高赖氨酸蛋白基因SBgLR的克隆及其对提高玉米种子中蛋白质和赖氨酸含量的作用

从马铃薯(Solarium tuberosum L．)中克隆的SBgLR基因由3个外显子和2个内含子组成，编码211个氨基酸，其赖氨酸重量比为18．93％，是一个天然存在的高赖氨酸蛋白基因。构建了两个含SBgLR基因组DNA的植物表达载体，用基因枪转化法将其导入玉米(Zea mays L．)的胚性愈伤组织，经PCR、点杂交和Southern blot检测，表明外源基因已整合到玉米的基因组中，并稳定地遗传至下一代。通过检测R1转基因玉米种子的蛋白质和赖氨酸含量发现，96．7％的植株蛋白质的含量都提高，提高幅度为5．4％～58．1％；93．3％的植株赖氨酸含量也有提高，提高幅度为3．2％～54．8％。R2植株种子中97．2％的植株蛋白质和赖氨酸含量都有提高，提高幅度分别为19．2％～55．1％和3．2％～51．6％，得到6个蛋白质和赖氨酸均提高30％以上的株系。实验结果表明SBgLR基因可以提高玉米种子中的蛋白质和赖氨酸含量。     

高赖氨到基因导入玉米自交系的研究

通过对18个玉米自交系的组织培养，筛选到8个可以正常分化的自交系。用基因枪的方法对其中的4个自交系进行了遗传转化，将高赖氨酸基因导入玉米的胚性愈伤组织，以减少潮霉素筛选次数和筛选浓度的方法，得到分化再生植株，经分子检测，证明外源基因已成功整合到玉米基因组中。部分T0代植株正常结实，通过对T1代植株的分子检测，表明外源基因可以稳定遗传，对其中的转化植株所结的种子进行了赖氨酸含量的检测，发现赖氨酸含量最高提高了16％。     

经高赖氨酸基因导入玉米自交系的研究

通过对18个玉米自交系的组织培养,筛选到8个可以正常分化的自交系.用基因枪的方法对其中的4个自交系进行了遗传转化,将高赖氨酸基因导入玉米的胚性愈伤组织.以减少潮霉素筛选次数和筛选浓度的方法,得到分化再生植株.经分子检测,证明外源基因已成功整合到玉米基因组中.部分T0代植株正常结实,通过对T1代植株的分子检测,表明外源基因可以稳定遗传.对其中的转化植株所结的种子进行了赖氨酸含量的检测,发现赖氨酸含量最高提高了16%.     

用基因枪将高赖氨酸基因导入玉米及转基因植株的检测

构建了两个含高赖氨酸蛋白质基因ｃＤＮＡ的表达载体,用基因枪法将其导入玉米不同杂交组合的胚性愈伤组织,经潮霉素抗性筛选,得到了可育的再生植株,经ＰＣＲ扩增分析。点杂交,及Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交检测,表明该基因已整合到玉米的基因组中。测定１３株Ｔ１代种子中赖氨酸的含量,其中有３株赖氨酸含量提高１０％以上。     

转兔防御素基因（NP-1）玉米植株的获得及其抗病性分析*

首次报道了采用基因枪法将兔防御素基因(NP-1)导入玉米(Zea mays L．)不同杂交组合胚性愈伤组织中获得了T0再生植株。分别通过PCR和DNA点杂交证实．NP-1基因已经整合到部分T0代玉米基因组中。PCR和Southern杂交证实NP-1基因已经稳定遗传至部分T1代玉米植株中。RNA点杂交结果表明部分T1代转基因玉米中NP-1基因能够进行正常转录。在Tl代玉米5～7叶期接种玉米大斑病菌(Helminthosporium turcicum Pass)0号生理小种，发现转兔防御素基因玉米能有效抵抗玉米大斑病的侵袭。     

转基因水稻中ThEn-42基因的稳定遗传及其抗病性的提高*

用农杆菌介导法将CaMV35S启动子调控下的外源基因ThEn-42转入粳稻(Oryza sativa ssp．japonica)品种台北309中。对100多株再生植株进行了PCR鉴定，结果表明，90％以上的植株为阳性植株。Southern检测的结果进一步证实，外源基因已经整合到水稻基因组中。对T1代植株也进行了PCR鉴定和潮霉素抗性鉴定，结果表明，大约70％的T1代转基因株系符合3：1(阳性：阴性)的分离比，表明ThEn-42基因在这些株系中有单个插入位点；大约20％的T1代株系分离比符合15：1，表明这些株系含有2个整合位点。选择部分T1代潮霉素抗性植株进行Southern杂交鉴定，结果证实，外源基因已经稳定遗传给T1代。检测了T0代和T1代转基因植株对水稻纹枯病(Rhizoctonia solani)和两个分别属于A群和B群的稻瘟病(Magnapotthe grisea)小种的抗性，结果表明，30%株系表现了对这两种病害抗性水平不同程度的提高。有7个株系的抗性与对照相比有显著的提高，其中Tp64表现对两个稻瘟病小种完全免疫。这些结果表明内切几丁质酶基因ThEn-42已经在受体植物中准确表达，并且在提高水稻抗病性方面起了重要作用。     

改变天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶调控活性提高玉米中游离赖氨酸含量

以烟草(Nicotiana tabacum var．samsum)叶片为材料，提取RNA，分离mRNA，进行RT-PCR扩增编码二氢吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)的cDNA片段。序列分析表明，得到971个核苷酸的片段。与发表的序列相比，成熟蛋白N-端编码区缺失了21个核苷酸，且第627位核苷酸发生了C到T的改变，但没有引起氨基酸的变化。将ahaps cDNA编码区的第410和411位核苷酸由AC突变为TT，这一突变使DHDPS成熟蛋白的第104位氨基酸由天冬酰胺变为异亮氨酸。以玉米(Zea mays L．)总DNA为模板，PCR扩增DHDPS叶绿体转运肽的编码序列，序列分析结果显示，扩增片段中含有DHDPS转运肽完整编码区162个核苷酸及成熟蛋白N-端编码区21个核苷酸。将突变后的础(天冬氨酸激酶)基因和dhdps cDNA与CaMV35S启动子、转运肽序列及潮霉素抗性基因连接，构建表达载体pRHAK和pRHDH，用基因枪轰击法将pRHAK和pRTDH转入玉米胚性愈伤组织，得到再生植株。经分子检测证明，目的片段已整合到玉米基因组中。T1代植株的游离氨基酸含量测定显示，部分转入础基因的植株中，叶片和种子中游离苏氨酸的含量提高3～5倍。部分转入dhdps cDNA的植株中，叶片和种子中游离赖氨酸含量分别提高了4倍和1倍。     

抗除草剂基因导入早稻（Oryza sativa）栽培品种

以生产上优良旱稻(Oryza sativa L．)新品种旱稻297、旱稻10号等的幼胚愈伤组织为转化受体材料,用基因枪法把抗Basta除草剂的bar基因导入了这些品种的愈伤组织,经两轮Basta抗性筛选和分化获得了再生植株,对再生植株进行PCR扩增和Southern杂交检测,T0和T1代Basta抗性实验表明,bar基因已整合到旱稻的基因组DNA中,并在T1代继续表达。对各品种幼胚培养的诱导、分化培养基实验表明,MB和MS培养基可作为这5个品种的愈伤组织诱导培养基,改良的RMB2、RMS2培养基可显著地提高愈伤组织的分化频率。实验所获得的转基因植株和建立的遗传转化系统。为早稻的抗除草剂分子育种和其它基因转化奠定了初步的基础。     

抗除草剂基因导入旱稻（Oryza sativa）栽培品种

摘要：以生产上优良旱稻（Oryza sativa L. ）新品种旱稻297、旱稻10号等的幼胚愈伤组织为转化受体材料，用基因枪法把抗Basta除草剂的bar基因导入了这些品种的愈伤组织，经两轮Basta抗性筛选和分化获得了再生植株，对再生植株进行PCR扩增和Southern杂交检测，T0和T1代Basta抗性实验表明，bar基因已整合到旱稻的基因组DNA中，并在T1代继续表达。对各品种幼胚培养的诱导、分化培养基实验表明，MB和MS培养基可作为这5个品种的愈伤组织诱导培养基，改良的RMB2、RMS2培养基可显著地提高愈伤组织的分化频率。实验所获得的转基因植株和建立的遗传转化系统，为旱稻的抗除草剂分子育种和其它基因转化奠定了初步的基础。     

无载体框架结构的大豆铁蛋白线性表达盒提高小麦籽粒铁含量的研究

培育和推广铁强化型小麦品种对于经济有效地解决贫困人口的铁营养不良问题具有重要意义。本研究通过 RT-PCR 得到了大豆(Glycine max)铁蛋白基因,构建了无载体框架的大豆铁蛋白线性表达盒(即小麦籽粒特异的高分子量谷蛋白亚基 1Dx5 的启动子 - 大豆铁蛋白基因 -NOS 终止子酶切片段);用基因枪法转化"京花 1 号"小麦(Triticum aestivum)幼胚愈伤组织,经草胺膦筛选和分化后,得到 276 株转基因T0植株,通过 PCR 筛选出阳性植株 65 株;RT-PCR 检测发现 29 个株系的大豆铁蛋白基因在灌浆期籽粒中表达;与对照相比,对 8031 个 T1代株系所结的 T2代籽粒进行了铁含量测定,有 265 个株系成熟籽粒的铁含量均比对照有不同幅度提高,增幅在 4.93%~64.03%之间,其中 22 个株系的籽粒铁含量显著或极显著提高。结果提示,利用无载体框架的大豆铁蛋白线性表达盒可以有效地培育出籽粒铁含量显著提高的转基因小麦。     

番茄GRX基因家族的鉴定及表达分析

GRX基因家族是从原核生物到真核生物中普遍存在的一类巯基-二硫键氧化还原酶,在植物的生长发育、器官构建及逆境胁迫和激素信号应答中均发挥重要作用.本研究在番茄基因组范围内,利用生物信息学方法对番茄的GRX基因组家族的成员、分布及结构和功能等进行分析.预测结果显示,番茄GRX家族包含55个蛋白质,分为4个亚族,其中植物特有的CC亚族成员最多,有35个,其他GRX基因成员与拟南芥GRX家族具有相似分类.在番茄GRX结构域中包含12个重要的基序,主要分布在序列的N端,相同亚族中的GRX成员蛋白序列的氨基酸保守域构成基本一致,且各亚族成员的氨基酸保守域组成特异,表明这些基序的存在对GRX蛋白功能的执行是必需的.利用实时荧光定量PCR对番茄GRX基因的组织表达和胁迫响应分析,结果表明,GRX基因具有组织特异性表达差异,CC型在根和花中表达较高,在果实中表达较低;在盐、SA、ABA、高温和低温胁迫条件下,22个番茄GRX基因的表达模式被阐明;其中部分基因的表达水平被显著地诱导增加或者降低,很可能参与了调控番茄逆境胁迫条件下的防御应答反应.本研究结果将为番茄GRX家族基因的深入研究提供依据,为进一步解析GRX基因功能奠定基础.     

苹果α-法尼烯合酶基因的启动子序列及同源基因

本文通过设计引物进行PCR扩增α-法尼烯合酶(AFS)基因的5'端区段并测序,获得510bp的‘国光’苹果AFS基因启动子和5'端非翻译区(5'UTR)序列,已在GenBank注册(登录号FJ263961)。序列分析结果表明,该序列具有典型的启动子特征,在转录起始点上游-46bp处有一个TATA盒,-93bp处有一个CAAT盒,-84bp处有一个W盒和-436bp处有一个热胁迫反应顺式作用元件GAAATTTTTT。与‘皇家嘎拉’苹果的AFS基因启动子序列(GenBank登录号AY786553.1)比对,本研究发现‘国光’苹果AFS基因启动子序列中有6个碱基(-186T,-207T,-283C,-301A,-413A和-433A)发生变异,‘皇家嘎拉’苹果AFS基因启动子序列相应位置的碱基分别为碱基缺失、-206C、-282G、-300G、-412G和-432G。重要的是,其中‘国光’苹果-413A碱基变异为G发生在一个热胁迫反应顺式作用元件GAAATTTTTT中,苹果虎皮病发生和AFS基因的转录表达是否受到这一碱基变异的影响值得进一步探讨。本研究结果还表明,在苹果AFS基因启动子和5'UTR序列中存在一个正向...     

植物基因定点突变与定点置换技术及其在作物遗传改良中的应用

随着大量植物基因组测序工作的完成及EST数据库的充实，利用基因定点突变与定点置换技术精细的研究基因功能是功能基因组学研究的重要手段。同时，基因定点突变与定点置换技术可以克服现有转基因技术的基因沉默和位置效应等诸多缺陷，在植物遗传改良方面具有重要的意义。基因定点突变与定点置换技术在酵母和小鼠胚胎干细胞中已经比较成熟，但在高等植物中同源重组频率非常低，限制了其使用。新近研究发现，利用锌指核酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）引入DNA分子的定点断裂（double-strand breaks, DSBs）可以高效介导基因的同源重组，使得ZFN成为遗传工程的一个研究热点。利用嵌合寡核苷酸(Chimeric oligonucleotides)可以介导基因的单碱基定点突变，在植物遗传改良上有广阔的应用前景。对同源重组相关的调控途径进行基因修饰也可以提高植物的基因打靶效率。植物基因定点突变与定点置换技术难题的攻克，必将加快植物功能基因组研究的步伐，同时给植物基因工程育种带来新的革命。     

壳聚糖酶基因的克隆与序列分析

本研究采用一对引物从巨大芽孢杆菌BS-0409中成功地克隆了壳聚糖酶基因（Csn） 全基因序列,大小为516bp,将其在NCBI网站上用BLAST程序进行在线检索分析,结果与多种芽孢杆菌同源性均为96%。同时,利用DNAMAN软件比较巨大芽孢杆菌BS-0409与其它13种不同细菌Csn编码基因的氨基酸序列,结果显示不同细菌Csn氨基酸序列之间有比较高的同源性,且与多种芽孢杆菌具有较高的同源性。     

基因融合技术及其应用

基因融合技术以其快捷、高效生产多功能蛋白的优势，近年来在生物学领域中得到了愈来愈广泛的应用，结合本实验室的相关研究，简要综述基因融合技术、影响基因融合的主要因素以及融合基因的主要应用。     

优化的VHb基因和融合杀虫基因在烟草中的表达研究

将人工合成的、密码子优化后的透明颤菌血红蛋白（VHb）基因与含有融合杀虫基因（GFMcryIA基因和CPTI基因的融合）表达载体PGBIF4ABC构建成双价基因植物高效表达载体PGBIF4ABCVHB，通过根癌农杆菌介导转化烟草，获得了38株卡那霉素抗性转基因株，经PCR及Southern blotting检测，证实了双价基因在32株转基因烟草基因组中整合。western blot检测证实了VHb基因的表达,杀虫实验表明融合杀虫基因表达出的毒蛋白具有杀虫活性，转基因烟草平均每株干重高于非转基因烟草植株8％。实验结果表明：VHb基因和融合杀虫基因烟草在烟草中的表达既可使烟草既可增产、又具抗虫性。     

基因芯片技术在植物基因克隆中的应用研究进展

基因芯片是以预先设计的方式将大量的生物讯息密码（寡核苷酸、cDNA、基因组DNA等）固定在玻片、硅片等固相载体上组成的密集分子阵列。基因芯片技术本质是生物信号的平行分析,它利用核酸分子杂交原理,通过荧光标记技术检测杂交亲和与否,再经过计算机分析处理可迅速获得所需信息。由于其具有高通量、微型化、连续化、自动化、快速和准确等特点,已引起国际国内广泛的关注和重视,在许多领域得到了广泛的应用。本文简述了基因芯片的概念,技术特点及主要分类,着重对其在基因表达水平检测,基因突变和多态性的分析,基因组DNA分析,后基因组学研究以及转基因农作物检测等方面进行阐述,并说明其存在的问题及展望。     

嗜水气单胞菌粘附素和外膜蛋白A基因克隆与结构预测

采用PCR方法扩增嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）外膜蛋白相关基因,即粘附素（Aha）、外膜蛋白A（OmpA）基因全长序列,进行DNA测序及生物信息学分析。结果表明：Aha基因长1 314 bp,推导编码355 aa,5～24 aa区域为跨膜螺旋,26～355 aa区域为革兰氏阴性菌孔蛋白结构域（PF00267）,Aha蛋白三级结构与模板（PDB：1PHO_A）相似性达28.21%;OmpA基因长1 102 bp,推导编码338 aa,含有OmpA跨膜结构域（PF01389）和OmpA结构域（PF00691）,预测OmpA蛋白抗原表位位于64～69 aa、160～171 aa、244～249 aa、259～274 aa和295～301 aa区域,OmpA蛋白三级结构OmpA跨膜结构域和OmpA结构域与模板（PDB：1BXW_A,PDB：4ERH_A）相似性分别为27.45%和57.58%;进一步采用拉马钱德兰图（Ramachandran plot）检测分析,与Aha、OmpA基因蛋白三级结构预测结果一致。本研究有助于理解嗜水气单胞菌致病的分子机制,为鱼类疾病防治及疫苗应用提供科学参考。     

Estimation and Testing of Gene Expression Heterosis

Heterosis, also known as the hybrid vigor, occurs when the mean phenotype of hybrid offspring is superior to that of its two inbred parents. The heterosis phenomenon is extensively utilized in agriculture though the molecular basis is still unknown. In an effort to understand phenotypic heterosis at the molecular level, researchers have begun to compare expression levels of thousands of genes between parental inbred lines and their hybrid offspring to search for evidence of gene expression heterosis. Standard statistical approaches for separately analyzing expression data for each gene can produce biased and highly variable estimates and unreliable tests of heterosis. To address these shortcomings, we develop a hierarchical model to borrow information across genes. Using our modeling framework, we derive empirical Bayes estimators and an inference strategy to identify gene expression heterosis. Simulation results show that our proposed method outperforms the more traditional strategy used to detect gene expression heterosis. This article has supplementary material online.     

TMV-L运动蛋白基因植物表达载体的构建及其与番茄Tm-22基因的互作

对含有烟草花叶病毒番茄株系(TMV-L)部分基因组cDNA的克隆进行缺失改造,得到了含有TMV-L运动蛋白(MP)基因的克隆.MP片段分别与组成型启动子CaMV35S和病原特异诱导型启动子CHS、PiⅡ和BG体外重组,构建成植物表达载体p35S-30K,pCHS-30K,pPiⅡ-30K和pBG-30K.通过农杆菌LBA4404介导,分别转化含Tm-22抗性基因的番茄品种Geneva 80.转化p35S-30K的基因工程植株在苗期观察到了部分坏死和黄化现象,初步证明TMV-L MP与Tm-22存在基因对基因的互作关系.诱导型启动子控制下的MP转基因番茄已得到部分潮霉素抗性愈伤组织,为进一步获得广谱高效抗病植株奠定了基础.