miR-122靶向调控鸡BZW2基因的表达

miR-122(MicroRNA-122)是在肝脏中高表达的miRNA,在肝脏的生长发育和脂类代谢等过程发挥重要作用,BZW2 (basic leucine zipper and W2 domains 2)主要参与蛋白质合成代谢,本研究目的是确定BZW2是否为miR-122调控的靶基因.通过生物信息学预测miR-122的靶基因,并分析BZW2的3-UTR区域与miR-122种子区的配对情况,再用双荧光素酶报告系统和突变实验证明miR-122作用于BZW2的3'UTR.用荧光定量PCR检测转染miRNA-122mimic的鸡(Gallus gallus)肝癌细胞系(leghorn hepatocellar,LMH)细胞和转染LNA-antimiR-122的鸡原代肝细胞中BZW2的表达.鸡BZW2的3'-UTR区域与miR-122种子区互补配对,荧光素酶报告基因和突变实验分析表明,miR-122能够通过与BZW23'-UTR区结合抑制基因的表达;将miR-122在LMH细胞中过表达后,发现BZW2 mRNA表达水平显著下降;利用LNA-antimiR-122抑制鸡肝脏原代细胞中的miR-122后,BZW2 mRNA表达水平呈显著性上升.结果证明BZW2是miR-122的靶基因,其在mRNA水平上受到miR-122的负性调控,本研究为揭示miR-122在鸡肝脏中的广泛的功能提供了理论依据.     

猪miR-369靶基因肿瘤坏死抑制因子-α(TNF-α)的鉴定

microRNAs(miRNAs)是一类长约22nt的非编码小RNA分子,作为关键的转录后调控因子调控真核生物的基因表达,广泛参与细胞的生长发育、分化和凋亡等生物学过程。本研究通过生物信息学预测发现,猪(Susscrofa)肿瘤坏死抑制因子-α(TNF-α)的3’非编码区具有2个潜在的miR-369的靶位点。并进一步通过双荧光素酶报告系统分析,将猪TNF-α3’非编码区构建到双荧光素酶载体中,转染至猪髋动脉内皮细胞系,荧光素酶活性测定显示,miR-369过表达组的荧光比值显著低于对照组(P<0.05),而miR-369抑制组相比对照组没有显著差异(P=0.752)。研究结果提示,猪miR-369能靶向调控TNF-α的表达,对深入研究脂肪沉积性状重要候选基因TNF-α的转录后调控机制具有重要价值。     

12个物种miR-302基因簇的生物信息学分析

很多microRNA（miRNA）基因在基因组上聚集排列形成miRNA基因簇。miRNA基因簇在进化上较为保守,有其特殊的生物学意义。miR-302基因簇在胚胎干细胞中特异表达,对胚胎干细胞的自我更新和多潜能维持有重要的作用。本文采用miRBase数据库查询和BLAST同源搜索方法共搜寻并分析了12个物种的miR-302基因簇。生物信息学分析表明,这些物种miR-302基因簇均位于LARP7蛋白基因的内含子区,但转录方向与LARP7基因转录方向相反。序列相似性分析显示,同一物种miR-302簇成员间以及不同物种相应miR-302簇成员间相似性均较高。进化分析表明,基因复制可能是miR-302基因簇进化的主要驱动力。     

阉割对金华猪甲状腺球蛋白(TG)和甲状腺过氧化酶(TPO)基因表达的影响

采用荧光定量PCR技术分析阉割与非阉割金华猪甲状腺组织中甲状腺球蛋白(TG)和甲状腺过氧化酶(TPO)基因在60、90和120日龄时表达水平.结果表明:(1)组内日龄间比较,阉割组猪TG和TPO基因在90日龄时的表达量均显著高于60和120日龄(P＜0.05);非阉割组猪TG基因在120日龄时的表达量显著低于60和90日龄(P＜0.05),TPO基因在不同日龄间的表达量差异不显著(P＞0.05).(2)组间同日龄比较,发现阉割后TG和TPO基因在60,90和120日龄的表达量都显著高于或低于非阉割组(P＜0.05).研究结果提示,阉割后,TG和TPO基因表达量的升高可能会加快猪的生长发育和提高猪肉的肌内脂肪含量.     

miR-106-363基因簇在脊椎动物中的进化分析

microRNA（miRNA）是一类在真核生物体内广泛表达的非编码小分子RNA,在生物体生长、发育以及疾病发生等过程中都起着极其重要的作用。miR-106-363基因簇是一个高度保守的基因簇,编码miR-106、miR-18、miR-20、miR-19、miR-92和miR-363等6个miRNA。本文通过对miRBase数据库检索以及同源搜索的方法在16种脊椎动物中搜索到了miR-106-363基因簇。该miRNA基因簇在高等脊椎动物中高度保守,稳定存在。系统进化树分析表明,miR-106-363基因簇与miR-17-92基因簇有着共同的祖先,且在进化上miR-17-92基因簇有着更早的起源。     

鸡miR-124a-3p的组织表达谱及其与ACAA2基因的互作关系

鸡(Gallus gallus)miR-124a-3p与乙酰辅酶A酰基转移酶2基因(acetyl-CoA acyltransferase 2 gene,ACAA2)间存在潜在的互作关系。但目前对鸡miR-124a-3p的功能及其与ACAA2的靶作用关系了解还很少。本研究整合了组织表达谱和靶基因预测结果,分析鸡miR-124a-3p的潜在生物学功能,并验证了其与ACAA2的靶向关系。qRT-PCR结果显示,miR-124a-3p在所检测的鸡4个发育阶段13种组织中均表达,尤其是在下丘脑中高丰度特异性表达。生物信息学分析显示,miR-124a-3p预测靶基因在脂类转运、神经元迁移调控、脂肪细胞因子信号通路、轴突导向等生物学过程和通路中富集。关联分析表明,miR-124a-3p和ACAA2在胸肌、肝脏和皮下脂肪组织中的表达呈负相关。在鸡成纤维细胞中转染miR-124a-3p模拟物(miR-124a-3p mimics)可显著抑制荧光素酶活性和ACAA2的表达,表明鸡miR-124a-3p为一广泛性表达miRNA,且呈明显的时序表达,并通过靶作用于ACAA2参与多种脂类代谢相关生物学过程调控。本研究数据为进一步研究鸡miR-124a-3p功能和揭示鸡脂肪沉积相关性状形成机制提供了资料。     

过表达miR-128a抑制大鼠前体脂肪细胞分化

为阐明miR-128a在大鼠前体脂肪细胞分化过程中的功能,本实验检测了大鼠(Rattus norvegicus)前体脂肪细胞成脂分化过程中miR-128a的表达,明确其在分化过程中的表达趋势;构建miR-128a的腺病毒过表达载体并侵染大鼠前体脂肪细胞,随后采用Real-time PCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平检测了成脂标记基因过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)和脂肪酸结合蛋白2(adipocyte protein 2,aP2)的表达;过表达miR-128a的大鼠前体脂肪细胞在第10天进行油红O染色,从形态学上观察成脂分化情况.结果显示,miR-128a的表达量在脂肪细胞诱导分化第二天降到最低点,随后维持在第0天的水平.在过表达miR-128a后,大鼠前体脂肪细胞成脂标记基因PPARγ和aP2的蛋白表达量与对照相比显著下降,脂滴明显少于对照组.实验结果表明:在大鼠前体脂肪细胞中过表达miR-128a能够抑制前体脂肪细胞的分化;并且通过PPARγ mRNA和蛋白水平的差异性变化,结合miRNA的作用机理,推测PPARγ有可能是miR-128a的靶基因.本实验也为研究miR-128a在脂肪细胞分化中发挥作用的机理提供了理论基础.     

MicroRNA(miR)-27b在山羊生长过程中的组织表达谱分析

本研究旨在分析microRNA(miR)-27b在安徽白山羊(Capra hircus)和波尔山羊生长发育过程中的表达变化,以了解其在山羊肌肉发育中的重要作用.选用安徽白山羊和波尔山羊不同发育时期(初生,6月龄和12月龄3个时期)背最长肌为材料,利用Real-time quantitative PCR (qRT-PCR)方法检测miR-27b的表达变化.同时,分析了miR-27b在6月龄山羊各组织中(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、腿肌和胸肌)的表达.并用MEGA3.1分析miR-27b在不同物种中的保守性.结果显示,miR-27b在安徽白山羊和波尔山羊骨骼肌发育过程中差异表达,呈现不同的表达模式.安徽白山羊12月龄背最长肌miR-27b表达最高,初生时最低.在山羊不同组织中,骨骼肌和心脏中miR-27b表达量较高,肝脏和肾脏中miR-27表达处于中度水平,而在另外4种组织中表达量较低.实验结果表明,miR-27b可能参与山羊肌细胞增殖和分化,从而影响山羊骨骼肌生长发育,与山羊肌肉的生长类型有关.同时序列分析显示,miR-27b在10个物种中具有较高的保守性.山羊miR-27b的表达具有的组织和时序差异性实验结果为进一步研究miR-27b的功能提供基础资料.     

miR-29a在酉州乌羊不同体组织中表达特征及其在B16细胞中的动态表达分析

为探究miR-29a在酉州乌羊不同体组织表达特征及在B16细胞中的表达特性,本研究采用RT-qPCR方法检测miR-29a在酉州乌羊不同体组织以及B16细胞不同发育时期的表达水平。结果表明,miR-29a在酉州乌羊各体组织均有表达,其中在大脑中的相对表达量最高,肺和皮肤中的相对表达量最低;同时在渝东白羊皮肤中的相对表达量是酉州乌羊皮肤的3.44倍,且差异极显著(P<0.01);在细胞增殖过程中,miR-29a相对表达量极显著增加(P<0.01);在分化初期miR-29a相对表达量较高,之后趋于稳定且差异不显著(P>0.05)。在加入分化培养基后,细胞的形态发生变化,黑色素分泌增多。综上所述,miR-29a在酉州乌羊各组织中广泛表达,miR-29a的相对表达量随着B16细胞的增殖而递增,但随着B16细胞的分化而降低,推测miR-29a与B16细胞的增殖与分化密切相关。本研究结果为明确miR-29a在酉州乌山羊各组织中的表达特性及其是否参与了黑色素细胞行为学的调控提供了一定的理论证据。     

miR-196a-1在3T3-L1脂肪细胞分化中的表达及作用

为研究miR-196a-1在脂肪形成中的作用,从3T3-L1细胞基因组中扩增miR-196a-1前体序列,构建miR-196a-1的表达载体,获得稳定表达miR-196a-1的3T3-L1细胞株,成脂诱导后检测脂肪细胞分化关键转录因子的mRNA表达和脂滴累积情况。结果表明,miR-196a-1在3T3-L1细胞分化过程中表达上调,在诱导分化的第2天达到高峰,并在之后的分化过程中恢复到正常水平;稳定表达miR-196a-1的3T3-L1细胞株中miR-196a-1的持续高水平表达导致脂肪形成关键基因过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)和脂蛋白脂酶(LPL)的mRNA水平及脂滴累积明显增加。这些结果指明,miR-196a-1促进3T3-L1脂肪细胞分化,利用所构建的稳定表达miR-196a-1的细胞株可进一步研究miR-196a-1调节脂肪形成的分子机制。     

牦牛VEGFA双荧光素酶载体构建及与miR-200b的靶向验证

为探究微小RNA(miR-200b)与血管内皮生长因子A(VEGFA)基因之间的靶向关系，采用miRanda和Targetscan软件预测牦牛miR-200b与VEGFA可能存在结合位点，构建了VEGFA基因3′UTR区的野生型和突变型双荧光素酶载体。利用与目的miRNA靶种子序列相结合基因的突变序列，构建该靶基因的突变型重组质粒(pGL3-promoter-mut VEGFA)，再进行重组质粒和目的miRNA的miRNA mimic的共转染实验。结果表明，预测到的miR-200b与VEGFA基因的3′UTR区存在结合位点。PCR进行扩增和测序之后，VEGFA基因3′UTR区的野生型、突变型载体构建成功。共转染VEGFA野生型载体和miR-200b mimic的双荧光素酶活性极显著低于对照组(P < 0.05)，VEGFA突变型载体和miR-200b mimic共转染的双荧光素酶活性与对照组无显著差异(P ＞ 0.05)。说明VEGFA基因的3′UTR区能与miR-200b结合并抑制双荧光素酶活性，验证了VEGFA是miR-200b的靶基因。     

绒山羊次级毛乳头细胞培养优化及miR-206对其调控研究

毛乳头细胞(dermal papilla cells,DPCs),对毛囊再生具有诱导能力,并一定程度上决定毛囊的大小,在毛囊周期变化过程中发挥关键作用.本研究旨在优化陕北白绒山羊(Capra hircus)次级DPCs培养液体系,探讨miR-206对次级毛乳头细胞表达模式影响,分析miR-206与次级毛囊周期性发育关系,探索其在陕北白绒山羊皮肤毛囊发生过程中的作用.本研究采集陕北白绒山羊生长期皮肤样本,采用钝性分离与中性蛋白酶及胶原酶Ⅱ消化相结合的方法分离单根毛囊并剥离毛乳头;配制5组细胞培养液,利用细胞免疫荧光染色的方法检测毛乳头细胞中α-平滑肌激动蛋白基因(α-smooth muscle actin,α-SMA)和CD133的表达;利用脂质体3000介导miR-206模拟物转染次级毛乳头细胞,qRT-PCR检测7个与毛囊周期变化相关基因的表达情况.本研究成功进行了毛乳头细胞原代和传代培养,毛乳头细胞3d即可贴壁并伴有迁出;同时添加双抗、雌二醇(β2 estradiol,β2)、胰岛素-转铁蛋白-硒(insulin-transferrin-selenium,ITS)和表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)的培养液中毛乳头细胞从贴壁时间和迁出效率及细胞活力上均优于其他组,建议绒山羊次级毛囊生长期毛乳头细胞培养液为改良杜氏伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle medium:nutrient mixture F-12,DMEM/F12)(1∶1)、10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、双抗(100 IU)、β2(0.3 μg/mL)、ITS(5.0 μg/mL)、EGF(7.0 μg/mL).与对照组相比,miR-206转染毛乳头细胞后,蛋白络氨酸磷酸酶N1基因(protein tyrosine phosphatase,non-receptor type 1,PTPNl)、骨形态发生蛋白2基因(bone morphogenetic protein 2,BMP2)表达量极显著升高(P＜0.01),BMP4表达量无显著差异(P＞0.05),与BCL-2相关的永生基因(BCL-2 associated athanogene 4,BAG4)、MAX二聚蛋白4基因(MAX dimerization protein 4,MXD4)、胰岛素样生长因子1基因(insulin like growth factor 1,IGF-1)和成纤维细胞生长因子受体2基因(fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)表达量极显著下降(P＜0.01).经筛选分析BAG4可能是miR-206的候选靶基因.本研究成功对毛乳头细胞培养液进行了优化,转染的miR-206能够在绒山羊次级毛乳头细胞中稳定表达,初步判断其过表达对生长期毛囊的发育具有一定的抑制作用.本研究为进一步研究miR-206在毛囊周期发育中的分子机制提供了理论依据.