小麦PPO基因的分类及非同义cSNP对籽粒PPO活性的影响

小麦籽粒多酚氧化酶（PPO）活性是影响面团褐变的主要原因，检索NCBI网站上注册的小麦PPO基因并对其进行分类及相关变异的研究，对于弄清PPO基因与籽粒PPO活性的关系，开发分子标记选育出含有低PPO活性基因的品种，改良我国面制食品的外观品质有重要作用。本研究通过对NCBI上注册的小麦PPO基因序列的搜索与比对后发现，现有的小麦PPO基因按表达方式可分为两大类（I、II），其中第II大类的PPO基因与小麦籽粒PPO活性密切相关，第II大类第i小类中的PPO基因可能位于小麦2A、2D以外的染色体上，可做为改良面团色泽的侯选基因。通过对具有完整开放阅读框（ORF）的4条PPO基因比对后发现，位于小麦2D染色体长臂上的PPO基因（PPO-2D）存在丰富的等位变异，等位基因间有94个单核苷酸变异（SNP），其中发生在编码区的有80个（cSNP），这些cSNP中有36个影响到基因编码的氨基酸序列，属非同义cSNP。在非同义cSNP处，设计引物（STS-H），对130个已连续测得两年PPO活性的小麦品种进行PCR扩增，结果发现STS-H在大部分低PPO活性品种中没有扩增出目标片段（a），而大部分高PPO活性品种可以扩增出460bp的目标片段（b）。方差分析表明，a、b两种类型品种的PPO活性均值差异达极显著水平（p<0.01），说明非同义cSNP对小麦籽粒PPO活性有重要影响。与STS01（低PPO活性显性标记）比较后发现，STS-H与STS01是一对互补标记。为提高单显性分子标记的使用效率，根据STS01和STS-H引物各自的特点，研究了能同时扩增两对引物的多重PCR反应体系。     

俄引与黑龙江春小麦多酚氧化酶活性基因类型的比较

多酚氧化酶(PPO)活性与小麦面粉白度密切相关,为了从外引资源中筛选出更多优良基因型用于品种改良,本研究利用与PPO活性有关的2个遗传位点相连锁的3对STS分子标记,对250份引自俄罗斯和125份黑龙江主栽春小麦品种进行分析。结果显示,对于2AL染色体上的共显性STS标记PPO18而言,俄引品种中182份(72.8%)品种扩增出685 bp特异谱带,即高PPO活性的PPO-2Aa等位基因;68份(27.2%)品种扩增出876 bp特异条带,即低PPO活性的PPO-2Ab等位基因。黑龙江品种中76份(60.8%)品种扩增出685 bp特异谱带,45份(36%)品种扩增出876 bp特异谱带,4份(3.2%)品种未扩增出谱带。对于2DL染色体上的显性互补STS标记PPO16/PPO29而言,俄引品种有109份(43.6%)品种扩增出低PPO活性的PPO-2Da等位基因,141份品种(56.4%)扩增出高PPO活性的PPO-2Db等位基因;而黑龙江品种有60份(48%)品种扩增出低PPO活性的PPO-2Da基因型,65(52%)份品种扩增出高PPO活性的PPO-2Db基因型。2个位点不同等位基因组合共有5种,且在俄罗斯与黑龙江品种间存在不同程度的差别。其中,黑龙江品种中双低PPO活性等位基因组合PPO-2Ab/PPO-2Da较俄罗斯的多5.6%。研究结果为俄引资源用于黑龙江小麦品种改良提供了分子遗传学信息。     

低酚酶活性选择对小麦穗发芽的影响

为探讨小麦抗穗发芽育种新方法,本研究对10个小麦品种(系)连续3代进行了低PPO活性选择,对40份后代品系的整籽粒PPO活性、酚含量、吸水率、穗发芽率以及种皮、胚、胚乳的PPO活性和酚含量进行了测定.结果表明,10个小麦品种(系)的PPO活性随定向选择世代的增加逐渐降低,穗发芽率也逐渐降低,证明了酚酶活性与小麦穗发芽抗性密切相关.选择代数与整籽粒PPO活性、吸水率、穗发芽率、种皮PPO活性、胚PPO活性、胚乳PPO活性呈显著负相关;整籽粒PPO活性、吸水率、穗发芽率、种皮PPO活性、胚PPO活性、胚乳PPO活性相互之间呈正相关;选择代数与整籽粒酚含量、种皮酚含量、胚酚含量、胚乳酚含量无相关性.本研究可为培育抗穗发芽小麦新品种提供依据.     

应用牙釉蛋白(AML)基因鉴别牛早期胚胎性别

牛牙釉蛋白（AML）基因定位于牛X染色体和Y染色体上的同源区域.实验根据牛X、Y染色体AML基因第五内含子上序列同源性只有45.1%以及X、Y染色体该区段之间存在多处碱基缺失的特点,合成了1对性别特异性引物.该引物经扩增后母牛只得到1条467 bp的来自X染色体的扩增条带,而公牛能得到1条源自X染色体的467bp片段的扩增条带和1条源自Y染色体的341 bp的扩增条带.经基因组DNA验证,该引物的公母鉴定准确率为100%,同时该对引物具有高度的牛特异性.定量分析AML基因引物的反应灵敏度,发现1次PCR（30个循环）能扩增出0.5ng的基因组DNA,2次PCR（共50个循环）能扩增出20pg的基因组DNA.将AML基因引物与SRY基因引物的反应灵敏度相比较,结果表明前者的灵敏度比后者的高8～10倍.用AML基因反应体系鉴定了26枚优质胚胎,其中24枚有扩增结果,13枚鉴定为公牛,11枚鉴定为母牛.     

合成六倍体小麦与其亲本在合成后小麦A/B染色体组微卫星位点的比较

构建人工合成六倍体小麦是利用小麦近缘材料优异基因的很有效的方法。但是目前在人工合成异源六倍小麦的过程中对微卫星位点的影响研究尚不完善。本研究直接比较了亲本四倍体小麦PS5与4个不同粗山羊草进行远缘杂交并经染色体自然加倍后获得4个人工合成六倍体小麦前后,位于普通小麦A/B染色体组不同染色体臂上的104对引物的变化。结果表明,104对微卫星引物的扩增产物在4个合成六倍体小麦中具有与普通小麦相同的带型;但在22对引物的扩增产物上存在差异,其中Am4与其它3个六倍体小麦Am1,Am2,Am3在15对引物扩增的条带存在差异;另外发现有45对特异与AB染色体的引物能够在粗山羊草中扩增出产物,其中特异于B染色体组的引物47.54%的可以在粗山羊草中扩增出产物,而A染色体组的引物占38.24%。因此,基于普通小麦开发的微卫星引物可以用于合成六倍体小麦的研究,而Am4材料与其它3个合成二倍体小麦的差异尚需进一步研究,另外我们推测普通小麦的B染色体组与A染色体组相比与粗山羊草存在较近的亲缘关系。     

小麦AB基因组中一个重复序列的分离、定位与应用

利用102对微卫星引物对5份黑麦（Secale）、4份普通小麦（Triticum aestivum）和1份分枝小黑麦（Triticale）进行SSR分析,引物Xgwm614能在分枝小黑麦中扩增出一个387bp的特异DNA片段（记为FZ387,GenBank登录号为EF179137）,而黑麦未能扩增出。序列比对结果显示该片段与一粒小麦（T. monococcum）（AY485644）和栽培二粒小麦（T. turgidum）（AY494981）A基因组中Gypsy Ty3-LTR反转座子fatima的一部分分别有94%和95%同源性。根据序列同源性比对结果,在FZ387内部设计1对特异引物FaF和FaR。引物Xgwm614F和FaR能在含有A基因组的物种中扩增出约350bp的条带（记为A350）,而其不含A基因组的物种都未扩增出该条带。利用小麦二体和端体代换系材料对其进行定位,结果显示该片段分布在所有A染色体的长臂和断臂上。此外,引物FaF和Xgwm614R能在含有A、B或AB基因组的物种中扩增出约350bp的条带（记为AB350）,而不含AB基因组的材料未扩增出目标条带。利用这两对特异引物对小麦属近缘物种进行PCR扩增,发现只有中国春能够扩增出A350和AB350。序列比对结果和FZ387两侧SSR引物结合区的规律性变化表明该反转座子在进化上可能存在属间多样性和属内相似性。A350和AB350也可以分别作为分子标记检测A染色体和AB染色体。     

小麦粒重相关基因TaCYP78A16的克隆和CAPS标记开发

粒重是小麦(Triticum aestivum)产量的重要构成要素,为了开发小麦粒重性状相关的功能标记,本研究通过小麦全基因组预测并克隆得到1个潜在粒重相关基因:小麦细胞色素P450单加氧酶基因(Triticum aestivum cytochrome P450 78A16, TaCYP78A16; GenBank No. MH572527),并对其进行基因结构、表达模式、等位变异分析和粒重性状相关功能标记开发。结果表明,TaCYP78A16基因在小麦幼穗和籽粒发育初期高表达,可能参与籽粒发育、影响粒重;对30个小麦品种中TaCYP78A16基因编码区和启动子等位变异进行分析,发现仅TaCYP78A16-A启动子16Ap检测到7个位点的等位变异;根据7个等位变异中的2个SNP位点(SNP2, SNP3)开发了单核苷酸多态性-酶切扩增多态性序列(single nucleotide polymorphisms-cleaved amplified polymorphic sequences, SNP-CAPS)分子标记CAPS-16Ap,该分子标记可将30个小麦品种16Ap序列分成3种基因型:16Ap-Hap1、16Ap-Hap2和16Ap-Hap3;进一步在323个小麦品种中进行验证,结果显示,CAPS-16Ap标记可用于小麦16Ap序列3种基因型的鉴定。本研究将有助于小麦分子标记辅助选择育种。     

小麦显性多子房基因的RAPD标记

利用BSA法，以显性多子房小麦（rriticum aestivum）与普通小麦（T.aestivum）品种西农1376进行杂交，从F2分离世代建立多子房性状基因池和单子房基因池，采用RAPD-PCR方法，以440个随机引物筛选单、多子房的混合群体及其双亲。发现10个引物的扩增产物在近等基因系间表现出特异性，表现为多子房亲本及其混合群体有带，单子房亲本及其混合群体无带；6个引物扩增产物表现出的特异性相反，单子房有带，多子房无带。经过重复实验和群体单株验证，引物S236在多子房亲本、混合群体及其群体单株中都表现出稳定的多态性，可以作为多子房显性基因的分子标记。     

不同品种小麦籽粒中戊聚糖含量分析

从全国小麦主产区收集弱筋小麦品种19份、强筋品种24份,对小麦籽粒中的戊聚糖含量以及籽粒基本品质特性进行了测定与统计分析。结果显示,不同类型与品种的小麦籽粒中总戊聚糖(TP)和水溶性戊聚糖(WSP)含量存在极显著差异（P<0.01）;强筋小麦的TP和水不溶性戊聚糖（WUP）平均值较弱筋小麦的偏高,但二者的WSP平均值基本一致。对籽粒的戊聚糖含量与其品质特性进行相关性分析发现,强筋小麦籽粒的WSP含量与籽粒蛋白质含量、湿面筋含量、zel沉降值、面团稳定时间存在正相关关系;弱筋小麦籽粒WSP含量与籽粒蛋白质含量、湿面筋含量、硬度、zel沉降值、形成时间存在负相关关系。通径分析结果显示,蛋白质与湿面筋含量对戊聚糖含量的影响更为显著。由本研究得出结论,强筋与弱筋类型小麦的品质指标对戊聚糖含量的影响有明显不同,建议未来戊聚糖的研究按小麦类型区别对待。     

绵羊骨形态发生蛋白受体IB（BMPR-IB）基因部分3′非翻译区的多态性分析

根据绵羊骨形态发生蛋白受体IB（bone morphogenetic protein receptor IB,BMPR-IB）基因部分调控区的mRNA序列设计3对引物,采用PCR-SSCP技术检测BMPR-IB基因部分3′非翻译区序列在绵羊（Ovis aries）高繁殖力品种（小尾寒羊和湖羊）和低繁殖力品种（特克塞尔和中国美利奴绵羊）中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊和湖羊高繁殖力的影响。结果发现,引物P1扩增片段存在多态性,其余2对引物的扩增片段均不存在多态性。对于引物P1,只在湖羊中发现AA和BB两种基因型,其余3个品种均为AA型;测序表明BB型与AA型相比有2个碱基突变（121T→C和195T→C）;湖羊AA和BB基因型频率分别为0.575和0.425,湖羊AA和BB基因型之间产羔数的最小二乘均值差异不显著（P〉0.05）。研究结果初步表明,检测的BMPR-IB基因位点对小尾寒羊和湖羊高繁殖力都没有显著影响。     

Latent and active polyphenol oxidase (PPO) in red clover (Trifolium pratense) and use of a low PPO mutant to study the role of PPO in proteolysis reduction

Polyphenol oxidase (PPO) activity in leaf extracts of wild type (WT) red clover and a mutant line expressing greatly reduced levels of PPO (LP red clover) has been characterized. Both latent and active forms of PPO were present, with the latent being the predominant form. PPO enzyme and substrate (phaselic acid) levels fluctuated over a growing season and were not correlated. Protease activation of latent PPO was demonstrated; however, the rate was too low to have an immediate effect following extraction. A novel, more rapid PPO activation mechanism by the enzyme's own substrate was identified. Rates of protein breakdown and amino acid release were significantly higher in LP red clover extracts compared with WT extracts, with 20 versus 6% breakdown of total protein and 1.9 versus 0.4 mg/g FW of free amino acids released over 24 h, respectively. Inclusion of ascorbic acid increased the extent of protein breakdown. Free phenol content decreased during a 24 h incubation of WT red clover extracts, whereas protein-bound phenol increased and high molecular weight protein species were formed. Inhibition of proteolysis occurred during wilting and ensilage of WT compared with LP forage (1.9 vs 5 and 17 vs 21 g/kg of DM free amino acids for 24 h wilted forage and 90 day silage, respectively). This study shows that whereas constitutive red clover PPO occurs predominantly in the latent form, this fraction can contribute to reducing protein breakdown in crude extracts and during ensilage.     

砀山梨果多酚氧化酶活性的分析

为探讨梨果多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性变化规律,本研究选取贡梨、酸梨、紫酥梨、香梨、酥梨和皇冠梨6个不同品种的砀山梨果作为实验材料,采用分光光度计法分别测定了梨果的皮、肉和心的多酚氧化酶活性,并对其进行分析。结果表明,紫酥梨皮、香梨肉和香梨心PPO活性最高,分别为19.72AU·g-1·min-1、19.51AU·g-1·min-1和19.30AU·g-1·min-1,酸梨皮、酸梨肉以及皇冠梨心的PPO活性最低,分别只有11.64AU·g-1·min-1、13.39AU·g-1·min-1和6.67AU·g-1·min-1。PPO活性变异及方差分析显示,梨皮PPO活性平均值最高为16.27AU·g-1·min-1,梨心PPO活性平均值最低为13.68AU·g-1·min-1;不同品种梨皮、梨肉、梨心PPO活性变化不一致;不同部位中梨心的PPO活性变异系数最大,达32.23%;不同部位及品种间PPO活性差异不显著。由此可知梨皮可以作为梨果PPO活性改良的目标之一,梨心具有筛选低PPO活性的潜力,皇冠梨梨心可作为选育低PPO活性的种质资源。     

Proteolytic activation of latent Paraguaya peach PPO. Characterization of monophenolase activity

The kinetics of the activation process of latent peach PPO by trypsin was studied. By coupling this activation process to the oxidation of 4-tert-butylcatechol (TBC) to its corresponding quinone, it was possible to evaluate the specific rate constant of active PPO formation, k(3), which showed a value of 0.04 s(-1). This proteolytic activation of latent peach PPO permitted us to characterize the monophenolase activity of peach PPO for the first time using p-cresol as substrate, and it showed the characteristic lag period of the kinetic mechanism of monophenols hydroxylation, which depended on the enzyme and substrate concentration, the pH and the presence of catalytic amounts of o-diphenol (4-methylcatechol). The enzyme activation constant, k(act), was 2 microM.     

Consistency of polyphenol oxidase (PPO) thermostability in ripening apricots (Prunus armeniaca L.): evidence for the presence of thermostable PPO forming and destabilizing mechanisms in apricots

Destabilization of thermostable polyphenol oxidase (TS-PPO) during the ripening of peaches has been previously shown (Yemenicio?lu, A.; Cemero?lu, B. Tr. J. Agric. For. 1998, 22, 261-265). This work studied the effect of ripening on thermal stability of apricot PPO for three different cultivars. Kabaa?i cultivar contained thermolabile PPO, whereas TS-PPO appeared in Hacihalilo?lu and Catalo?lu cultivars. The TS-PPO showed biphasic inactivation curves, and its D and z values between 60 and 90 degrees C varied in the ranges of 357-1.12 min and 11.9-12.7 degrees C, respectively. In Hacihalilo?lu cultivar the TS-PPO was very consistent and existed at all stages of ripening, whereas in Catalo?lu cultivar it appeared only at the half-ripe stage. The loss of consistent TS-PPO in Hacihalilo?lu apricots after partial purification by acetone precipitation and DEAE-cellulose chromatography suggested the non-covalent nature of its stabilization. The main purified fractions (F1 and F2) showed monophasic inactivation curves with similar thermal inactivation parameters (z(F1) = 10.4 degrees C, z(F2) = 10.1 degrees C). However, their kinetic properties against catechol (K(mF1) = 61 mM, K(mF2) = 122.7 mM) and substrate specificities were considerably different. The results of this study showed the presence of TS-PPO forming and destabilizing mechanisms in apricots. Further studies are needed for the solution of these mechanisms and to develop some new strategies that may be utilized by molecular techniques for a planned production of apricot cultivars provided with heat labile but normal PPO activity.     

柿叶提取物对马铃薯多酚氧化酶的抑制作用

多酚氧化酶（PPO）是生物体内黑色素合成的关键酶。研究了甜柿叶乙醇提取物、涩柿叶乙醇提取物、甜柿叶水提取物、涩柿叶水提取物对马铃薯多酚氧化酶活性的抑制作用。结果表明,上述4种柿叶提取物对马铃薯多酚氧化酶具有明显的抑制作用,使该酶活力下降50％所需的浓度（IG50）分别为0．21、0．26、0．37、0．45mg／mL。乙醇提取物较水提取物的作用效果更强,甜柿叶提取物的抑制作用比涩柿叶提取物的强,4种柿叶提取物对酶的抑制作用均为非竞争性可逆抑制,其抑制常数（KI=KIS）分别为0．18、0．23、0．34、0．45mg／mL。     

不同基质接种丛枝菌根真菌对番茄生长及PAL、PPO酶活的影响

以番茄为试材,研究常用的几种基质:大田土,有机土,蛭石和草碳混合物接种丛枝菌根真菌(AM F)中的G lom usm osseae(G.m)对番茄生长及PAL、PP 0酶活性的影响。结果表明:接种G.m对番茄株高和茎粗均有显著的促生效应,G.m在蛭石 草碳处理中对番茄的促生效果最好,总干物重比对照增加131%,不同基质极显著地影响了G.m侵染和扩展,有机土中G.m的侵染率最高。接种35 d,50 d,65 d PAL,PPO酶活均呈现由高到低的趋势,但不同基质间PAL,PPO酶活随侵染率的不同呈现显著差异。     

不同基质接种丛枝菌根真菌对番茄生长及PAL、PPO酶活的影响

以番茄为试材，研究常用的几种基质：大田土，有机土，蛭石和草碳混合物接种丛枝菌根真菌(AMF)中的Glomus mosseae(G.m)对番茄生长及PAL、PP0酶活性的影响。结果表明：接种G.m对番茄株高和茎粗均有显著的促生效应，G.m在蛭石+草碳处理中对番茄的促生效果最好，总干物重比对照增加131%, 不同基质极显著地影响了G.m侵染和扩展，有机土中G.m的侵染率最高。接种35 d，50 d，65 d PAL,PPO酶活均呈现由高到低的趋势，但不同基质间PAL,PPO酶活随侵染率的不同呈现显著差异。     

莲藕多酚氧化酶基因(PPO)的克隆与表达分析

为获得莲藕中多酚氧化酶(Ppo)基因序列信息及其表达情况,运用PACE技术从莲藕(Nelumbonucifera Gaertn.ssp.nucifera)茎尖中克隆到多酚氧化酶基因全长序列,其cDNA全长2 074 bp,完整的编码框为1 503 bp,编码501个氨基酸,5’端有160 bp非编码区,3’端有411bp非编码区(GenBank登陆号为HQ380894).采用生物信息学方法发现该蛋白分子量约为56.8 kD,pI为8.60,具典型的酪氨酸家族结构域,无信号肽结构,但有跨膜螺旋的亲水性蛋白,a-螺旋和β-折叠分散于整个多肽链中.半定量RT-PCR结果显示,该基因在莲藕茎尖、幼叶、莲藕鲜切片、花瓣、茎杆5种组织中均有表达.方差分析表明,茎尖中PPO表达量与幼叶差异不显著,但显著高于其余三个部位;幼叶中表达量与莲藕鲜切片之间差异不显著,但显著高于花瓣和茎杆;花瓣和茎杆中PPO表达量最低,两者无显著差异.上述结果说明作为重要分生组织的莲藕茎尖产生的PPO可能不具活性或极不稳定,随着植株的生长发育被分配到各组织中,在特定时空下被激活并担负相应的职责功能.