鸡miR-124a-3p的组织表达谱及其与ACAA2基因的互作关系

鸡(Gallus gallus)miR-124a-3p与乙酰辅酶A酰基转移酶2基因(acetyl-CoA acyltransferase 2 gene,ACAA2)间存在潜在的互作关系。但目前对鸡miR-124a-3p的功能及其与ACAA2的靶作用关系了解还很少。本研究整合了组织表达谱和靶基因预测结果,分析鸡miR-124a-3p的潜在生物学功能,并验证了其与ACAA2的靶向关系。qRT-PCR结果显示,miR-124a-3p在所检测的鸡4个发育阶段13种组织中均表达,尤其是在下丘脑中高丰度特异性表达。生物信息学分析显示,miR-124a-3p预测靶基因在脂类转运、神经元迁移调控、脂肪细胞因子信号通路、轴突导向等生物学过程和通路中富集。关联分析表明,miR-124a-3p和ACAA2在胸肌、肝脏和皮下脂肪组织中的表达呈负相关。在鸡成纤维细胞中转染miR-124a-3p模拟物(miR-124a-3p mimics)可显著抑制荧光素酶活性和ACAA2的表达,表明鸡miR-124a-3p为一广泛性表达miRNA,且呈明显的时序表达,并通过靶作用于ACAA2参与多种脂类代谢相关生物学过程调控。本研究数据为进一步研究鸡miR-124a-3p功能和揭示鸡脂肪沉积相关性状形成机制提供了资料。     

绵羊卵巢oar-mir-150靶向调节类固醇激素合成急性调节蛋白基因的表达

为研究吐鲁番黑羊(Ovis aries)的繁殖调控,培育新的高繁殖力绵羊品种,本研究以吐鲁番黑羊卵泡期和黄体期显著差异表达的绵羊微小RNA150(Ovis aries microRNA150,oar-mir-150)为研究对象,利用生物信息学预测oar-mir-150的靶基因,应用qRT-PCR检测吐鲁番黑羊卵泡期和黄体期卵巢组织中oarmir-150和类固醇激素合成急性调节蛋白基因(steroidogenic acute regulatory protein gene,STAR)的表达水平,合成野生型、突变型和缺失型STAR基因碱基序列,退火扩增后与PGL3-control载体连接,构建荧光素酶报告基因重组载体,将绵羊oar-mir-150 mimic或negative control mimic与重组载体共转到293T细胞,利用双荧光素酶活性检测实验检测荧光素酶活性。结果表明,oar-mir-150的全部靶基因有540个,其中卵泡期与黄体期差异表达的靶基因有8个,STAR基因作为卵泡期较黄体期表达显著上调的靶基因其mRNA的3'非翻译区(3'untranslated region,3'UTR)存在oar-mir-150靶标结合位点(UUGGGAG);相对定量结果显示:卵泡期与黄体期相比,吐鲁番黑羊卵巢组织中oar-mir-150相对表达量为0.73,显著下调(P0.05),STAR mRNA相对表达量为1.90,显著上调(P0.05);成功构建野生型、突变型和缺失型荧光素酶报告基因重组载体,并以最佳转染效率和最佳转染比例进行转染;双荧光素酶活性检测结果表明oar-mir-150靶向负调控STAR的表达。研究证明了oar-mir-150与STAR间存在确切的靶向关系,且负调控STAR基因的表达,为研究微小RNA(microRNA,mi RNA)在发情周期的不同阶段调控吐鲁番黑羊繁殖过程提供理论依据。     

牦牛VEGFA双荧光素酶载体构建及与miR-200b的靶向验证

为探究微小RNA(miR-200b)与血管内皮生长因子A(VEGFA)基因之间的靶向关系，采用miRanda和Targetscan软件预测牦牛miR-200b与VEGFA可能存在结合位点，构建了VEGFA基因3′UTR区的野生型和突变型双荧光素酶载体。利用与目的miRNA靶种子序列相结合基因的突变序列，构建该靶基因的突变型重组质粒(pGL3-promoter-mut VEGFA)，再进行重组质粒和目的miRNA的miRNA mimic的共转染实验。结果表明，预测到的miR-200b与VEGFA基因的3′UTR区存在结合位点。PCR进行扩增和测序之后，VEGFA基因3′UTR区的野生型、突变型载体构建成功。共转染VEGFA野生型载体和miR-200b mimic的双荧光素酶活性极显著低于对照组(P < 0.05)，VEGFA突变型载体和miR-200b mimic共转染的双荧光素酶活性与对照组无显著差异(P ＞ 0.05)。说明VEGFA基因的3′UTR区能与miR-200b结合并抑制双荧光素酶活性，验证了VEGFA是miR-200b的靶基因。     

猪miR-369靶基因肿瘤坏死抑制因子-α(TNF-α)的鉴定

microRNAs(miRNAs)是一类长约22nt的非编码小RNA分子,作为关键的转录后调控因子调控真核生物的基因表达,广泛参与细胞的生长发育、分化和凋亡等生物学过程。本研究通过生物信息学预测发现,猪(Susscrofa)肿瘤坏死抑制因子-α(TNF-α)的3’非编码区具有2个潜在的miR-369的靶位点。并进一步通过双荧光素酶报告系统分析,将猪TNF-α3’非编码区构建到双荧光素酶载体中,转染至猪髋动脉内皮细胞系,荧光素酶活性测定显示,miR-369过表达组的荧光比值显著低于对照组(P<0.05),而miR-369抑制组相比对照组没有显著差异(P=0.752)。研究结果提示,猪miR-369能靶向调控TNF-α的表达,对深入研究脂肪沉积性状重要候选基因TNF-α的转录后调控机制具有重要价值。     

阉割对金华猪肝脏miR-122和miR-378表达量和膻味性状的影响

microRNA是一种小分子RNA,是细胞内复杂而精确的调控网络的组成部分.为了研究阉割对miR-122和miR-378表达量的影响以及miR-122和miR-378对雄烯酮和粪臭素代谢的调控作用,本研究利用荧光定量PCR检测了miR-122和miR-378在不同生长阶段金华猪(Sus scrofa)公猪肝脏中的表达量变化及其在阉割和非阉割公猪体内表达量的差异,利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测了金华猪皮下脂肪的粪臭素含量,并预测了调控pre-miR-122和pre-miR-378转录的相关转录因子及miR-122和miR-378与雄烯酮、粪臭素代谢相关基因的靶关系.结果发现,miR-122在胚胎期高表达,随着日龄的增加表达量逐渐下降;miR-378在胚胎期高表达,生长期呈现先增后减的态势.阉割后两者的表达量均较同期非阉割组表达下调.并且阉割后皮下脂肪中粪臭素的含量显著下降(P＜0.01).根据研究结果推测,阉割后激素水平的变化通过相关转录因子影响microRNA的表达,直接或间接影响雄烯酮和粪臭素代谢而实现对公猪膻味性状的调控.而在这个调控网络中,microRNA可能发挥了重要作用,为深入研究公猪膻味性状提供了一个新的思路.     

鸡SCD基因表达调控特性分析

硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearyl-CoA desaturase,SCD)是生物体内单不饱和脂肪酸生物合成的关键酶,在脂质合成和氧化的动态平衡调节过程中发挥重要的作用。本实验室前期工作显示,SCD基因可能与鸡(Gallus gallus)肝脏的脂质代谢过程相关。为了进一步研究该基因的表达调控规律及其生物学功能,本研究利用qRT-PCR分析了鸡SCD在不同组织和不同发育时期中的表达规律,并从个体和细胞水平分析雌激素对SCD的表达调控作用。结果表明,SCD基因在各组织中广泛表达,且在包括肝脏、腹脂和肾脏在内的与脂代谢相关组织中的表达水平相对较高;性成熟以后(产蛋期)SCD基因在鸡肝脏、腹脂和肾脏中的相对表达水平都显著升高(P0.05);雌激素处理的10周龄青年鸡肝脏、腹脂和肾脏中SCD的表达均显著升高(P0.05);雌激素处理的肝脏原代细胞中,SCD的表达也显著升高(P0.05)。研究结果表明鸡SCD基因的表达受雌激素调控,这一发现为进一步理解鸡脂肪代谢调控机制奠定了基础。     

小鼠体型控制相关microRNA-200b(miR-200b)的表达谱及靶标分析

microRNA-200b(miR-200b)具有类似的调控哺乳动物体型大小的功能,但尚未在哺乳动物个体上进行验证。为研究microRNA-200b在小鼠发育过程中的表达,探讨microRNA-200b及其靶标基因在小鼠体型发育调控中的关键作用,本研究从小鼠(Mus musculus)基因组中扩增得到miR-200b前体序列,并验证了该miRNA的茎环前体结构;采用生物信息学软件预测miR-200b可能的靶基因,并通过双荧光素酶报告载体系统验证了miR-200b与靶基因3’UTR的相互作用;通过荧光定量PCR技术分别分析了miR-200b在成年小鼠体内各组织中和miR-200b及其靶标基因在小鼠胚胎发育不同时期的表达变化。结果显示,克隆到的鼠miR-200b前体序列能够形成茎环结构;软件预测和细胞实验证实Fog2基因是miR-200b的靶标基因,且二者在小鼠胚胎发育第10.5天到第15天时表达呈负相关趋势;qRT-PCR结果表明,miR-200b在成年雌性小鼠各组织中均有表达,在肌肉、肾脏和子宫中表达量高,在心脏、脾脏和肺脏中表达量偏低。根据表达谱和靶标验证结果推测,miR-200b通过与靶基因Fog2的互作参与小鼠胚胎发育过程。     

Cre-LoxP系统调控肠道粘蛋白2启动子活性和特异性

靶基因的高丰度组织特异性表达是基因治疗和制备转基因动物的重要条件。运用Cre-LoxP系统是提高组织特异性启动子转录活性的有效途径之一。本研究利用Cre-LoxP系统,以肠道粘蛋白2启动子调控Cre重组酶表达,转染细胞后检测荧光素酶活性。结果显示,Cre-LoxP系统能使粘蛋白2启动子介导的靶基因在肠细胞SW480中的表达量提高约6倍。细胞特异性检验后发现,Cre-LoxP系统显著弱化了肠道粘蛋白2启动子的细胞特异性。研究结果提示,运用Cre-LoxP系统尽管可以大幅提高弱启动子的活性,但对启动子的特异性要求较高。     

信号转导及转录活化因子基因(stat3)转染牛乳腺上皮细胞及生物学特性观察

应用PCR技术从含有人信号转导及转录活化因子(star3)基因cDNA的质粒pOTa7中扩增star3基因片段.将其克隆入真核表达载体pEGFP-C1中.构建重组表达质粒.利用脂质体介导法将重组表达质粒转染原代牛乳腺上皮细胞(bovinemammary epithelial cells).G418筛选阳性克隆.RT-PCR检测star3基因在牛乳腺上皮细胞中的表达,并通过流式细胞术(flowcytometry)检测转染细胞的增殖能力、周期以及DNA含量.结果表明.转染24 h后大约16%的细胞被导入含star3基因的重组表达质粒.在mRNA水平证实细胞内有stat3基因的高表达.导人star3基因后,细胞增殖能力增强,染色体变为三倍体,细胞的增殖寿命较对照细胞延长了13代.表明导入star3基因能延长体外培养的牛乳腺上皮细胞的寿命.     

奶牛SREBP1蛋白对FASN基因启动子的转录调控分析

脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)是动物组织合成脂肪酸的关键酶,为研究奶牛(Bos taurus)FASN基因的调控机制,本研究从奶牛基因组DNA中克隆构建了3个不同片段长度的FASN基因启动子并分析其结构,在L02肝脏细胞中转染固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element binding protein1,SREBP1)真核表达载体和FASN启动子,Western blot检测SREBP1核蛋白的表达,双荧光素酶系统和q RT-PCR技术研究对FASN基因启动子活性的调控作用,结果发现,构建的pGL3-FSAN1、pGL3-FASN2和pGL3-FASN3启动子片段长度分别为177、255和399 bp,其中pGL3-FASN2和pGL3-FASN3包含SREBP1转录因子结合位点。在人(Homo sapiens)源L02肝脏细胞中转染SREBP1质粒后检测发现,SREBP1核蛋白表达升高。肝脏细胞中转染pGL3-FSAN1、pGL3-FASN2和pGL3-FASN3启动子并用SREBP1质粒处理后,pGL3-FASN2和pGL3-FASN3启动子活性极显著增加(P0.01)。与对照组相比,SREBP1处理后细胞FASN基因m RNA的表达显著增加1.67倍(P0.05)。本研究揭示奶牛SREBP1蛋白可以促进对FASN基因的转录激活。这一结果为研究奶牛FASN基因的转录调控机制提供了基础资料。     

用DEA法的两个模型测算农机化贡献率的算法研究

测算农机化贡献率的主要目的是从数量关系上认识农机化对农业增产增收带来的实际作用大小。在实践上有助于从总体上把握农业机械化的发展水平、发展潜力和发展趋势，在理论上研究产业系统单因素的贡献率具有学术意义。该文提出了综合运用DEA法的C²R和C²GS²两个模型，测算农机化贡献率的基本方法。该算法克服了现有DEA算法测算农机化贡献率时无法考虑技术进步所做的贡献而导致农机化贡献率偏大的问题，使测算结果更接近真实情况。     

水分胁迫对玉米根系AsA-GSH H202含量的影响

以“鲁玉14”、“掖单13”2个不同抗旱性玉米品种为材料，研究不同浓度聚乙二醇－6000（PEG－6000）处理下根系抗坏血酸－谷胱甘肽（AsA-GSH)循环中关键酶和抗氧化剂的变化及其对过氧化氢（H2O2）含量的影响结果表明，谷胱甘肽还原酶（GR）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性及谷胱甘肽（GSH）含量变化为当聚乙二醇溶液浓度低于100g/kg时，随水分胁迫的增强而上升，当聚乙二醇溶液浓度高于150g/kg时，随水分胁迫的增强而下降。抗坏血酸（AsA)含量随水分胁迫的增加而持续下降，H2O2含量随水分胁迫的加剧而增加。聚乙二醇溶液浓度为150－250g/kg处理下H2O2含量的增加与抗氧化酶活性、抗氧化剂含量的下降呈显著正相关。2品种比较，抗旱性强的品种具有较强的抗氧化能力。     

土壤胡敏酸与铜、锌离子的络合特征及生物有效性的研究

通过田间试验研究了胡敏酸(HA)与铜、锌离子的络合特性。结果表明,施肥后土壤HA向结构复杂方向转化,HA与Cu2+、Zn2+之间的络合稳定性提高。HA-Cu2+的logk值,有机肥大于化肥;HA-Zn2+的logk值,以化肥的作用更明显。土壤HA与Cu2+或Zn2+络合,倾向于形成混合或多核络合物。施有机肥可提高HA-Cu2+或HA-Zn2+的结合强度和增加结合数量,而施化肥处理则相反。培养试验结果表明,有机肥处理的HA,玉米吸收Cu2+、Zn2+量下降,单施化肥处理下降较小;其中Cu2+吸收量受影响程度较大,而Zn2+吸收量没有那么明显。     

有机酸对针铁矿和膨润土吸附Cd2+、Pb2+的影响

用平衡吸附法研究了不同浓度的有机酸（乙酸、酒石酸和柠檬酸）对针铁矿和膨润土吸附Cd^2＋、Pb^2＋的影响。结果表明：（1）低浓度（〈0．6mmolL^-1）有机酸促进供试矿物吸附Cd^2＋和Pb^2＋，随着有机酸浓度增加，吸附逐渐被抑制。高浓度（〉1．0mmolL^-1）有机酸对Pb^2＋吸附的抑制作用比对Cd^2＋的强。有机酸浓度的变化对针铁矿Cd^2＋、Pb^2＋吸附率的影响大于对膨润土的。（2）不同Cd^2＋浓度下，有机酸对膨润土Cd^2＋吸附强度的影响大于针铁矿。加入高浓度Cd^2＋（8．0mmolL^-1）时，低浓度有机酸对膨润土吸附Cd^2＋的促进作用比加入低浓度Cd^2＋（0．4mmolL^-1）时明显，高浓度有机酸对膨润土吸附Cd^2＋的抑制作用与低浓度Cd^2＋时相近。（3）低浓度有机酸（〈0．6mmolL^-1）时，酒石酸、柠檬酸对针铁矿吸附Cd^2＋的促进作用大于乙酸，而它们对膨润土吸附Cd^2＋的促进作用相似；在三种有机酸高浓度（〉1．0mmol L^-1）时，针铁矿对Cd^2＋的吸附都趋于稳定，而柠檬酸对膨润土吸附Cd^2＋的抑制作用比乙酸和酒石酸的明显。不同种类有机酸下，矿物对Pb^2＋吸附率大小的变化基本一致。     

国家标准《有机-无机复混肥料》中有机质测定方法的研究

用H2SO4—K2Cr2O7沸水浴法氧化有机碳,可避免尿素干扰,Cl 可定量扣除,有机碳氧化率为67%,回收率达99.23%,有机碳测定值的RSD为0.35～0.97%,可以满足测定要求。     

不同施肥方式对农田土壤CO2和N2O排放的影响

采用静态箱/气相色谱法研究不同施肥方式以及环境因子对农田土壤CO2和N2O排放通量的影响,结果表明,不同施肥方式对农田土壤CO2排放的季节模式无明显影响,但是影响了N2O排放的季节模式。不同施肥方式对土壤CO2排放通量影响不明显,主要影响土壤N2O排放,整个小麦、玉米生长季,分两次施肥的F2与分四次施肥的F1相比,土壤N2O排放量增加,化肥配合有机肥施用(MF)的土壤N2O通量大于单纯的化肥处理,秸秆还田降低了土壤N2O的排放。相关分析结果表明,土壤CO2排放与大气温度、地表温度、土壤温度和土壤水分均呈显著正相关关系(P<0.01)。由于肥料施用的影响,土壤N2O排放和土壤温度、水分的相关分析并不显著。土壤N2O排放受土壤硝态氮和铵态氮变化的影响。     

下辽河平原大豆田CO2和N2O排放通量及相关影响因素研究

采用静态箱/气相色谱(GC)法测定了2004年及2005年大豆田CO2和N2O排放通量。结果表明:在2年的观测期内,大豆田的CO2和N2O排放均具有明显的季节变化规律。在2个生长季的观测中,CO2和N2O的排放通量分别呈现出相似的变化趋势。大豆田在休闲期内基本没有CO2排放,冻融期有少量的N2O排放。分析相关影响因素得知,土壤温度和土壤水分是影响大豆田释放CO2和N2O的重要因素。大豆植株对于N2O的排放具有不可忽视的作用。2年观测中常规处理的N2O通量总量分别是无作物处理的2.28倍和1.80倍。     

镉胁迫对不同小麦品种幼苗生长以及Cd~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)吸收和积累的影响

以洛旱6号、豫麦25、豫麦18、豫农949、新麦21及许农5号为试验材料,通过营养液培养法,研究了镉胁迫对其幼苗生物量积累以及Cd2+、Zn2+与Mn2+吸收的影响。结果表明,与正常生长小麦相比,低Cd2+(≤30μmol/L)浓度下,除许农5号地上部生物量有所下降外,其余品种的地上部和地下部生物量均呈上升趋势。中、高Cd2+(≥60μmol/L)浓度下,所有品种的生物量呈下降趋势,所有小麦品种体内Cd2+的含量均随着Cd2+处理浓度的增加而不断增加,而且,根系内Cd2+的含量均明显高于地上部。随着Cd2+处理浓度的增加,所有小麦品种地上部Zn2+的含量均不断增加,地下部Zn2+含量的变化品种间存在差异。地上、地下部Mn2+的含量则随处理浓度增加而不断降低。     

陪伴离子对土壤胶体吸附Cu2+和Pb2+的影响

采用表面络合模式研究了不同陪伴离子对陕西 4种典型土壤胶体吸附Cu2 、Pb2 的影响。结果表明 :在各阴离子体系 ,同一土壤胶体对Cu2 、Pb2 吸附百分数达到 5 0 %时对应的pH(pH50 )值呈现 :Cl->SO2 - 4>草酸根 >柠檬酸根 >NO- 3的趋势 ,表面络合常数logKintM 的大小次序与此相反 ;专性吸附特征值 (n值 )反映了吸附过程专性吸附与电性吸附比例的大小 ,其值大小表现为 :NO- 3>Cl- >SO2 - 4>草酸根 >柠檬酸根的趋势     

Ce(Ш)对UV-B辐射下大豆幼苗水分代谢影响的机理

为探讨稀土对UV-B辐射胁迫下植物水分代谢的影响,采用水培法研究Ce(Ш)对紫外辐射(UV-B,280～320 nm)胁迫下大豆(Glycine max)幼苗叶片气孔密度、气孔导度(Gs)、脱落酸(ABA)含量、过氧化氢(H2O2)含量、过氧化氢酶(CAT)活性的影响.结果表明:20 mg·L-1 CeCl3处理显著增加了大豆幼苗叶片背面近轴气孔密度,高剂量UV-B(0.45 W·m-2)处理降低了气孔密度,与CK达显著差异;Ce(Ш)+UV-B处理减轻了UV-B胁迫引起的气孔密度下降.动态曲线显示,较之CK,20 mg·L-1 CeCl3提高了大豆幼苗的Gs,UV-B辐射使Gs下降,Ce(Ш)+UV-B处理下Gs的下降趋势得到缓解,且最终达到较好的恢复效果.与CK相比,UV-B辐射导致ABA、H2O2积累,CAT活性提高,Ce(Ш)处理降低了UV-B辐射造成的ABA和H2O2的积累,提高了CAT活性.结果表明,Ce(Ш)处理减轻了UV-B辐射对大豆幼苗水分代谢的胁迫伤害.