叶绿素（Chl）含量和PSⅡ调节性能量耗散的量子产量［Y(NPQ)］均呈升高趋势。说明缺磷胁迫条件下喷施草甘膦显著降低了抗草甘膦大豆的光合速率。缺磷引起的气孔因素可能是导致RR大豆光合速率下降的主要原因,而光合速率的下降导致其PSⅡ反应中心的开放程度降低,活性减弱,参与CO2固定的电子较少,光化学效率较低。     

大气CO_2浓度升高对谷子生长发育与光合生理的影响

研究大气CO2浓度升高对谷子的影响,有助于人们了解未来气候变化后,谷子生产的变化,以提前采取必要的应对措施趋利避害。本研究利用FACE(FreeAirCO2Enrichment)系统首次在大田条件进行了谷子生长发育受CO2浓度升高影响的试验。结果表明,大气CO2浓度升高后,谷子的株高、茎粗、叶面积增加,叶片叶绿素含量下降。在相同CO2浓度下,抽穗期FACE圈内谷子叶片气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)和胞间CO2浓度与环境CO2浓度的比值(Ci/Ca)会下降,叶片光合能力有所下降,出现光适应,但水分利用效率(WUE)会提高。     

枇杷EjNAC82的克隆及其对类胡萝卜素合成基因EjPSY、EjBCH的转录激活分析

为了探讨NAC转录因子对枇杷果实类胡萝卜素代谢的调控机制,以大红袍(红肉枇杷)和白沙(白肉枇杷)为试验材料,利用RNA-Seq技术对大红袍和白沙进行转录组测序,通过分析两个品种间的转录组差异,初步筛选并克隆出了1个枇杷NAC转录因子,命名为EjNAC82。生物信息学技术分析结果发现,EjNAC82具有NAC转录因子特有的结构域、理化性质和蛋白质结构特点,是典型的NAC转录因子家族基因。亚细胞定位试验发现该转录因子定位于细胞核。实时荧光定量PCR结果表明,EjNAC82在枇杷老叶中的表达量高于根、芽、嫩叶、老叶、嫩枝、老枝、幼果和熟果。EjNAC82在果皮和果肉成熟过程中的表达模式相同,均呈先上升后下降再上升的趋势。随着果实的成熟,EjNAC82在大红袍果肉中的表达显著高于白沙(P<0.05)。EjNAC82在大红袍果皮S1、S2、S4时期的表达显著高于白沙。LUC/REN双荧光素酶试验结果表明,EjNAC82对EjPSY1、EjPSY2和EjBCH启动子具有激活作用。这些结果表明EjNAC82可能通过调控EjPSY1、EjPSY2和EjBCH基因的表达从而正向调控枇杷果实中类胡萝卜素的合成。本研究结果为揭示NAC转录因子对枇杷果实类胡萝卜素积累的转录调控功能提供了理论依据。     

不同生境下锌镉在伴矿景天不同叶龄叶中的富集与分布特征

田间试验、温室盆栽和生长室水培试验研究了Zn和Cd超富集植物伴矿景天不同叶龄叶片的Zn、Cd富集和分布特征。结果显示,田间条件下伴矿景天新叶中Cd浓度高于成熟叶、但新叶中Zn浓度低于成熟叶。温室盆栽试验发现,连续种植伴矿景天,第4季时低污染土壤（S1）上新叶中Zn浓度低于成熟叶,但高污染土壤（S4）上新叶中Zn浓度高于成熟叶;而到了第6季,S1、S4上新叶中Zn浓度均低于成熟叶,且在S1上两者达到显著水平;第4和第6季,伴矿景天新叶中Cd浓度始终高于成熟叶（除S1成熟叶中Cd浓度略高于新叶外）。水培试验结果发现,无论在高Zn（600 mmol/L）、高Cd（100 mmol/L）,还是低Zn（10 mmol/L）、低Cd（1 mmol/L）处理,新叶中Zn、Cd浓度均高于成熟叶;而且随着处理时间的延长,新叶和成熟叶中Zn、Cd浓度均明显上升。水培条件下,新叶和成熟叶中Zn最高分别为43 107、33 774 mg/kg（以干重计）（600 mmol/L,处理56 天）;新叶和成熟叶中Cd的最高浓度分别为15 057、9 060 mg/kg（以干重计）（100 mmol/L Cd,处理56 天）。这些结果表明,Zn、Cd在伴矿景天新叶和成熟叶中富集和分布与其生长介质中Zn、Cd的浓度尤其是有效态浓度、处理时间及植物所处的生长阶段等有关,同时也表明Zn、Cd优先分布于新叶可能与伴矿景天超富集Zn、Cd的机制有关。     

氮素形态对川芎生长、产量与阿魏酸和总生物碱含量的影响

采用田间试验研究了硝态氮、铵态氮、酰胺态及不同硝态氮与铵态氮配比对川芎生长发育和产量与品质的影响。结果表明,硝态氮、铵态氮、酰胺态及硝态氮与铵态氮配施均可在一定程度上促进川芎的生长,延长其根长,茎蘖数增加,干物质积累增加,从而显著提高川芎的产量以及阿魏酸和生物碱含量。在硝态氮、铵态氮和酰胺态氮单独施用时,以尿素的增产增收和改善品质的效果最好,硝态氮最差;硝态氮与铵态氮配施可增强其肥效,延长其肥效持续期。高产高效的最佳施肥方式是50%的硝酸钙与50%的碳酸铵配施;优质高产的最佳施肥方式是75%的硝酸钙与25%的碳酸铵配施。