睾丸酮丛毛单胞菌活化因子基因的质粒载体构建及表达

提取睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)的基因组DNA，利用PCR扩增activator基因，将扩增产物克隆到pKtac1(含强启动子tac)中，构建重组质粒pKtac1-act1和 pKtac1-act2。经酶切分析和测序，鉴定出正确的重组质粒pKtac1-act1和 pKtac1-act2。将重组质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli)HB101中，用酶联免疫分析方法测定细菌总蛋白质中的activator表达量；将pAX1(含3α-HSD/CR基因)分别和重组质粒(pKtac1-act1和pKtac1-act2)一起转化入E. coli HB101中，测定细菌总蛋白质中的3α-HSD/CR和activator的表达量。结果表明：重组质粒能明显提高activator的表达；pAX1与重组质粒共转化的蛋白质粗提物中，activator和3α-HSD/CR的表达量都显著提高。     

不同-10区保守序列的tac启动子表达睾丸酮丛毛单胞菌中的活化因子

提取睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）的基因组DNA,利用PCR扩增活化因子（activator）基因.将扩增产物克隆到pKtac1（含强启动子tac）中,构建含全长activator基因（564bp）的重组质粒pKtac1-act1和含部分activator基因（409bp）的pKtac1-act2.测序结果发现重组质粒pKtac1-act2的tac启动子-10保守区由TATAAT突变为TATGTT.将pKtac1-act1和pKtac1-act2分别进行酶切和连接,获得重组质粒pKtac1-act3（含启动子-10保守区为TATAAT,409 bp的部分activator基因）和pKtac1-act4（含启动子-10保守区为TATGTT,564 bp的全长activator基因）.将4个重组质粒分别转化入宿主菌Escherichia coli HB101中,用酶联免疫分析方法测定细菌总蛋白质中的activator表达量;将pAX1（含3α-hsd/CR基因）分别和4个重组质粒一起转化入宿主菌E.coliHB101中,测定细菌总蛋白质中的3α-hsd/CR和activator的表达量.结果表明：启动子-10保守区为TATAAT的质粒比-10保守区为TATGTT的质粒有更高的转录活性;过量的actvitor表达可能影响质粒pKtac1-act3表达的稳定性;启动子-10区保守序列的下降突变（pKtac1-act2,TATAAT→TATGTT）及tac启动子的丢失（pKtac1-act3,继代培养4次）揭示了宿主菌E. coli HB101的自身防护机制.     

tac启动子碱基突变对睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)降解能力的影响

应用PCR技术将发生突变的tac启动子-10区（TATGTT）回复突变为TATATT和TATGAT,构建了两个重组质粒pPM1、pPM2,酶切结果发现pPM1质粒转化大肠杆菌后部分细菌对tac启动子进行切除。将重组质粒分别与pAX1共转化大肠杆菌,提取细菌总蛋白,酶联免疫吸附法测定细菌总蛋白中activator及3α-HSD的表达量,结果表明tac启动子-10保守区为TATATT的质粒比-10保守区为TATGAT的质粒具有更高的转录活性,activator及3α-HSD的表达量高低依次均为pPM1＞pPM2＞pb。根据同源重组原理构建突变菌,并利用HPLC测定了各突变菌对睾凡酮的降解能力,结果表明不同突变菌对睾凡酮的降解能力高低依次为Cp7（C.T.+ pPM1）> Cp4（C.T.+pPM2）> Cb7（C.T.+pb）>C.T.。     

睾丸酮丛毛单胞菌工程菌构建及稳定性分析

本研究根据同源重组原理,利用电穿孔法将重组质粒pKtac1-act1和pKtac1-act2分别转化睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）,经PCR和Southern blot筛选获得2株睾丸酮丛毛单胞菌基因工程菌。对这两株基因工程菌的关键酶3α-羟基类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶（3α-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase,3α-HSD/CR）表达情况和细菌稳定性的分析结果表明：两株基因工程菌在没有诱导剂诱导的情况下,其3α-HSD/CR的表达量比原始菌提高了近20倍。添加抗生素进行培养,两株工程菌的activator和3α-HSD/CR表达均较稳定;而在不添加抗生素的培养基上培养时,两株工程菌的activator和3α-HSD/CR的表达变化较大,蛋白总体表达水平比添加抗生素时低。研究结果可以初步推断,3α-HSD/CR的表达受activator基因的表达调控。     

猪繁殖与呼吸综合症病毒ORF5基因的融合表达

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus , PRRSV)ORF5基因的核苷酸序列设计3对特异性引物，从重组质粒pMD- ORF5中扩增去除ORF5基因中包括全部信号肽在内的N端跨膜区(28 residues)和中部跨膜区(60 residues)。改造后的ORF5基因分别命名为ORF5-1和 ORF5-2。将2个基因片段定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-ORF5-1和pET-ORF5-2,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导表达和SDS-PAGE电泳分析，ORF5-1和ORF5-2基因获得融合表达，表达量分别为12.2%和39%，证明删除双跨膜区能明显提高ORF5基因的表达量。经Western blot分析，融合蛋白具有一定的免疫学活性，表明摘除跨膜区对该蛋白的抗原性影响不大。     

番茄Metacaspase基因(LeM)的克隆及其在大肠杆菌Rosetta中的高效表达

为获得可溶性的番茄Metacaspase蛋白,后续研究Metacaspase蛋白的酶学特性以及功能,利用RT-PCR方法克隆了番茄(Lycopersicon esculentum)中Metacaspase(LeM)全长cDNA,并成功地构建了LeM基因的原核表达载体重组质粒pET28a-LeM,转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)PlysS和Rosetta中进行诱导表达,并对诱导表达条件进行了优化.SDS-PAGE结果显示,在37℃条件下,1 mmol/L IPTG诱导表达量最高,在BL21(DE3)PlysS菌株中重组蛋白主要以包涵体形式存在,而相同条件下在Rosetta菌株中多为可溶性表达.同时酶活测定显示,Rosetta上清中LeM的活性为33 RFU/min,显著高于BL21(DE3)PlysS 7RFU/min.本实验表明,不同菌株对Metacaspase的可溶性表达有很大影响.     

Lactobacillus reuteri PYR8亚油酸异构酶基因在大肠杆菌中的表达与活性检测

以Lactobacillus reuteri PYR8菌株基因组为模板,利用PCR方法扩增出亚油酸异构酶(linoleate isomerase,LI)基因,亚克隆到pET30a中构建原核表达载体pET30a-LI,并转化入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中。其重组菌株在37℃条件下,经1.0mmol/L IPTG诱导表达重组LI蛋白,该蛋白以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的39.2%。采用Ni2 -NTA柱上复性法获得有活性的纯化重组亚油酸异构酶,其比活力5.12U/mg,是天然亚油酸异构酶比活力的2.5倍。     

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白5'端基因重组腺病毒的构建及其免疫特性

RT-PCR扩增出猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV）S蛋白基因5'端包含 B、C抗原位点的1.0 kb DNA片段,并与穿梭载体pShuttle-CMV连接;然后与腺病毒（Adenovirus）骨架载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌（Escherichia coli）BJ5183,通过同源重组获得重组腺病毒质粒。该重组腺病毒质粒转染HEK293细胞并进行噬斑纯化,获得了1株含有TGEV S蛋白5'端基因的重组人复制缺陷型血清5型腺病毒rAd-TGEV-S。随后用RT-PCR和间接免疫荧光（indirect immunofluorescent assay, IFA）检测目的基因的转录与表达。重组腺病毒rAd-TGEV-S在HEK293细胞连续传代9次后,病毒效价稳定,滴度平均为107. 7TCID50/mL。动物免疫试验显示, rAd-TGEV-S可以诱导小鼠产生TGEV特异性IgG和IgA。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV） BJ-4株ORF2基因的原核表达

通过PCR方法从重组质粒pGEM-ORF2扩增得到缺失N端疏水序列的基因片段dORF2(deleting ORF2)。将dORF2克隆至原核高效表达载体pGEX-4T-2，在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21细胞中成功地表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组蛋白GST-dORF2，表达量为22％。Westem-blot结果表明重组蛋白可被谷胱甘肽S-转移酶(GST)抗体识别。表达的重组蛋白为进一步研究PRRSV次要结构蛋白的结构和功能奠定了基础。     

鸡白介素-2基因在大肠杆菌中表达及多克隆抗体制备*

将编码鸡(Gallus gallus)白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)蛋白的基因亚克隆到大肠杆菌(Eschetichia coli)原核表达载体pPROEX^HT中，构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌DH5α并用IFTG于37℃诱导培养。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达的鸡IL-2融合蛋白分子量约为19kD。融合蛋白经薄层扫描发现目的蛋白表达量约占菌体蛋白的30％。包涵体被6mol／L，盐酸胍裂解后，通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡IL-2融合蛋白及其纯化产物免疫家兔，制备兔抗鸡IL-2多克隆抗血清，并用琼脂扩散实验对多克隆抗血清进行鉴定，表明其与纯化的重组鸡IL-2蛋白具有良好的反应性，而且该反应是特异的。     

香蕉条斑病毒ORFⅠ、ORFⅡ在大肠杆菌中的原核表达和自激活特性的鉴定

目前,香蕉条斑病毒所有3个ORF表达产物功能均不明确,通过双杂技术研究病毒未知蛋白与宿主蛋白的互作,可以初步推断未知蛋白的功能。本实验旨在构建香蕉条斑病毒ORFⅠ和ORFⅡ在细菌双杂系统中的诱饵质粒。首先以课题组保存的连接有香蕉条斑病毒河口分离物全基因组的pMD-18T载体DNA为模板,经过PCR扩增,切胶回收,并通过与带有λcI基因的pBT载体共同双酶切及T4连接酶连接后,得到与λcI基因融合表达的重组载体pBT-ORF1和pBT-ORF2。转化大肠杆菌XL1-BlueMRF＇报告菌株,用IPTG（0.1mmol/L）诱导目的基因片段表达。Westernblotting结果表明,ORF1-λcI和ORF1-λcI两种融合蛋白均成功表达,且大小与预期一致。之后,pBT-ORF1及pBT-ORF2分别与空质粒pTRG共转化XL1-BlueMRF＇报告菌株,pBT空质粒和pTRG-Gal11p共转化作为阴性对照。结果显示pBT-ORF1及pBT-ORF2均无自激活现象,可以进行后续的细菌双杂工作。本实验为BSV与宿主的细菌双杂系统的建立及蛋白组学的研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒3D蛋白在T4噬菌体衣壳表面的展示

本文通过PCR技术获得3D基因,使用拼接重叠延伸聚合酶链反应对3D基因内部的EcoRⅠ位点进行定点突变,将突变后的3D基因克隆至原核表达质粒pSOC和T4噬菌体的穿梭质粒pR中,通过PCR及质粒酶切鉴定,分别获得阳性重组子pSOC-3D和pR-3D。将含有3D基因的重组质粒pSOC-3D质粒转化大肠杆菌BL21进行表达,SDS-PAGE检测表达产物。将含有3D基因的重组质粒pR-3D转化T4噬菌体的宿主菌E2,通过同源重组获得重组噬菌体T4-3D,经SDS-PAGE及Western- blot检测,证明展示在T4噬菌体表面的3D融合蛋白能与FMDV感染血清发生特异性反应。     

苏云金杆菌天门变种晶体蛋白基因的克隆和表达

用改进的Birnboim法检测了苏云金杆菌9个变种的质粒组成,其中我国分离到的天门变种有12条质粒带,用Southern杂交法证明,天门变种的δ-内毒素基因位于1个约60MD的质粒上。该质粒经BglⅡ酶切后与Bam HI酶切的pBR322载体连接,转化大肠杆菌HB101。通过菌落原位放射免疫反应和Southern杂交方法,筛选带有δ-内毒素基因并能在大肠杆菌中表达的转化体。对玉米螟幼虫进行生物测定表明,阳性克隆pTCC65及pTCC18有较强的抑制幼虫生长的作用。     

宏基因组文库中的组成型启动子在大肠杆菌中的克隆

启动子是决定基因表达水平的重要因素之一。组成型表达启动子被认为是工业上表达重要蛋白质的理想启动子。本研究利用蔗糖为唯一碳源的基本培养基对榨糖废水浸润的土壤微生物宏基因组文库进行筛选,获得两个阳性克隆。对其中一个克隆的柯斯质粒进行亚克隆,利用在线启动子预测和序列比对工具对其中一个亚克隆子进行分析,获得一个启动子序列。然后,利用PCR方法将该启动子和地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶基因一起克隆到T载体上。结果表明该启动子在不加诱导剂的条件下能够在大肠杆菌中启动外源基因的高效表达。本研究结果为在生物领域中组成型启动子的应用研究提供了基础。     

O型口蹄疫病毒VP1基因的高效可溶表达及抗原性分析

将猪源Ｏ型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)VP1基因克隆到原核表达载体pMBX上，成功地构建重组表达质粒pMBX-VP1。将其转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中，经SDS-PAGE分析，融合蛋白分子量约为58 kD，表达产物占菌体总蛋白的35.5％。 经蛋白可溶性分析，目的蛋白在裂解沉淀中占6.8％，在裂解上清中占31.2％，融合蛋白绝大部分是以可溶形式表达的。经Western blot证实，可溶表达的融合蛋白与FMDV阳性血清具有良好的免疫反应性。将可溶表达的融合蛋白用50%Ni-NTA树脂纯化，用融合蛋白作包被抗原，通过ELISA方法，能特异性地检测出口蹄疫阳性血清。     

抗对硫磷基因工程四价抗体在大肠杆菌中高效表达与鉴定

为提高抗对硫磷基因工程四价抗体在大肠杆菌中可溶性表达量,本研究利用克隆技术得到四价抗体基因sc-sa,将该融合基因连接至表达载体pTO-T7的Ω序列和T7启动子下游,构建成功的表达质粒导入大肠杆菌OrigamiB(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定表达产物,Ni亲和层析纯化蛋白,间接非竞争ELISA法测定该四价抗体的亲和力。结果表明在大肠杆菌OrigamiB(DE3)中表达分子量约为46kDa的四价抗体,0.1mmol/L的IPTG在30℃条件下诱导原核表达,外源蛋白占菌体总蛋白含量近50%,纯化后可溶性蛋白纯度在90%以上,ELISA结果显示该抗体与对硫磷结合呈阳性,抗体效价在1∶1×106以上,亲和常数为6.84×108L/mol。与母源抗体和相应单链抗体相比,利用pTO-T7载体四价抗体在大肠杆菌OrigamiB(DE3) 中可实现高效表达,且抗体效价和亲和力均得到进一步提高。     

人胰腺激肽释放酶cDNA的克隆、序列分析和原核表达

摘要: 为了研制人激肽释放酶（KLK1）特异单克隆抗体和进行重组酶的鉴定及纯化，根据已发表的人KLK1序列设计引物，用PCR扩增法从人胰腺单链cDNA库中特异地扩增出KLK1 cDNA。将其克隆入pGEM-T载体中,对5个重组质粒进行了序列测定，其中1个cDNA克隆的核苷酸序列与已发表的人肾/胰/唾液腺KLK1 cDNAs序列完全相同或有3个核苷酸差异。将去除信号肽序列的KLK1 cDNA以正确阅读框插入表达载体pGEX-4T-3,构建成重组质粒pGEX-KLK1。此重组质粒转化的E.coli 经IPTG诱导后表达分子量为48 kDGST-KLK1融合蛋白，表达产物主要以不溶性包涵体形式存在，可溶性部分能被Glutathione Sepharose 4B特异吸附，两者都能被GST特异单克隆抗体识别。用SDS-PAGE分离纯化的融合蛋白免疫小鼠，获得的抗血清的ELISA效价为1∶1600。结果表明，克隆的人KLK1 cDNA及其表达产物是正确的，可以用于人KLK1单克隆抗体的制备。