培养方法对土壤可培养细菌多样性的影响

提高土壤微生物的可培养性,获得纯培养微生物菌株,是微生物生态学研究的基础。采用三种培养基对土壤细菌进行分时段计数,以细菌通用引物扩增细菌16S rDNA片段,用限制性内切酶HhaI酶切PCR产物,对酶切图谱进行分型,研究不同培养方法对土壤细菌多样性和可培养的影响。结果表明,LB、CSEA、W SA培养基192 h后每g干土获得的细菌数量分别为14.84×107、10.27×107和6.91×107CFU,但微生物多样性指数以W SA为最高,LB多样性指数最低;三种培养基培养的细菌菌群有一定的相似性,LB和CSEA培养基间的Jaccard指数为57.69%,LB和W SA培养基之间为53.13%,而CSEA和W SA培养基的相似性指数达66.67%;16S rDNA测序结果表明,所获得的土壤细菌优势种群在分类方面主要属于γ-和β-变形杆菌以及放线菌亚门,其中某些OTUs中的16S rDNA序列与Burkholderiaceae bacterium、Rhodococcus和Mycobac-terium属具有较高的同源性,推测其细胞能够分泌复苏促进因子,有效地提高土壤细菌的可培养性。     

不同栽培环境下有机与常规蔬菜土壤的细菌群落多样性差异

土壤细菌群落在蔬菜栽培中发挥着重要作用。基于DNA和RNA水平,利用PCR-DGGE技术研究了不同栽培环境下有机与常规蔬菜土壤细菌群落多样性差异,以及土壤理化性质与细菌群落多样性的关系。结果表明：不同栽培方式下土壤细菌多样性存在明显差异,土壤微生物的优势种群和数量受有机、常规栽培和季节影响,有机栽培较之常规栽培能够显著增加土壤细菌群落多样性;聚类分析表明,16S rDNA细菌群落多样性与季节相关,而16S rRNA细菌群落多样性与栽培方式相关;差异条带测序显示,大多细菌与不可培养细菌种属有较高同源性,其余9种推测属于假单胞菌属;CCA分析说明pH是影响土壤细菌群落多样性的主要因素,有机栽培土壤中微生物生物量C、N以及有机质含量显著高于常规栽培土壤。综上,有机栽培能够丰富活性细菌群落多样性,具有土壤优化效应。     

PCR-RFLP技术分析沼气池厌氧活性污泥细菌的多样性

应用PCR-RFLP和rRNA分析法研究了户用沼气池厌氧活性污泥细菌的多样性。采用直接提取法提取了户用沼气池微生物宏基因组DNA,构建了细菌的16S rDNA克隆文库。随机挑取了144个准确含有16S rDNA的阳性克隆进行PCR-RFLP分析,聚类得到46个OTUs（operational taxonomic units）,其中3个OTUs是优势类群,分别占14％,10％和9％,21个OTUs只含有单个克隆。随机挑取了26个克隆进行测序,并构建了系统发育进化树。结果表明：农村户用沼气池中细菌种类较为丰富,占优势的类群分别为Firmicutes（28％）、Delta-proteobacteria（18％）和Bacteroidetes（17％）,大多数16S rDNA序列与GenBank数据库中未培养细菌相似性最高（91％～99％）,为进一步研究、利用沼气池能源提供了基础资料。     

红壤荒草地氨氧化细菌富集液16SrDNA文库的RFLP分析

分析红壤荒草地富集液中氨氧化细菌的种群组成,选取氨氧化细菌16S rDNA特异性引物序列,利用PCR技术对从富集液中抽提的细菌总DNA进行扩增,并建立了氨氧化细菌特异性的16S rDNA文库。用酶HhaⅠ和RsaⅠ对该文库特异性片段进行了限制性酶切片断长度多态性分析(Restriction fragment lengthpolymorphism,RFLP),随机挑选的35个特异性克隆片段被分成3个不同的RFLP类型,其中优势型占了所有分析克隆子的94%,另两个型各占3%。从每个RFLP类型中挑取一定的转化子进行测序,测序结果经GenBank检索,发现在该富集液体系文库中存在大量亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)细菌序列,由此推测红壤荒草地中存在氨氧化细菌,Nitrosomonas属细菌能在富集条件下成为优势菌。     

油井采出液中微生物群落结构的T-RFLP分析

应用末端标记限制性片段长度多态性(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism,T-RFLP)和克隆文库分析,以微生物群落16SrRNA基因(16S rDNA)为目标,对大庆油田过渡带油井采出液(于2005年7月和10月取样)中的微生物群落结构进行了解析和比较。T-RFLP分析表明,2005年7月和10月油井采出液中古菌群落结构较为单一,随时间变化不大;而细菌群落结构较为复杂,不同时间群落中的优势菌有明显的差别。古菌和细菌16S rDNA片段测序和系统发育分析表明,大庆油田过渡带油井采出液古菌群落中的优势菌均为产甲烷菌;细菌群落中的优势菌则与β、γ、δ、ε变形杆菌(Proteobacteria)、拟杆菌(Bacte-roidetes)和脱铁杆菌(Deferribacteres)有较高的相似性,细菌群落中检出了大量的未培养微生物(Deep-branching lineages)。     

西藏高原土壤中可培养细菌群落结构分析

以4个西藏高海拔(4 056～5 015 m)高原土壤为材料,经室内恒温短期碳源富集培养后,建立4个土壤可培养细菌库.采用细菌16S rDNA的序列分析技术测定供试土壤可培养细菌库的群落结构特征.结果表明,从XZ02、XZ06、XZ08和XZ12共4个土样的细菌库中,分别获得21,37,31,32个细菌的16S rDNA序列,共产生45个OTU类型.不同样品产生的OTU类型个数和种类有差异,不同样品之间存在共有的优势OTU,但比例不同.多样性指数分析表明,XZ08的Shannon-Wiener指数(H’)和物种丰富度指数(dMa)均为最大,XZ02的辛普森指数(Simpson index,Ds)和物种均匀度指数(E)均为最大,表明不同土壤可培养细菌的多样性指数大小不同;PCA分析表明,XZ06和XZ12群落结构相近,XZ02和XZ08与其群落结构差异大.典型OTU进化定位分析表明,4个土样的细菌主要分布在厚壁菌门和变形菌门中,XZ02和XZ12以芽孢杆菌为主,而XZ02和XZ12以芽孢杆菌和假单胞菌为主.不同采样点土壤的可培养细菌群落结构多样性和分布上均有差异.     

天目山毛竹入侵阔叶林后土壤细菌群落16S rDNA V3区片段PCR的DGGE分析

天目山国家级自然保护区是公认的基因库。毛竹入侵天然林并替代原天然林,导致地上植物多样性下降。为了解毛竹入侵天然林后地下土壤微生物多样性的变化,分别采集了毛竹纯林、竹阔混交林和原始天然阔叶林下的土壤样品,应用建立于16S rDNA V3区片段的变性梯度凝胶电泳(DGGE)和克隆测序比对来研究土壤细菌结构的变化。结果表明,3块林地土壤16S rDNA V3区片段高达30条以上,不同林分下土壤16SrDNAV3区片段的DGGE带谱差异不大,但各有特征条带。毛竹林与阔叶林土壤的细菌结构相似度高于其与竹阔混交林的相似度。通过DGGE条带的克隆测序比对发现,调查区土壤细菌主要属于变形菌门(Proteobacterium)、厚壁菌门(Firmicutes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线细菌属(Actinobacterium)和一些未命名的菌种,并且多数属无法纯培养的物种。本试验结论为:天目山自然保护区内土壤细菌多样性丰富,不同林分下的土壤细菌有各自的特征种,但非优势种;毛竹入侵未导致土壤细菌结构以及多样性发生显著变化。     

土壤微生物总DNA提取方法的比较

采用4种土壤DNA提取方法提取了5种类型土壤的微生物总DNA，并对4种提取方法的DNA提取效果进行综合分析，进一步通过PCR—DGGE扩增提取DNA中的细菌16S rDNA片段，并对扩增产物进行DGGE电泳分析。结果表明，SDS-高盐缓冲液法抽提的DNA得率最高，SDS-酚氯仿抽提法的DNA得率最低。DNA的纯度，以BIO-101 DNA Extraction Kit试剂盒法最高，改进试剂盒法纯度最低。通过PCR-DGGE分析土壤微生物多样性结果表明，BIO-101 DNA Extraction Kit试剂盒法提取的DNA代表的微生物多样性最全，而SDS酚氯仿法抽提的DNA代表性最差。     

转Bt基因棉花根际细菌与古菌群落结构分析

在一年内棉花的四个生长时期（苗期,蕾期,花铃期,吐絮期）分别采集转Bt基因抗虫棉GK12和非转基因亲本棉花泗棉3号根际土壤,以及未种植棉花的背景土壤,利用末端标记限制性片段长度多态性（T-RFLP）分析技术,分析三种土壤中细菌和古菌的16S rRNA基因片段多态性,结合克隆文库建立和测序,研究了土壤中细菌和古菌群落结构的变化.结果表明：在棉花生长的各个时期,背景土壤中细菌群落结构发生了明显的变化,生物多样性指数明显降低,古菌群落结构也有一定的变化,说明季节性变化对土壤中微生物群落产生了明显的影响.与背景土壤相比,棉花种植后根际土壤中细菌和古菌群落发生显著的变化.转基因棉花与非转基因棉花相比,根际土壤细菌和古菌的种类和种群大小的分布也发生了明显的改变.克隆文库和测序结果表明土壤中主体微生物为目前未培养的、功能特性未知的细菌和古菌,转基因棉花种植对这些细菌和古菌影响的原因、环境危害和生态风险目前尚不清楚.与古菌群落相比,棉花种植对细菌群落结构的影响较小.     

丁草胺和毒死蜱复合污染对稻田土壤细菌群落多样性的影响

采用PCR—RFLP法研究了丁草胺和毒死蜱复合污染对土壤细菌多样性的影响。应用试剂盒提取土壤样品总DNA,以细菌的16SrDNA通用引物27F／1492R扩增16SrDNA片段,将扩增产物与T－载体酶连,转化大肠杆菌,建立16SrDNA克隆文库。阳性克隆子用限制性内切酶HhaI-RsaI消化,获得酶切指纹图。结果表明,通过双酶切分型,对照产生带型最多,有70种类型,其余处理OTU种类均比对照有所减少,分别减少了10、30和41种。在不同处理中其多样性存在差异。对照土壤环境中细菌种类最丰富,多样性最高,且基因型中无明显的优势类群,说明农药的外源喷施会引起土壤细菌多样性降低。处理Ⅲ的Shannon—Wiener指数、Simpson指数和丰富度都低于单一农药的处理,而均匀度非常高,说明这2种农药的复合施用对一些细菌的丧失会起协同作用,造成某些土壤细菌的富集。     

黄瓜连作土壤微生物区系变化研究

研究了黄瓜根部土壤主要微生物类群随连作茬次的反应,并着重用变性梯度凝胶电泳(DGGE)监测黄瓜根际未培养优势菌群的动态变化。结果表明:随着连作茬次增加,土壤可培养微生物数量减少,其中细菌数量降低更为明显,对连作表现出较高的敏感性,放线菌对黄瓜连作反应稍滞后,至第三茬时开始呈现降低趋势。黄瓜连作致使少数真菌种群富集,同时多种真菌类群数量减少,种群变化呈现单一化趋势,多样性水平降低。DGGE分析结果表明黄瓜连作引起根际Bacillus sp.、Pseudom onas sp.和另一未培养细菌种群数量减少,而同时引起Sphingom onas sp.类群数量增加。实验结果暗示,黄瓜连作破坏根部微生物种群生态平衡,使其多样性水平降低。     

土壤微生物多样性研究的新方法

传统的分离培养和鉴定土壤微生物方法所具有的困难性和局限性 ,是造成难以深入了解土壤微生物生态学特性和多样性组成方面的主要障碍。本文运用分子生物学技术 ,以澳大利亚两种主要森林类型的土壤微生物多样性研究为实例 ,介绍了从土壤中直接提取土壤微生物DNA的方法以及末端限制性酶切片段长度多态性 (T RFLP)分析的基本原理和方法。作者认为 ,用该方法提取的土壤真菌DNA的纯度高 ,完全适合PCR扩增和T RFLP分析的要求。T RFLP已成为国外深入研究土壤微生物多样性的理想方法之一     

Diversity of rhizosphere bacteria associated with different soybean cultivars in two soil conditions

Aiming at learning the effects of soil conditions and cultivar on the bacterial diversity in the rhizosphere of soybean (Glycine max(L.) Merr.), bacterial communities associated with four soybean cultivars grown in two soils were revealed by terminal-restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) combined with sequencing analysis of a 16S rDNA clone library. Lower bacteria diversity was found in soil A which has higher salinity and nutrient contents, while the highest bacterial diversity was found in the rhizosphere of cv. Jidou 12 in both soils. These results revealed that both the soil conditions and soybean cultivar affected the community composition of rhizosphere bacteria, but the effect of soil conditions was greater than that of soybean cultivar as demonstrated by the principal component analysis. It also revealed that the abundant rhizosphere bacteria may also the main symbiotic or non-symbiotic nodule endophytes.     

梭梭和柽柳土壤微生物多样性初步分析

直接从沙漠土壤中提取混合微生物DNA,利用Illuminamiseq测序平台,对16S r DNA进行测序和分析。结果表明:1荒漠植被土壤微生物数量很少,生物活性极弱,DNA提取难度大;2沙漠植被土壤细菌多样性丰富,所有测得细菌分属到23个门和316个属,其中还存在一定数量的微生物新种,部分测得代表新属和种的序列提交Gen Bank,获得序列号(KT984242~KT984249);3不同沙漠土壤样品微生物群落有相似性,但也有较明显的差异,其差异与土壤理化因子等因素有关:如土壤含水量与酸杆菌和变形菌的分布相关;相对于空地,梭梭和柽柳群落土壤独有的迷踪菌门(Elusimicrobia)与固氮菌密切相关;梭梭的土壤环境p H明显高于柽柳土壤环境这决定了它们不同的优势种;土壤微生物生物量碳的大小不能反映微生物量的种类多少,但可以反映微生物数量的多少。     

转Chi＋Glu双价基因棉对土壤微生物群落功能多样性的影响

为研究转Chi＋Glu双价基因棉对土壤微生物群落功能多样性的影响,揭示其对土壤生态系统的安全性,在大田试验条件下,利用Biolog代谢指纹方法分析了种植转Chi＋Glu双价基因棉、转Bt基因棉和常规棉不同生育期土壤微生物群落功能多样性。结果表明,两个转基因棉花土壤微生物数量差异不显著,而转基因棉花土壤细菌和放线菌数量在花期和铃期显著高于常规棉花（P〈0.05）,真菌数量在花期和铃期却显著低于常规棉花（P〈0.05）。与非转基因棉花相比,转基因棉花土壤微生物群落碳源利用能力在花期和铃期显著增加,转基因棉花土壤微生物群落的Shannon指数和McIntosh指数在花期、铃期和吐絮期显著高于常规棉花,Simpson指数在花期和铃期则显著低于常规棉花。主成分分析结果显示,花期转基因棉花和常规棉花对31种碳源的利用差异较大。转基因棉花在苗期和蕾期对羧酸类、氨基酸类和多胺类,花期和铃期对糖类、羧酸类和双亲化合物类的利用分别较常规棉高;吐絮期转基因和常规棉花对所有碳源的利用均较低,其中转基因棉花对糖类和羧酸类的利用高于常规棉花。研究结果显示,种植转Chi＋Glu双价基因棉花在花期和铃期对土壤微生物群落影响显著,其与转Bt基因棉花无明显差异。     

Geographical variation of foxtail millet, Setaria italica (L.) P. Beauv. based on rDNA PCR–RFLP

The rDNA PCR–RFLP of foxtail millet (Setaria italica) germ-plasm collected throughout Eurasia and from a part of Africa was investigated with five restriction enzymes according to our previous study. Foxtail millet germ-plasms were classified by length of the rDNA IGS and RFLP; clear geographical differentiation was observed between East Asia, the Nansei Islands of Japan-Taiwan-the Philippines area, South Asia and Afghanistan-Pakistan. We also found evidence of migration of foxtail millet landraces between the areas. We calculated diversity index (D) for each region and found that center of diversity of this millet is East Asia such as China, Korea and Japan.     

Comparisons of different hypervariable regions of rrs genes for fingerprinting of microbial communities in paddy soils

The use of molecular approaches based on 16S rDNA-PCR in microbial ecology has revealed a tremendous prokaryotic diversity in environmental samples. However, there is little or no systematic evaluation of the impacts of hypervariable (V) regions of rrs genes choice on microbial community analysis in soil samples, especially the detailed information about the dominant groups preferentially amplified by different primer pairs. In the present study, eight primer pairs were detected to compare the different V regions for fingerprinting microbial communities in a paddy soil irrigated with petroleum-wastewater, using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) techniques. Results reveal the obvious PCR bias produced by different V regions. Both ARDRA analysis of 16S rDNA clone library and DGGE suggest that V₁-V₃ region amplified with primer pair 8f-519r produced the most informative fingerprinting profiles. Additionally, V₃-V₅ region amplified with 341f-907r was another preferable choice for microbial diversity in petroleum-contaminated soil. The V₄-V₅ region and single V region (V₁, V₃, and V₈) were not recommended for the future study of microbial diversity in soil samples. Phylogenetic analysis of 123 sequences from libraries constructed by amplicons generated from six different V regions suggests that different dominant groups were amplified with distinct primer sets. In detail, V₁-V₃ library (amplified with 8f-519r) and V₃-V₅ library were dominated by Actinobacteria (20.4%) (particularly in genus Arthrobacter), V₁-V₃ library (amplified with 63f-518r) was dominated by γ-Proteobacteria (25.0%) and α-Proteobacteria (22.0%) (particularly in genus Brevundimonas), V₃ library was dominated by β-Proteobacteria (22.3%) (particularly in genus Gallionella) and α-Proteobacteria (20.0%), V₆-V₈ library was dominated by Chlamydiae (20.4%) and β-Proteobacteria (20.4%), V₈ library was dominated by γ-Proteobacteria (27.2%) (particularly in genus Acinetobacter) and β-Proteobacteria (14.0%). The present work strongly recommends that primer pairs should be chosen cautiously in community diversity analysis based on PCR amplification of 16S rDNA, and involving at least two different 16S rDNA universal primer pairs would perform better.