棉花GhMYB146基因克隆及亚细胞定位分析

MYB转录因子是发育、代谢、生物和非生物胁迫应答调控网络中的关键因子。为了分析棉花Gh MYB146转录因子的亚细胞定位,通过RT-PCR和RACE方法从棉花纤维中克隆了1个棉花MYB转录因子Gh MYB146的c DNA序列,采用生物信息学方法分析了Gh MYB146的氨基酸序列,构建了Gh MYB146基因的亚细胞定位载体并进行了亚细胞定位分析。结果表明,克隆的R2R3-MYB基因Gh MYB146的c DNA全长1 027 bp,开放阅读框长879 bp,编码292个氨基酸,蛋白质预测分子量约为33.151 k D,等电点为7.9;推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域;Gh MYB146基因组包含3个外显子和2个内含子。进化树分析表明,Gh MYB146和Gh MYB5分为一个分支;亚细胞定位结果表明,Gh MYB146:GFP融合蛋白定位于细胞核中。本试验结果为进一步研究Gh MYB146基因的生物学功能奠定了基础。     

陆地棉GhMYB9基因克隆及结合特性分析

MYB转录因子蛋白普遍存在于植物中,广泛参与植物的生长发育和代谢调控。为研究GhMYB9基因对棉纤维的调控机制,使用PCR方法,从棉花中克隆1个R2R3-MYB基因GhMYB9(Gen Bank登录号:AF336286.1);利用生物信息学方法分析其氨基酸序列;构建酵母表达载体。结果表明,该基因c DNA全长1 145 bp,开放阅读框长795 bp,编码264个氨基酸,预测其蛋白分子量约为29.624 k D,等电点为9.13。推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。GhMYB9基因组包含2个外显子和1个内含子。进化树分析表明,GhMYB9和Gh MYB聚在同一分支(HQ234875.1)。酵母单杂交试验结果表明,GhMYB9转录因子能够特异结合AC顺式作用元件。本研究结果为进一步阐明GhMYB9的生物学功能奠定了基础。     

小麦3个NAC转录因子基因克隆与功能分析

NAC类转录因子参与植物基因在不同条件、不同发育期的表达调控,在植物的发育、生长及对外界的各种生物和非生物因子的胁迫应答中起关键的调控作用。本研究对非亲和条锈菌小种CYR32侵染诱导的抗条锈病基因Yr5近等基因系Taichung29＊6/Yr5的cDNA文库进行筛选及同源克隆,获得了小麦3个NAC类转录因子的cDNA序列。序列分析结果表明,这3个转录因子都具有DNA结合结构域,即NAC结构域,且氨基酸序列在该结构域的A、B、C、D和E5个亚区高度保守;同时发现这3个NAC类转录因子都有核定位信号及相关的转录调控功能区域。通过系统进化树分析,发现其中之一的TaNAC1属于NAC转录因子家族第Ⅰ组的NAP亚组,TaNAC3属于ATAF1亚组,TaNAC5属于NAM亚组;根据系统进化树和相关基因的功能分析,我们推测小麦转录因子TaNAC1、TaNAC3和TaNAC5可能参与植物生长发育调控或对生物、非生物胁迫作出的应答反应。     

森林草莓全基因组WRKY转录因子基因的鉴定与分析

WRKY转录因子是一类重要的调控分子,在高等植物中以基因家族的形式存在。本研究以森林草莓基因组数据为材料,利用生物信息学手段对WRKY转录因子进行全基因组鉴定与分析。结果表明,森林草莓至少有56个WRKY转录因子,蛋白序列长度为58～1982个氨基酸;基因组DNA全长1092～14227bp,具1～20个内含子。染色体定位结果表明,7条染色体上均有WRKY转录因子基因的分布,6号染色体上最多(17),1号染色体分布最少(1)。森林草莓WRKY转录因子可分为3大类,Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类的数量分别为10、34和12,它们处于进化树的不同分支。除保守的WRKYGQK和常见变异序列WRKYGKK外,新发现WKKYGQK、WRKSYFR等WRKY结构域类型。     

甘蔗R2R3-MYB类似基因Sc2RMyb1的克隆及表达特性分析

R2R3-MYB是MYB转录因子基因家族的主要成员,已被证明在次生代谢和非生物逆境胁迫应答中起重要作用。为获得甘蔗(Saccharum complex)R2R3-MYB转录因子基因序列信息及其在不同非生物因子胁迫下的表达情况,本研究通过对甘蔗EST数据的分析,运用电子克隆获得一个甘蔗R2R3-MYB类似基因序列,进而采用PCR方法从甘蔗中克隆了该基因的基因组DNA和cDNA序列,基因命名为Sc2RMyb1(GenBank序列号:JQ823165)。Sc2RMyb1的基因组DNA全长1807bp,由3个外显子和2个内含子构成,编码区长度为1284bp,编码427个氨基酸。构建含有Sc2RMyb1基因的原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichia coli),经IPTG诱导产生的重组蛋白相对分子量约为52kD。在NaCl胁迫的LB培养基上,重组菌生长明显优于对照菌。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗中Sc2RMyb1基因的表达受H2O2和NaCl抑制而下调,推测该基因作为负调节因子参与了NaCl胁迫应答相关基因的调控过程。本研究结果为后续该类转录因子基因在甘蔗抗逆相关机理研究和抗逆育种中的应用提供了基础资料。     

沪油15中两个AP2/ERF-B1亚族转录因子的克隆与分析

利用油菜EST数据库,以拟南芥ERF-B1亚族转录因子序列为探针,电子克隆拼接得到2个cDNA序列（BnaERFB1-1和BnaERFB1-2）,通过PCR和RT-PCR方法分别从甘蓝型油菜沪油15的DNA和cDNA中克隆了上述基因。克隆转录因子BnaERFB1-1-Hy15和BnaERFB1-2-Hy15与电子克隆的序列差异很小,分别只有2个和6个氨基酸位点不同,且都没有内含子。从cDNA序列、氨基酸序列的相似性、组成成分、理化性质、疏水性/亲水性、进化树、序列比对、功能域、二级和三级结构等方面进行了分析,结果显示,BnaERFB1-1-Hy15和BnaERFB1-2-Hy15转录因子属于AP2/ERF家族中的ERF-B1亚族,是亲水性蛋白,在蛋白质的三级结构上与拟南芥atERF7相似。EST丰度分析显示,BnaERFB1-1的表达主要集中在种子中,而BnaERFB1-2的表达则主要集中在分生组织中。     

大豆MYB 转录因子GmMYBZ2 的鉴定、突变分析及原核表达

大豆（Glycine max）GmMYBZ2基因是典型的植物R2R3-MYB转录因子家族成员之一。通过DNAMAN和酵母(Saccharomyces cerevisiae)单杂交系统分别对其蛋白结构和转录活性进行了分析鉴定,并在大肠杆菌(Escherichia coli )中进行了原核表达。GmMYBZ2除含有典型的R2R3-MYB转录因子的结构特征外,在C端含有1个少有的保守氨基酸基序PDLNLELTIS及一个隐藏的锌指结构。基因组序列分析表明,在263～395 bp位含1个132 bp的内含子。为明确GmMYBZ2 C端保守氨基酸基序及锌指结构对目的蛋白转录活性的影响,分别进行了PCR介导的序列删除突变。酵母单杂交系统分析显示,内含子、保守基序及锌指结构对目的蛋白的转录活性均有抑制作用;原核表达显示,目的蛋白能在补充有稀有密码子的大肠杆菌中成功表达。     

毛竹CesA基因鉴定及其表达调控研究

纤维素合成酶(CesA)是纤维素合成的关键酶。为探究毛竹(Phyllostachys edulis)中CesA基因的分子特征、表达模式及其调控关系,本研究采用生物信息学方法对毛竹CesA基因家族成员进行系统分析,基于毛竹RNA-Seq数据和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析CesA在毛竹组织中的表达模式,借助酵母单杂交技术验证转录因子MYB对CesA的调控作用。结果表明,在毛竹中共鉴定21个CesA(PeCesA1~PeCesA21),分别含有8~14个内含子;共线性分析发现19个PeCesAs存在片段复制,且Ka/Ks值均小于1.0。PeCesAs编码蛋白长度为904~1 093 aa,分子量在101.10~123.63 kDa之间,理论等电点为5.95~8.60;亚细胞定位预测所有PeCesAs都定位在质膜上;保守基序分析发现,PeCesAs共含有20个保守基序,均含有CesA家族的特征基序D、D、D和QxxRW。系统发育分析结果表明,毛竹等4个物种的CesA家族52个成员聚类成7个分支。RNA-Seq数据分析结果表明,PeCesAs(PeCesA1/5/10/11/17)在根以及不同高度笋的中部和基部的表达量存在明显差异,而且PeMYB35和PeMYB37均与PeCesA1/5/10/11/17存在较强的共表达关系。qRT-PCR结果进一步证实,随着毛竹笋高度的增加,PeMYB35与PeCesA1/5/10/11/17呈现相似的表达趋势。此外,PeCesA1/5/10/11/17的启动子序列中均包含MYB转录因子的结合位点GAMYB,酵母单杂结果证实PeMYB35能够与PeCesA1启动子中GAMYB元件相结合,可能会进一步调控基因的表达。该结果为研究毛竹中纤维素的生物合成机制提供了参考依据。     

黄瓜果实CsMYB62克隆及其对CsGR-RBP3表达的调控

本研究前期证实,低温诱导的CsGR-RBP3表达与黄瓜果实耐冷性密切相关,但调控其表达的具体机理尚不清楚。为鉴定调控CsGR-RBP3表达的MYB转录因子,本研究采用转录组测序,分析了黄瓜果实在5℃低温处理后的转录组变化,并通过共表达趋势分析,鉴定了与CsGR-RBP3表达趋势一致的MYB基因。结果发现,CsMYB62与CsGR-RBP3表达的相关性很高,且低温处理能诱导黄瓜果实CsMYB62和CsGR-RBP3表达,推测CsMYB62转录因子可能调控CsGR-RBP3表达。为进一步分析CsMYB62基因的功能,从黄瓜果皮中克隆了CsMYB62基因全长序列。结果显示,CsMYB62基因全长834 bp,编码277个氨基酸残基。CsMYB62蛋白含有SANT保守域和MYB DNA结合域,定位在细胞核,在进化过程中高度保守。CsMYB62蛋白具有转录激活活性,能直接绑定到CsGR-RBP3启动子,增强CsGR-RBP3启动子活性,表明CsMYB62通过直接调控CsGR-RBP3表达而增强黄瓜果实耐冷性。本研究结果丰富了MYB调控网络,为进一步解析CsMYB62功能奠定了理论基础。     

月季MYB转录因子基因RcWER-like的克隆及表达分析

MYB转录因子在植物响应盐胁迫过程中起着重要的调控作用。为明确MYB类转录因子RcWER-like生物学功能,本研究以月季月月粉为材料,利用生物信息学分析及实时荧光定量PCR技术研究RcWER-like基因在盐处理、激素处理、盐与激素综合处理下不同组织不同时间点的表达特性。结果表明,依据转录组测序获得的序列信息和月季全基因组信息克隆得到了RcWER-like,该基因全长为882 bp,开放阅读框(ORF)为669 bp,编码223个氨基酸。序列比对发现,RcWER-like在N端具有保守的R2R3-MYB结构域。系统进化树分析结果显示,RcWER-like与桃PpWER-like、梅花PmWER-like、苹果MdWER-like处于同一分支,属于R2R3-MYB类转录因子。实时荧光定量PCR结果表明,RcWER-like基因在盐胁迫处理24 h后表达明显上调,且外施水杨酸和茉莉酸甲酯均可诱导RcWER-like的表达;在盐胁迫下,外施水杨酸和茉莉酸甲酯可诱导RcWER-like的表达,且均高于单独盐或激素处理。此外,月季RcWER-like在盐处理、激素处理、盐与激素综合处理下不同组织不同时间点的表达模式存在显著差异,R2R3-MYB类转录因子RcWER-like参与了月季盐胁迫响应和对水杨酸和茉莉酸甲酯的应答过程,可能在月季高盐胁迫应答中具有重要的作用。本研究结果为月季耐盐分子育种提供了候选基因资源和理论依据。     

白菜NAC转录因子BrcCUC3基因克隆及其对叶缘和主枝发育的影响

植物NAC (矮牵牛NAM基因、拟南芥ATAF1/2和CUC2基因)转录因子CUP-SHAPED COTYLEDON(CUC)亚家族成员在植物茎尖分生组织形态建成、器官边界分离、叶发育方面发挥着重要作用.采用基因同源克隆的方法获得了白菜(Brassica rapa ssp.chinensis)基因BrcCUC3,并转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)做了初步的功能鉴定.研究结果表明,白菜Brc CUC3的编码区长1 008 bp,编码335个氨基酸,基因结构分析显示BrcCUC3包含3个外显子、2个内含子,内含子剪接位点符合GT-AG规则.氨基酸序列分析表明,BrcCUC3蛋白具有典型的植物NAC domain结构域.BrcCUC3编码区氨基酸序列与其它植物的CUC3蛋白有很高的一致性,尤其与甘蓝(Brasica oleracea)、萝卜(Raphanus sativus)和拟南芥CUC3蛋白高度一致,一致性分别达到98％,97％和83％.在不同物种CUC3的系统进化树上,BrcCUC3归属于双子叶植物分支的十字花科亚组,由不同植物20条CUC3编码区氨基酸序列所建立的系统进化树与真实的植物进化基本一致.荧光定量PCR分析结果表明,BrcCUC3在白菜叶深裂株系叶片中的表达量比叶全缘叶片中的高.利用根癌农杆菌(A grobacterium tumefaciens)浸花法转化拟南芥,获得了转BrcCUC3基因的拟南芥植株.过表达BrcCUC3的转基因拟南芥呈现叶缘出现裂刻、主枝增加的新表型.初步说明该基因参与叶形和主枝的发育调控,为揭示白菜叶形发育分子调控机制和通过基因工程创制植物叶形新种质提供分子依据.     

芥蓝BaCSLD的克隆、亚细胞定位及表达分析

为获知芥蓝中类纤维素合成酶基因的序列特征和表达特性,利用RT-PCR技术从芥蓝中扩增获得1个类纤维素合成酶基因全长cDNA序列,命名为BaCSLD (GenBank 登录号:MH491418),对该基因的序列特征、亚细胞定位、组织特异性表达情况进行分析,并通过最大似然法构建系统进化树。结果表明,BaCSLD cDNA序列包含一个2 796 bp的最大开放阅读框,编码931个氨基酸,且BaCSLD属于跨膜蛋白,具有8个跨膜区。BaCSLD与12个物种同源序列在进化树上分为4组,来自十字花科的AtCSLD与BaCSLD处于同一分支,亲缘关系较近的为苦瓜中的McCSLD,而与同属的油菜中的BnCSLD和芜菁中的BrCSLD关系较远。BaCSLD::GFP融合蛋白定位于细胞膜。此外,BaCSLD仅在芥蓝三级花蕾和花中表达。本研究结果为类纤维素合成酶基因功能的深入研究提供了参考。     

巴西橡胶树HbNAC33基因的克隆和表达分析

植物特有的NAC转录因子在植物的生长发育、胁迫应答和激素调节等方面具有重要功能。本研究从橡胶树胶乳cDNA中克隆了HbNAC33基因,生物信息学分析显示该基因的完整开放阅读框（ORF）为1 092 bp,编码363个氨基酸。HbNAC33蛋白的N-端第3～156位氨基酸之间含有一个典型的NAC结构域,酵母试验表明,HbNAC33具有转录激活活性,转录激活区在C-端,具备了NAC转录因子的基本特征。序列比对和系统进化分析表明HbNAC33蛋白属于NAC转录因子家族中的ANAC011亚族。实时荧光定量PCR分析表明,HbNAC33在叶中的表达量显著高于其他部位;割胶,乙烯利（ET）和茉莉酸（JA）处理均能诱导HbNAC33的表达上调。以上结果表明,HbNAC33可能参与植物的生长发育和胁迫应答过程。     

黄瓜、西瓜和南瓜EIN3基因片段的克隆与序列分析

EIN3(ethylene insensitive 3)位于细胞核的核蛋白,为乙烯信号转导的下游调控基因,根据GenBank植物EIN3基因家族的保守序列设计了1对引物,以黄瓜(Cucumis sativus)、西瓜(Citrullus lanatus)和南瓜(Cucurbita maxima)总DNA为模板PCR扩增到3个725bp的基因片段CsEIN3、ClEIN3和CmEIN3,并提交GenBank,登录号分别为AY973275、DQ023225和DQ023224。将片段序列在NCBI数据库中Blastn同源搜寻,显示151条有同源性的序列全部是EIN3基因。NCBI网站的ORF(open reading frame)Finder找到正确的开放式阅读框,翻译成为氨基酸序列,对CsEIN3、ClEIN3及CmEIN3氨基酸序列在NCBI网站进行Blastp比对,在大分子结构数据库(molecular modelling database,MMDB)搜索,3个推测蛋白保守结构域三级结构与拟南芥EIN3的DNA结合域(MMDB:30598;PDB:1WIJ)完全相同,系统进化分析表明,黄瓜、西瓜和南瓜与双子叶植物甜瓜、绿豆、蒺藜状苜蓿、烟草、番茄、拟南芥及单子叶水稻、桃红蝴蝶兰等的EIN3家族成员都有较高的相似性。     

红掌AaMYB1基因的克隆、表达及异源转化研究

MYB类转录因子在植物观赏器官色彩形成中发挥关键作用。为了研究红掌中该类转录因子的种类、表达、作用机理等,本研究从红掌中获得了一个MYB转录因子的基因序列,通过反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)、生物信息学软件分析、荧光定量PCR检测、构建超表达载体并异源转化烟草等手段,对该转录因子进行了初步研究。结果表明,该转录因子编码基因包含完整编码区,共计912 bp,编码303个氨基酸残基,序列组成与其他物种同源体具有高度相似性;荧光定量分析显示,Aa MYB1在红掌不同组织部位都有表达,但在苞片中表达量最高;获得了12株阳性转化株,形态观察发现转化株营养器官花色素累积程度随基因表达不同而异,但可使所有转化株花器官颜色显著加深。本研究结果为进一步探究MYB转录因子在红掌中调控花色素合成等信息提供了有益参考。     

辣椒BES1基因家族鉴定及表达分析

BES1基因是油菜素内酯信号途径中的关键转录因子。为了解辣椒中BES1基因家族功能,以已测序辣椒CM334为试验材料,根据已公布辣椒基因组数据,本研究利用生物信息学方法对辣椒BES1基因家族进行鉴定,并对基因结构、结构域、系统进化关系、基因表达模式和生物非生物胁迫表达情况进行分析。结果表明,辣椒中有9个候选BES1基因,根据BES1基因结构可将其分为ClassⅠ和ClassⅡ 2大类,Class Ⅰ 和 Class Ⅱ 在结构上差异较大。辣椒BES1编码蛋白介于181~713个氨基酸范围内,分子量为20.22~78.23 kDa,等电点介于5.48~9.23。转录组数据分析发现,辣椒BES1基因在辣椒中表达具有差异性。在脱落酸、低温、高温、茉莉酸甲酯和疫病胁迫下CA04g20150和CA12g17430均被诱导上调,表明其在生物和非生物胁迫中发挥作用。本研究结果为进一步探究BES1基因家族调控植物抗逆的分子机制奠定了基础。     

番茄果实中LeERFl、LeERF2基因的克隆及序列分析

乙烯反应元件结合蛋白属于植物特有的一个转录因子家族,这个家族保守的DNA结合域称为ERF结构域.根据对番茄(Lycopersicon esculenturm)和其它植物物种中EREBP基因家族的同源性比较,在保守区(ERF区域)设计合成一对简并引物,通过RT-PCR扩增得到一个114bp的片段,用此片段作探针筛选番茄cDNA文库(粉红期),得到两个基因LeERFl和LeERF2.通过BLAST工具在GenBank中搜索表明,LeERFl和LeERF2基因属于EREBP家族,LeERFl与EREBP-4和DDTFRl0/A在氨基酸水平上的序列相似性为35%,LeERF2与EREBP-3和pti5在氨基酸水平上的序列相似性为46%,是新的基因.LeERFl和LeERF2的核酸序列在GenBank发表,登录号分别为AY077626和AY275554.     

猕猴桃AdMSD1和AdMSD2的克隆及其在果实后熟软化中的表达

锰超氧化物歧化酶(MnSOD)在植物生长发育与衰老及应对逆境胁迫中发挥重要作用。为探究MnSOD基因在猕猴桃果实后熟软化及采后贮藏过程的作用,本研究以米良1号猕猴桃为试材,克隆了2个MnSOD基因,分别命名为AdMSD1和AdMSD2。AdMSD1包含675 bp的开放阅读框(ORF),编码224个氨基酸,登录号为KY471358;AdMSD2包含690 bp的ORF,编码229个氨基酸,登录号为KY471359。生物信息学分析结果表明,AdMSD1和AdMSD2均编码稳定的碱性亲水蛋白,包含保守金属结合域DVWEHAYY、Mn²⁺金属结合位点和特征氨基酸。AdMSD1和AdMSD2均由6个外显子和5个内含子组成。进化树结果显示,2个蛋白聚在双子叶植物组的不同分支,属于MnSOD家族的不同成员。定量分析结果表明,AdMSD1在叶片的转录水平最高,在花中的转录水平最低;AdMSD2在花中的转录水平最高,在成熟果中的转录水平最低。2个基因在果实后熟软化过程的转录呈动态变化,但均在软化初期上调,软化Ⅰ期和Ⅱ期下调,进入软化Ⅲ期后再次回升。果实中AdMSD1和AdMSD2的转录水平均在低温贮藏过程中下降。AdMSD1在脱落酸处理的第1和第5天表达上调,而AdMSD2在脱落酸处理后表达下调;AdMSD1在赤霉素处理后表达下调,而AdMSD2在赤霉素处理的第1天表达上调,之后下调。研究结果表明,AdMSDs基因参与猕猴桃果实的后熟软化和采后贮藏过程,为进一步研究SOD在猕猴桃果实采后品质调控中的作用机制奠定了基础。     

果梅NAC基因家族的鉴定及组织表达分析

为挖掘果梅中NAC基因成员,探讨其组织表达特异性,本研究采用生物信息学方法鉴定了果梅NAC基因家族,并对其理化性质、染色体分布、亚细胞定位、保守基序、蛋白结构和亚族分类进行预测分析。结果表明,果梅NAC基因家族包含106个NAC基因成员,根据系统发育特征将其分为12个亚族。PmNAC基因在果梅的8条染色体上呈现不均匀分布,多编码酸性氨基酸;大部分NAC蛋白为亲水蛋白,其二级结构多以无规则卷曲为主要构成元件,且三级结构相似;亚细胞定位预测显示,果梅NAC蛋白为典型的核蛋白。选取12个NAC基因家族成员,利用实时荧光定量PCR技术进行组织表达分析,结果表明,12个果梅NAC基因在不同组织中均有表达,但表达差异明显。其中3个基因(PmNAC54、PmNAC32、PmNAC68)在果皮中表达最高,4个基因(PmNAC60、PmNAC95、PmNAC51、PmNAC2)在果肉中表达最高,3个基因(PmNAC31、PmNAC62、PmNAC48)在嫩茎中表达最高,其余2个基因(PmNAC61和PmNAC71)分别在果胚和花芽中具有最高的表达,表达特征的差异表明它们可能具有不同的生物学功能。本研究结果为果梅NAC蛋白的进一步功能分析奠定了一定的理论基础。