刺五加皂苷合成关键酶基因表达的半定量RT．PCR分析

根据己克隆的刺五加鲨烯合酶（squalene synthase,SS）、鲨烯环氧酶（squalene epoxidase,SE）和β-香树酯醇合成酶（B—amyrin synthase,bAS）基因序列信息设计引物,通过半定量RT-PCR分析了SS、阳和bAS基因在刺五加不同生长发育时期和不同器官中表达量的变化。结果表明,SS、SE和bAS基因在各生长发育时期和各器官中均有表达,但表达量差异显著（P〈0．05）,三者均在盛花期表达量最高,之后降低,进入果实成熟期后豁和bAS的表达量迅速回升,阳无显著变化。册和bAS在叶片和根中的表达量较高,舾表达量的最大值出现在叶片和幼茎中。刺五加SS、SE和hAS基因的表达间存在显著的正相关关系（P〈0．05）。研究结果为讲一步分析关锋酶基因对刺百加三萜皂苷生物合成的影响奠定了基础。     

陆地棉法尼基焦磷酸合酶基因的克隆及表达分析

棉酚是棉花重要的次生代谢产物之一,具有抗虫及抗病害的作用。法尼基焦磷酸合酶是杜松烯合酶的上游酶,催化合成法尼基焦磷酸,该物质是棉酚等次生代谢物生物合成的前体。本文依据亚洲棉法尼基焦磷酸合酶基因序列,采用同源RT-PCR技术,克隆了陆地棉法尼基焦磷酸合酶基因,对其序列和编码产物结构进行了分析。荧光定量PCR分析表明,该基因在棉花植株叶片表达量最高,根部最低,在花、铃、蕾、茎中的表达水平接近。以上工作为棉花异戊二烯基途径的分析及相关次生代谢的途径工程研究奠定了一定的理论基础。     

二化螟鞘磷脂合酶相关基因CsSMSr的克隆、真核表达及表达谱分析

鞘磷脂合酶(SMS)基因家族在鞘脂质代谢中起着关键作用,可以通过调节神经酰胺和甘油二酯的平衡调控细胞的生存和凋亡.本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆得到1个二化螟鞘磷脂合酶相关基因的全长eDNA,命名为CsSMSr(Genbank登录号:JQ664739).CsSMSr开放阅读框1587bp,可编码528个氨基酸;序列分析表明,CsSMSr基因编码的蛋白N端具有保守的SAM结构域,含6个跨膜区域,并且有4个SMS家族特有的保守区域D1～D4,保守区D3和D4上有活性中心包括3个氨基酸残基(催化三联体):His302,His345,Asp349.CsSMSr在粉纹夜蛾Tn细胞内成功表达,Western blot检测表达产物分子量约60kDa.应用实时荧光定量PCR方法分析该基因在二化螟不同发育阶段和不同组织的表达,结果表明,CsSMSr随着二化螟的生长发育表达水平逐渐升高,在成虫时期达到最大;CsSMSr的表达具有组织特异性,二化螟雌成虫和雄幼虫生殖器官中的CsSMSr表达量都显著高于其他器官,在二化螟雄成虫精巢中表达量也较高,但与中肠和马氏管差异不大.CsSMSr的表达有时间特异性和组织特异性,推测该基因在二化螟的发育和生殖中有重要作用.本研究成功克隆并表达了二化螟鞘磷脂合酶相关基因,为进一步对该基因进行功能鉴定奠定了基础.     

PHAs合酶phaC2基因转化烟草叶绿体的研究

中长链羟基脂肪酸聚酯 (medium-chain-length-PHAs, mcl-PHAs) 属于微生物聚酯。Ⅱ型PHA合酶是mcl-PHAs生物合成途径中的关键酶。将编码Ⅱ型PHA合酶的基因phaC2与水稻(Oryza sativa )叶绿体psbA基因的启动子和终止子构建表达盒(RpsbA-pro-phaC2-RpsbA-ter)，连同壮观霉素抗性基因aadA表达盒(prrn-aadA-TpsbA-ter)一起克隆进烟草叶绿体基因组同源片段rbcL和accD中，构建了烟草叶绿体转化表达载体pTC2。基因枪法转化烟草(Nicotiana tobacum L.)叶片，获得具有壮观霉素抗性的转基因烟草。对T0代和T1代转基因植株的PCR和Southern blot鉴定结果表明, 外源基因确已整合进烟草叶绿体基因组中，T1代转基因植株已达同质化。RT-PCR分析结果证实phaC2基因已在转录水平上表达。转基因植株的正反交试验证明外源基因在转基因后代中遵循母性遗传规律，不存在转基因的花粉漂移现象。通过叶绿体遗传转化, 实现中长链羟基脂肪酸聚酯合成关键酶基因phaC2在烟草叶绿体基因组中的稳定转化。     

砀山酥梨果实COMT基因的克隆和表达分析

梨果实石细胞的发育和木质素的合成、转运及沉积密切相关。咖啡酸氧甲基转移酶(COMT)是木质素合成途径中的1种关键酶,主要参与紫丁香基木质素(syringyl lignin,S-木质素)的生物合成。本研究以砀山酥梨果实为材料,利用RT-PCR技术并结合RACE方法,得到砀山酥梨COMT基因的全长c DNA,命名为Pb COMT(Gen Bank登录号为KC905086)。该基因全长1 371 bp,开放阅读框为1 098 bp,编码365个氨基酸。进化树分析发现砀山酥梨COMT蛋白具有很高同源性,与苹果的相似性达到94%。将该基因重组到表达载体p ET-32a(+)中进行原核表达,电泳检测到1条大约60.0 k D的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。荧光定量表达分析得知,梨果实Pb COMT基因表达量变化与木质素的含量变化趋势基本一致,并且和石细胞发育规律有很大的相关性。本研究为阐明梨石细胞发育分子机理奠定基础,为分子调控石细胞含量、改善梨果实口感提供了科学依据。     

具不同蛋白质含量水稻品种中天冬酰胺合成酶基因的表达

为研究水稻中氮同化与籽粒蛋白质合成可能的关系,本实验通过Northern杂交分析比较了氮同化关键酶一天冬酰胺合成酶基因（OsAS）在不同水稻品种中的表达特性。结果显示,OsAS基因在水稻不同组织及其不同发育时期中的表达水平不同,以发育种子中的表达量最高,叶鞘和叶片中相对较弱;在籽粒发育过程中OsAS基因的表达呈先升高后下降的趋势。具不同种子蛋白质含量水稻品种叶片中OsAS基因的表达水平存在显著差异,相关性分析显示在籼亚种或粳亚种不同品种内OsAS基因表达量与籽粒蛋白质含量可能存在一定的关联。     

比利时杜鹃花花青素合成酶基因（RhANS）克隆及其功能分析

花青素合成酶（ANS）是植物花青素合成途径中的关键酶。为探究比利时杜鹃花（Rhododendron hybridum Hort.）ANS基因的功能及表达特性,本研究以比利时杜鹃花不同发育时期花瓣及盛花期的根、茎、叶为试验材料,利用反转录（RT-PCR）和RACE技术克隆RhANS基因cDNA序列;利用超高效液相色谱质谱（Waters UPLC-Qtof）技术分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣中花青素含量;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣和不同器官中ANS基因相对表达量;将RhANS基因重组到原核表达载体（pET-28a）上,并在大肠杆菌（BL21）中进行表达纯化出目的蛋白,并利用高效液相色谱（HPLC）检测目的蛋白RhANS的酶活性。结果表明,从比利时杜鹃花克隆得到RhANS基因cDNA全长序列1 350 bp,开放阅读框（ORF）序列1 074 bp,编码357个氨基酸,含有2-酮戊二酸双加氧酶家族基因结构域2OG-FeⅡ-Oxy;比利时杜鹃花花青素含量随着花的开放呈逐渐上升的变化趋势;RhANS基因表达量在比利时杜鹃花4个花期的花瓣和不同器官（...     

榨菜瘤状茎膨大相关基因orf451的克隆及其表达分析

为了更好地了解榨菜(Brassica juncea var.tumida)瘤状茎膨大的分子机制,以榨菜不同发育时期的瘤状茎为材料,分离到一个c DNA-AFLP差异片段,利用c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆了包含有该差异片段的基因的c DNA全长(命名为orf451,Gen Bank登录号:KM213220),并对其序列及编码的蛋白质进行分析。结果表明,orf451的c DNA全长1 512 bp,最大开放阅读框为1 356 bp,与编码多聚半乳糖醛酸酶/糖苷水解酶的基因有很高的相似性(90%),其编码的蛋白具备多聚半乳糖醛酸酶(果胶裂解酶)和糖苷水解酶的功能域。利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术对orf451的时空表达进行分析,发现在榨菜瘤状茎形成初期orf451在表皮和外皮层表达量最高,推测orf451参与了榨菜瘤状茎膨大过程中表皮与外皮层多聚糖的水解。本研究为阐明瘤状茎生长发育调控机制提供理论依据。     

金龙胆草查尔酮合酶基因(CHS)的克隆及其在花期不同组织的表达量分析

查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)是植物类黄酮化合物合成的第一关键酶。为了获得金龙胆草(Conyza blinii Lévl.)CHS基因,本研究采用快速扩增cDNA末端(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆得到了金龙胆草CHS基因的DNA和cDNA全长序列,并进行生物信息学分析,通过RTPCR检测该基因在花期不同组织部位中的表达情况并检测对应部位的相对花青素含量。结果表明,获得的CHS基因DNA全长2 098 bp,包括2个内含子;cDNA全长为1 692 bp,含有完整开放阅读框(1 197 bp),编码399个氨基酸,包含查尔酮合酶的标志性序列,命名为CbCHS(GenBank登录号:KJ155749)。序列比对结果显示,金龙胆草CbCHS基因与已报道的其它植物的CHS氨基酸序列具有很高相似性(最高为95%)。半定量RT-PCR结果显示,在叶和茎的表达量最高,相对表达量分别达到87.03%和98.33%,表达量之间没有显著差异(P0.05);在根中CbCHS基因表达量最少,相对表达量仅为9.43%,表达量与其余部位具有显著差异(P0.05)。花青素含量也以茎和叶中最高,根中微量,表明CbCHS基因与花青素的蓄积有一定相关性。本研究首次克隆了金龙胆草CbCHS基因的全长DNA及cDNA序列,研究了其在花期不同组织器官中的表达量差异及与花青素的含量关系,为进一步研究CbCHS基因对金龙胆草黄酮含量的影响及其调控机制提供了基础资料。     

红花花青素还原酶基因ANR的克隆及表达分析

花青素还原酶(ANR)是类黄酮代谢途径下游合成原花青素的关键酶,对花青素含量有一定的负调控作用。为探索ANR基因在红花(Carthamus tinctorius L.)中的序列特征及其与红花花色的关系,采用反转录PCR方法从红花中克隆ANR基因,对其进行生物信息学和系统进化分析,并检测了其在不同花色红花品种的不同组织部位及不同花期的表达量。结果表明,CtANR最长开放阅读框(ORF)为1 020 bp, 编码339个氨基酸,分子量为37 958.28,理论等电点为5.87,为不稳定的亲水性蛋白,属于NADB-Rossmann超家族,二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲组成。CtANR和刺菜蓟ANR的同源性最高,为83.98%,与刺菜蓟ANR的亲缘关系最近,与梅花、欧洲甜樱桃ANR的亲缘关系较远,模体基序相差较大。定量分析表明,红色和白色红花品种中,CtANR基因都是在果球形成初期表达量最低,其次是根和茎中表达量较低,而在花中的表达量相对较高。在花发育的不同时期,红色红花品种中CtANR基因的表达呈现降低-升高-降低的趋势,而白色红花品种中CtANR基因的表达呈现降低-升高的趋势。在不同花色的红花品种中,CtANR基因的表达量在花发育的S1、S3和S5时期差异极显著(P<0.01),S4、苞片、根、叶中差异显著(P<0.05),其他时期与其他组织中差异不显著。本研究为解析红花类黄酮生物合成的分子机制及红花花色相关基因的研究提供了理论基础。     

金柑磷酸蔗糖磷酸酶的基因克隆、表达与蛋白结构分析

磷酸蔗糖磷酸酶（SPP）是植物蔗糖生物合成最后一步催化反应的关键酶，对调控植物生长发育不同时期的蔗糖合成过程有重要作用。为探索金柑（Fortunella crassifiolia Swingle）SPP基因及其编码蛋白的序列特征及其在果实发育过程的表达特性，本研究以四倍体品种脆蜜金柑（F. crassifiolia Swingle cv. Cuimi）为试验材料，采用反转录PCR和cDNA末端快速克隆（RACE）方法从金柑果肉中克隆SPP基因，对其进行生物信息学和原核表达分析，并检测果实发育不同时期该基因在果肉中的表达量。结果表明，FcSPP基因的cDNA序列全长1 638 bp，最长开放阅读框（ORF）为1 191 bp，编码396个氨基酸，理论等电点为6.57，为稳定的亲水性蛋白，二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。FcSPP蛋白含有S6PP和S6PP＿C保守结构域，属于植物磷酸蔗糖磷酸酶家族成员。系统进化分析结果显示，FcSPP蛋白与甜橙SPP同源性最高，在进化树上与拟南芥等双子叶植物SPP划归为一类。此外，本研究构建了FcSPP基因的原核表达载体，诱导表达获得纯化的FcSP...     

小麦核糖体蛋白S15a基因(TaRPS15a)的克隆及其在多子房株系中的时空表达分析

为研究40S核糖体蛋白S15a(ribosomal protein S15a,RPS15a)在小麦多子房性状形成过程中的功能作用,以小麦(Triticum aestivum)多子房近等基因系构建的多子房性状SSH-cDNA文库中与RPS15a基因同源的EST序列为信息探针,采用RT-PCR技术从小麦多子房株系幼穗中克隆获得了RPS15a基因的cDNA与DNA序列,分析了该基因在近等基因系间的表达差异及其在多子房株系中不同时期幼穗和同一发育时期不同组织中的表达模式.结果表明,小麦RPS15a基因的cDNA序列(GenBank登录号:HM055513)长为413 bp,编码131个氨基酸;DNA序列(GenBank登录号:HM063421)长为642 bp,含有3个外显子和2个内含子.半定量RT-PCR分析显示,该基因在多子房株系2～4mm幼穗中的表达量高于单子房株系幼穗;在多子房株系不同时期幼穗中的表达量随着幼穗的发育呈现上升趋势,8～9 mm时表达量达到最高;该基因广泛存在于幼根、茎顶端、幼叶和幼穗组织中,在茎顶端表达量高于其他组织.研究推测RPS15a基因的表达上调,可能与小麦多子房性状的发生有关.     

洋葱花青素合成相关基因(AcPAL1)的克隆和表达分析

苯丙氨酸解氨酶(PAL)作为植物苯丙烷类代谢途径中的关键酶,在其生长发育、抗病抗逆等多种生命进程中起重要作用,是花青素生物合成途径中的第一个酶。为了研究洋葱(Allium cepa L.)PAL基因的生物学功能及其与花青素合成之间的关系,利用不同植物PAL基因设计简并引物,通过RT-PCR和RACE技术克隆洋葱PAL基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KF421110),并对该基因进行序列分析和Real-time PCR表达分析。结果表明,该序列全长2 363 bp,编码包含708个氨基酸残基的蛋白质多肽;Blast分析和系统进化分析表明,该多肽与大蒜(Allium.sativum)、石蒜(Lycoris radiate)PAL蛋白相似性很高,因此被命名为AcPAL1。Real-time PCR表达分析结果表明,AcPAL1基因在白皮、黄皮和红皮洋葱中表达量依次增加;而随着鳞茎的不断膨大,其表达量却不断降低。本实验初步证实了所克隆的洋葱AcPAL1基因与花青素合成相关联,为研究洋葱PAL基因同花青素合成积累之间的关系提供了依据。     

小麦籽粒胚乳淀粉合成酶基因表达及酶活性分析

为研究小麦籽粒淀粉合成酶基因表达与酶活性的特征,选用4个淀粉含量差异较大的普通六倍体小麦新春24、E28（高淀粉含量组）和宁春16、安农9912（低淀粉含量组）为试验材料,采用实时荧光定量RT-PCR ,对灌浆期籽粒淀粉合成酶相关基因的表达进行研究,并对其表达量与相应酶活性的相关性做了分析。结果表明,束缚态淀粉合成酶基因(GBSS)、可溶性淀粉合成酶基因(SSS)、淀粉分支酶基因( SBE)、淀粉去分支酶（DBE）基因均呈单峰曲线变化。利用实时荧光定量PCR技术检测9个基因在不同淀粉含量的4个供试品种花后不同时期的相对表达量,结果表明,花后6d这些基因开始表达,在灌浆的中期（花后12~18d不等）有表达的小高峰,但在不同时期,2个高淀粉含量的品种中各种酶活性及其酶基因的相对表达量均比2个低淀粉含量的品种相对较高;这些基因表达谱与酶活性相关分析显示, 除GBSS外其他几种淀粉合成酶基因均与相应酶活性呈显著或极显著正相关,而且GBSS酶活性到达峰值时间稍迟于DBE、SSS、SBE等酶,说明DBE、SSS、SBE基因可能主要通过转录水平来控制籽粒淀粉的合成,而GBSS基因可能主要通过转录后水平来控制籽粒淀粉的合成。     

花生C4H和ANR基因的克隆与表达研究

通过构建花生未成熟种子cDNA文库,结合大规模EST测序,首次从花生中克隆了原花青素代谢途径上的2个关键酶［肉桂酸-4-羟化酶(C4H)和花青素还原酶(ANR)］基因的全长编码序列。序列分析表明,与其他植物的C4H相比,花生C4H整个编码区高度保守,开放阅读框长度1518bp,编码蛋白长度505个氨基酸,预测的蛋白分子量为57.9kDa,等电点为9.04。花生中ANR开放阅读框长度966bp,编码蛋白长度321个氨基酸,预测的蛋白分子量为35kDa,等电点为8.31。亚细胞定位预测分析表明,C4H定位在线粒体中,ANR则定位在胞外。半定量RT-PCR结果表明,C4H在花生根、茎、叶、花、果针、种子中均有表达,但在茎、叶中表达相对较低,而原花青素合成途径中的关键酶ANR在各个组织中均有表达,其中在果针中表达最强。     

热胁迫下丹参迷迭香酸代谢途径关键酶基因的表达研究

为探索热胁迫对丹参迷迭香酸途径关键酶基因表达的影响,采用定量RT-PCR法,以Actin与GAPDH作为内参基因,0~48h叶片cDNA作为模板,对迷迭香酸途径7个关键酶基因PAL、C4H、4CL、TAT、HPPD、HPPR和RAS的表达进行分析。通过试验结果构建出这7个关键酶基因0~48h代谢途径表达图谱。其中,PAL、C4H和RAS受热胁迫影响表达量下降;TAT、4CL和HPPD表达量呈先上升后下降趋势;HPPR表达量前期变化不大,后期呈下降趋势。结果表明热胁迫对迷迭香酸途径关键酶基因表达有极显著影响。该表达时序谱的建立为进一步研究热胁迫与酚酸类成分累积之间的关系奠定了基础。     

黑果枸杞和宁夏枸杞中黄酮醇合酶基因的克隆及表达分析

黑果枸杞和宁夏枸杞为枸杞属中两种重要的药用植物,具有极大的药用价值。本研究利用转录组数据克隆了黑果枸杞和宁夏枸杞黄酮醇合酶基因（Flavonol synthase,FLS）,分别命名为LrFLS及LbFLS,并通过实时定量PCR（real-time quantitative PCR）分析其在两种枸杞果实四个发育时期中的表达模式。研究结果表明：LrFLS与LbFLS各编码一条由350个氨基酸残基组成的蛋白序列。蛋白序列分析表明：LrFLS、LbFLS相似度高达99%,各含有两个保守的功能域。进化分析表明,LrFLS和LbFLS同属茄科的烟草、马铃薯的FLS蛋白序列相似度最高。实时定量PCR结果表明,LrFLS在S2时期的表达量最高,在果实发育过程中呈现先升高后降低的趋势;而LbFLS在S2时期表达量最低,呈现先降低后升高的趋势。本研究为揭示黄酮醇在黑果枸杞和宁夏枸杞果实中的累积具有一定的启示作用。     

刺五加糖基转移酶基因的表达及其对皂苷含量的影响

为了探明刺五加糖基转移酶基因（glycosyltransferase,GT）的表达特点及其对刺五加总皂苷含量的影响。以GAPDH基因为内参照基因,采用实时定量PCR技术分析了不同产地、不同生长发育时期、不同器官刺五加中GT基因的表达规律及茉莉酸甲酯（MeJA）对其表达的影响。并采用浓硫酸-香草醛比色法测定刺五加总皂苷的含量,利用SPPS17.0软件进行相关性分析。结果表明,GT基因在根、幼茎、叶片和叶柄中均有表达,但表达量差异不显著。刺五加的GT基因在叶片完全展开期的表达量最高,盛花期和果实基本成熟期的表达量最低,仅为叶片完全展开期表达量的66.9%。MeJA处理可显著提高GT基因的表达量（p〈0.05）。不同产地刺五加的GT基因表达量和总皂苷含量差异显著,但GT基因的表达量与总皂苷含量同升同降,存在极显著的正相关关系（p〈0.01）。初步判定,GT基因的表达量决定了刺五加中总皂苷的含量,GT是决定刺五加中总皂苷含量的关键酶。     

甘蓝型油菜沪油15中BnaRAV-2-HY15转录因子的克隆及表达分析

基于拟南芥RAV类转录因子的序列,通过电子克隆的方法获得甘蓝型油菜的BnaRAV-2基因序列,再利用RT-PCR方法从甘蓝型油菜沪油15中扩增出编码RAV类转录因子基因BnaRAV-2-HY15,并进行了序列和进化分析。结果显示,该转录因子基因长1119 bp,编码372个氨基酸,含有相对保守的AP2结合域和B3结构域,具有典型的植物RAV类转录因子的结构特征。BnaRAV-2-HY15 和AtRAV2具有相似的三维结构。采用半定量RT-PCR方法对基因表达水平进行分析,发现BnaRAV-2-HY15受到PEG、高盐和低温的诱导表达。BnaRAV-2-HY15基因在沪油15盛花和籽粒发育时期的根、茎、叶、花、蕾和荚中均检测不到明显的表达。     

结球甘蓝BoFBX117基因的克隆与表达分析

F-box基因在植物组织器官发育及非生物胁迫响应中起着重要的作用。为进一步探讨其作用机制,从结球甘蓝品种BoJF-16-1中利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆得到一个F-box基因BoFBX117,其cDNA全长为936 bp,编码311个氨基酸,蛋白分子量为30.14 kDa,等电点为9.71。该基因编码BoFBP7蛋白,序列同源性分析表明,BoFBP7与芜菁、萝卜、拟南芥的FBP7蛋白亲缘关系较近,同源性分别为99.36%、98.39%、92.26%;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析表明,BoFBX117基因在结球甘蓝莲座叶中最高,其次是根,幼叶中表达量最低,表现出组织特异性;在低温胁迫处理下,该基因表达量总体呈现上升趋势,说明该基因的表达受低温胁迫诱导。推测BoFBX117基因可能在结球甘蓝叶片发育及低温胁迫中发挥重要的生物学功能。本研究为深入解析F-box基因调控植物生长发育及非生物逆境胁迫的分子机制提供了依据。