红比利时杜鹃愈伤悬浮颗粒瞬时转化体系构建及植株再生

为建立红比利时杜鹃花愈伤悬浮颗粒瞬时转化体系,以嫩叶为材料,探讨了愈伤组织诱导与增殖的条件,构建并评价了愈伤悬浮颗粒瞬时转化体系,同时诱导愈伤颗粒出芽、生根,并获得组培小苗。结果表明,在2.41 g·L^-1木本植物基本培养基(WPM)+20 g·L^-1蔗糖+10 g·L^-1麦芽糖+7.0 g·L^-1琼脂+0.050 mg·L^-1植物组培抗菌剂(PPM)为基本培养基的条件下,嫩叶愈伤组织诱导的生长调节剂最优方案为:0.3 mg·L^-1 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+0.3 mg·L^-1 噻重氮苯基脲(TDZ),此时愈化率可达97.78%;愈伤组织继代增殖的生长调节剂方案为:0.61 mg·L^-12,4-二氧苯氧乙酸(2,4-D)+0.65 mg·L^-1 6-苄基腺嘌呤(6-BA)+1.37 mg·L^-1 TDZ,此时增殖率可达167%。将继代5次后呈疏松状的愈伤颗粒接种于液体继代培养基中,大约4~12 d后愈伤颗粒进入指数生长阶段,增殖率为45%。含有GUS基因的pRI 101-AN与含有GFP基因的pCAMBIA1301-GFP分别在农杆菌GV3101介导下转化处于指数生长期的愈伤悬浮颗粒,OD₆₀₀为0.6的农杆菌侵染液侵染15 min后,愈伤颗粒的GUS染色效率为26.28%,愈伤颗粒的GFP荧光表达效果明显。另外,以2.41 g·L^-1 WPM+7 g·L^-1琼脂+20 g·L^-1 蔗糖为基本培养基,添加2.0 mg·L^-1TDZ + 0.5 mg·L^-1 2,4-D时,可诱导愈伤组织不定芽;以1/2 Read为基本培养基,添加0.5 mg·L^-1 IBA+1 g·L^-1活性炭可诱导出芽的愈伤颗粒生根。本研究结果为进一步开展红比利时杜鹃花稳定遗传转化研究和转基因植株培育奠定了基础。     

比利时杜鹃花花青素合成酶基因（RhANS）克隆及其功能分析

花青素合成酶（ANS）是植物花青素合成途径中的关键酶。为探究比利时杜鹃花（Rhododendron hybridum Hort.）ANS基因的功能及表达特性,本研究以比利时杜鹃花不同发育时期花瓣及盛花期的根、茎、叶为试验材料,利用反转录（RT-PCR）和RACE技术克隆RhANS基因cDNA序列;利用超高效液相色谱质谱（Waters UPLC-Qtof）技术分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣中花青素含量;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣和不同器官中ANS基因相对表达量;将RhANS基因重组到原核表达载体（pET-28a）上,并在大肠杆菌（BL21）中进行表达纯化出目的蛋白,并利用高效液相色谱（HPLC）检测目的蛋白RhANS的酶活性。结果表明,从比利时杜鹃花克隆得到RhANS基因cDNA全长序列1 350 bp,开放阅读框（ORF）序列1 074 bp,编码357个氨基酸,含有2-酮戊二酸双加氧酶家族基因结构域2OG-FeⅡ-Oxy;比利时杜鹃花花青素含量随着花的开放呈逐渐上升的变化趋势;RhANS基因表达量在比利时杜鹃花4个花期的花瓣和不同器官（...